Abstract
Bakgrunn
telomere /telomerase systemet har nylig blitt anerkjent som en attraktiv målrette for kreftbehandling. Telomerase hemming resultater i tumor regresjon og økt følsomhet for ulike cytotoksiske legemidler. Men det har ikke blitt fullt etablert ennå om den formidler av disse effektene er telomerase hemming
per se
eller telomerer forkortes som følge av hemming av telomerase aktivitet. I tillegg har de egenskaper og mekanismer for sensibilisering til cytotoksiske legemidler forårsaket av telomerase hemming ikke klarlagt på en systematisk måte.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien vi preget den relative betydningen av telomerase hemming versus telomerer forkortes i kreftceller. Sensibilisering av kreftceller til cytotoksiske legemidler ble oppnådd ved telomerer forkortes i en lengde avhengig måte og ikke av telomerase hemming
per se
. I vårt system dette allergi var relatert til virkningsmekanismen av cellegift. I tillegg telomerer forkortes påvirket også andre kreftcellefunksjoner som migrasjon. Telomerer forkortes indusert DNA skade hvis reparasjon ble svekket etter administrering av cisplatinaindusert mens doxorubicin eller vinkristin ikke påvirke DNA-reparasjon. Disse funnene ble bekreftet også i
in vivo
musemodell. Den antatte forklaring underliggende fenotypen indusert av telomerer forkortes kan være relatert til endringer i uttrykket av ulike microRNAs utløst av telomerer forkortes.
Konklusjon /Betydning
Til vår beste kunnskap dette er den første studien som karakteriserer den relative effekten av telomerase hemming og telomerer forkortes på flere aspekter av kreftcelle fenotype, spesielt relatert til følsomhet for cytostatika og dens mulige mekanismer. De mikroRNA endringer i kreftcellene ved telomerer forkortes er romanen informasjon. Disse funnene kan bidra til utvikling av telomere baserte tilnærminger i behandling av kreft
Citation. Uziel O, Beery E, Dronichev V, Samocha K, Gryaznov S, Weiss L, et al. (2010) telomerer forkortes sensitizes kreftceller til å Valgte cytostatika:
In Vitro Hotell og
In vivo
Studier og mulige mekanismer. PLoS ONE 5 (2): e9132. doi: 10,1371 /journal.pone.0009132
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 30 september 2009; Godkjent: 06.12.2009; Publisert: 9. februar 2010
Copyright: © 2010 Uziel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av forskningsmidler fra Rabin Medical Center Utvalget og et forskningsstipend fra Sackler School of Medicine, tele- Aviv University, Israel. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
menneske~~POS=TRUNC telomerer er sammensatt av enkelt-trådede TTAGGG gjentar og tilsvarende duplekser ifølge hexanucleotide plassert ved begge ender av den lineære kromosomet. Sammen med deres spesifikke shelterin proteinkompleks de gir stabilitet til hele genomet, ved å maskere kromosom ender fra å bli behandlet av DNA-reparasjonsmekanismer som dobbeltstrengbrudd [1]. Telomerer gradvis eroderer i de fleste somatiske celler på hver runde av DNA-replikasjon, inntil de når kritisk kort lengde som til slutt initierer et opphør av cellevekst betegnet cellulær senescens [2]. Kreftceller bruker enzymet telomerase å omgå telomerer forkortes, og dermed oppnå uendelig replicative potensial. Telomerase er et unikt revers transkriptase ribonucleoprotein kompleks som opprettholder en stabil tilstand av telomerlengde ved å syntetisere TTAGGG gjentar ved endene av kromosomene. Det er svært aktiv i mer enn 90% av alle kreftformer, og derfor regnes som et kjennetegn på kreft [3]. Telomerase er ikke uttrykt i de fleste normale somatiske celler, men beholder moderat aktivitet i proliferative stamceller og til en høyere grad i bakterie-celler linjehann. På grunn av denne spesifisitet og vesentlighet til den ubegrensede levetid av kreftceller, er telomerase ansett som en gyldig og attraktivt mål anticancer [4].
Faktisk har mange undersøkelser vist at telomerase-inhiberende resulterer i apoptose av kreftceller, krymping av tumorer i eksperimentelle dyremodeller og forbedret følsomhet av tumorceller til ulike kreftformer [5]. Det er imidlertid ikke klart om disse «gunstige biologisk ønskelig» effekter er konsekvensen av telomerer forkortes eller telomerase hemming
per se
. I tillegg har det ikke blitt bestemt ennå om styrking av følsomhet for cytostatika av telomerase hemming /telomerer forkortes er avhengig av mekanismen eller klasse av det kjemoterapeutiske middel.
Det meste av datapunkt til avkorting av telomerer under en kritisk grense som den viktigste mål oppnås ved telomerase inhibering [6], [7], støtter ideen ved hvilken oppnåelsen av betydelige telomerer forkortes vil resultere i anticancer kliniske effekter. Men flere studier impliserer ekstra «utenom» aktiviteter av telomerase som er uavhengig av telomerlengde regulering. For eksempel har telomerase vist seg å besitte egenskaper antiapoptotic [8], [9]. I tillegg sitt engasjement i DNA skade respons [10] eller DNA beskyttelse av «capping» [11] ble bestemt i tillegg. Telomerase ble også implisert i genekspresjon kontroll uavhengig av telomerlengde og i bidrag til veksten av forskjellige typer av benigne [12] -. [14] og maligne [15], [16] celler
Målet med denne studien var å klargjøre betydningen av telomerase hemming
per
seg i forhold til effekten av telomerer forkortes i kreftcellene, og for å evaluere effekten av disse forstyrrelsene på sensitiviteten til cellene til forskjellige cytotoksiske legemidler med forskjellige virkningsmekanismer. I tillegg har vi som mål å skildrer de mekanismer som celler med forkortet telomerlengde utstilling differensial følsomhet for disse stoffene.
Vi har funnet at telomerase hemming
per se
endrer ikke følsomheten til flere ondartede cellelinjer til en hvilken som helst av de stoffer som ble testet. Langsiktig telomerase hemming som resulterte i telomerer forkortes sensibilisert cellene til cisplatinaindusert, en DNA-addukter dannende middel og ikke doksorubicin, en dobbel trådbrudd som produserer agent eller til vinkristin, som Virkningsmekanismen er ikke gjennom direkte DNA-skade. Disse resultatene ble bekreftet i en dyremodell ved anvendelse av nakne mus med xenografter av pankreas karsinom-celler som var utsatt for telomerase-inhibitor og cytotoksiske medikamenter. Celler med kortere telomerer ervervet DNA-skader fenotype hvis reparasjon ble svekket etter cisplatinaindusert bare og uttrykte miRNA som er forbundet med vekst arrest av kreftceller. Disse cellene har også presentert langsommere vandring i forhold til deres villtype (WT) motstykker. Vi foreslår at telomerer forkortes i kreftceller er assosiert med endringer i miRNA uttrykk og fører til svekket DNA-reparasjon etter eksponering for cisplatinaindusert spesielt.
Materialer og metoder
Cellelinjer
SK-N-MC (Ewing sarkom) cellelinje ble vennlig levert av Dr Gad Lavie (Sheba Medical Center, Ramat-Gan, Israel). MCF-7 (bryst-karsinom) og K562 (kronisk myelogen leukemi) celler ble holdt i RPMI 1640 supplert med 10-15% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS), glutamin (2 mM), penicillin og streptomycin (Beit HaEmek, Israel ). Proliferasjonsanalyser, apoptose-analyser og telomerase aktivitetsanalyser ble utført på alle cellelinjer. SK-N-MC linje ble valgt for ytterligere detaljert analyse av forskjellige mekanismer i forbindelse med virkningen av telomerase inhibering på følsomhet overfor cisplatina. Kontroll celler ble holdt i kultur uten telomerase-hemmer, GRN163, parallelt med telomerase hemmet celler.
Telomerase Hemming
Celler ble utsatt to ganger i uken for å telomerase hemmer GRN163, rettet mot malen region RNA subenhet av telomerase (HTR). Kontroll Cellene ble holdt i kultur uten telomerase inhibitor i parallell med de inhiberte celler. For
in vivo
hemming av telomerase, ble musene injisert med GRN163L, en palmitoyl (C16) lipid-festet N3′-P5 «fosforamidat versjon av GRN163. Begge forbindelser ble vennlig levert av Geron Corporation (Menlo Park, CA, USA)
Drug Treatment og
In Vitro
Forsøksprotokoll
Alle cellelinjer ble utsatt for følgende legemidler i tre dager før spredning, cellesyklus og apoptose analyser: cisplatina, en DNA-addukter som danner medikament, doxorubicin, en dobbel tråd brytende middel og vinkristin, som interfererer med dannelsen av spindel mikrotubuli, stopper således separasjonen av dupliseres kromosomer og hindrer celledeling. Konsentrasjon av narkotika er avbildet i resultatene delen
For å vurdere effekten av telomerase hemming versus telomerer forkortes på følsomheten av cellene til cytostatika vi utviklet fire eksperimentelle forhold:. 1. Telomerase ble hemmet i tre cellelinjer i tre dager skaper celler uten telomeraseaktivitet og med intakte (WT) telomerer. 2. Langsiktig hemming (fra tre til 16 måneder), skape celler uten telomerase aktivitet og kortere telomerer. 3. Uttak av telomerase inhibitor i celler med forkortede telomerer, lage celler med korte telomerer og rekonstruert telomerase aktivitet. 4. Som kontroll brukte vi intakte villtypeceller. Telomerlengde og IC50 av de tre cytotoksiske legemidler ble bestemt etter 3 og 16 måneder i alle tre cellelinjene.
Proliferation Assay
heftende celler (1 x 10
4 celler ml
-1 SK-N-MC og MCF-7) ble sådd ut i fire eksemplarer i 24-brønners plater. Forskjellige stoffer ble tilsatt i følgende konsentrasjoner i området: vinkristin: 0-100 ng /ml, doksorubicin: 0-1000 ng /ml og cisplatina: 0-10 ug /ml. Etter 3 dager ble proliferasjon bestemt ved sulphorhodamine B assay [17]. Spredning av de ikke-adherente K562-celler ble bestemt ved WST-1-analyse som følger omdannelsen av tetrazoliumsalt til formazan-fargestoff ved mitokondrielle enzymer i henhold til produsentens instruksjoner (Roche, Tyskland), og som tidligere beskrevet [17].
TRAP-analysen
Celler (5 x 10
4 /ml) ble sådd ut i 24-brønners plater og inkubert i nærvær av GRN163 i 1-3 dager. Hver behandling ble utført i duplikater. Deretter måling av telomerase-aktivitet ble utført ved PCR-baserte TRAP-analyse, ved hjelp av TRAP
EZE telomerase deteksjon kit (Intergene, NY, USA), ifølge produsentens instruksjoner, og som tidligere beskrevet [17]. I korthet ble cellene lysert med iskald CHAPS lysebuffer) i 30 minutter ved 4 ° C og ble deretter sentrifugert ved 13000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble deretter samlet og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-analyse (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Proteinekstrakter (0,2 ug) ble analysert for TRAP analyse. Hver reaksjon ble utført i en 50 ul reaksjonsblanding inneholdende 10 x TRAP-buffer, dNTP miks, TS primer, TRAP primerblanding og Taq polymerase. Reaksjoner ble utført ved 30 ° C i 30 min og ble deretter underkastet PCR-amplifisering i 30 sykluser ved 94 ° C, 58 ° C og 72 ° C i 30 sekunder hver, og ble separert ved elektroforese på 12,5% polyakrylamidgeler (Akryl /bis 19:01 løsning). Geler ble farget med SYBER Grønn nukleinsyre gel stain (Amresco, Ohio, USA). Kvantifiseringen ble utført ved hjelp av Kvantum-ett programvare for Bio-Rad bildesøk analysesystemer (Bio-Rad Laboratories, Israel). Telomeraseaktivitet ble beregnet i henhold til følgende formel: TPG = [(X-X
0) /C]: [(r-r
0) /Cr * 100], hvor TPG er det totale produkt generert, X betyr hver prøve, C representerer den 36 bp PCR interne kontrollen, r er TSR8 kvantifiseringen kontroll.
TRF lengde
Terminal restriksjonsfragment (TRF) lengde, svarende til telomerlengde, ble målt av en ikke-radioaktiv Southern blot-teknikk. DNA-prøver ble ekstrahert fra cellene ved Genomisk DNA rensing kit (Gentra, Minneapolis, Minnesota, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, fordøyd i 16 timer ved
HinfIII Hotell og
RSAI Hotell og separerte på 0 · 8% agarosegel. Etter overføring til positivt ladet nylonmembran, ble prøver hybridisert med digoxigeninmerket probe (TTAGGG)
4 (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) for 16-18 timer. Membranene ble deretter utsatt for Chemiluminescence følsomme filmer, og den gjennomsnittlige TRF lengder ble beregnet av Versa Doc Imaging System, bruker Antall Én programvare (Bio-Rad Laboratories).
Analyser av Mir Signatur
RNA isolering.
RNA ble isolert ved hjelp av EZ-RNA II kommersielt sett (Biologiske Industries, Beit HaEmek, Israel) i henhold til produsentens instruksjoner gitt. Generelt ble celler etter relevante behandlinger lysert i lyseringsbuffer av settet og lagret ved -70 ° C før RNA-ekstraksjon som ble gjort til alle celler på en gang, før hybridisering med miRNA matriser.
mikroRNA microarray.
Custom mikroRNA mikromatriser er blitt beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt ble ~900 DNA oligonukleotidprober representerer mikroRNA (Sanger database versjon 10 og ytterligere microRNAs spådd og validert av Rosetta Genomics) oppdaget i tre paralleller på belagte microarray lysbilder (Nexterion® Slide E. Schott, Mainz, Tyskland). Hver RNA-prøve (15 ug av total-RNA) ble merket ved ligering av en RNA-kjeder, p-rCru-Cy /Dye (Dharmacon Lafayette, CO: Cy3 eller Cy5) til 3′-enden. Glassene ble inkubert med det merkede RNA i 12-16 timer ved 42 ° C og deretter vasket to ganger. Arrays ble skannet ved en oppløsning på 10 mikrometer og bildene ble analysert ved hjelp SpotReader programvare (Niles Scientific Portola Valley, California). To typer positive kontroller ble inkludert i eksperimentell design: (i) syntetiske små RNA ble tilsatt i hvert RNA prøven før merking for å bekrefte merking effektivitet og (ii) prober for rikelig små RNA ble flekket for å validere RNA kvalitet. Microarray flekker ble kombinert og signaler normalisert som beskrevet tidligere [18]
Dataanalyse
Dataene omfattet to prøver:.. SK-N-MC celler med intakt telomerer og SK-N-MC celler med forkortede telomerer. Totalt 170 mikroRNA prober hadde et signal som passerte den minimale terskel på 300 i minst en av prøvene. For hver av disse mikroRNA molekyler vi beregnet signal ganger endring mellom prøvene med korte telomerer og prøven med intakte telomerer.
cellesyklus og apoptose Analyser
Cells (0,7-1 × 10
4 ml
-1) ble dyrket i 3 dager. Flytende og adherente celler ble kombinert, vasket med PBS og kjerner fremstilt fra 5 x 10
5 til 1 x 10
6 celler for flowcytometrisk analyse ved anvendelse av en detergent-trypsin-metoden etterfulgt av farging med propidiumjodid [19]. DNA-innhold ble analysert ved FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), ved hjelp av ModFitLT cellesyklus analyse programvare (Verity Software House Inc., Topsham, ME, USA). Apoptose ble bestemt ved FACS-analyse ved hvilken celler i pre-G1 fasen av cellesyklusen ble definert som apoptotisk.
Påvisning av γH2AX Foci
Cellene ble sådd ut på dekkglass og eksponert for medikamenter for 24 h, fiksert og behandlet som tidligere beskrevet [20]. I korthet ble cellene fiksert med 4% paraformaldehide, vasket tre ganger med PBS og permeabilisert med 5% Triton X i 10 min. Etter tre vaskinger med PBS ble cellene blokkert med 10% normalt esel serum og 1% BSA, vasket på ny med PBS og inkubert med γH2AX antistoffoppløsning (1:350, Upstate Biotechnology, NY, USA) i 16 timer ved 4 ° C. Det andre antistoff CY2 konjugert anti-mus (Jackson Immuno Research Laboratories, PA, USA) ble tilsatt etter tre vaskinger med PBS. Cover lysbilder ble farget med DAPI og monteringsløsning. γH2AX foci ble visualisert under fluorescerende mikroskop (Applied Spectral Imaging, Migdal HaEmek, Israel). 50 kjerner ble telt for hver prøve.
The Comet Assay
DNA skader nivåer i celler med forskjellige telomere lengder og skader oppstått etter eksponering for legemidler ble vurdert av kometmetoden, som beskrevet [21 ]. Denne analysen følger skjør nivå av DNA ved å vurdere DNA-fragmenter migrasjon (produkter av single og /eller doble trådbrudd) fra kjernen kjernen for å danne kometen form når de utsettes for elektro feltet. Etter farging med etidiumbromid, kan omfanget av komet overvåkes og kvantifiseres. I utgangspunktet, ble cellesuspensjonen blandet med 0,65% lavtsmeltende agarose og spredt på en stjerne-frost objektglass, forbelagt med 0,65% normalt smeltende agarose. Et tredje lag inneholdende 0,65% lavtsmeltende agarose ble plassert på toppen og cellene ble deretter lysert ved å dyppe objektglass over natten i en nyfremstilt lyseringsoppløsning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100 , 10% DMSO, pH 10,0) ved 4 ° C. Etter at lysering, ble platene vasket tre ganger i kaldt vann og plassert i en horisontal anordning gelelektroforese innehold nyfremstilt elektroforese buffer (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH = 13,0) i 20 min for å tillate DNA-avkobling. Elektroforese ble deretter utført ved 20 V og ved en utgangsstrøm på 300 mA i 20 minutter ved 4 ° C. Deretter ble platene nøytralisert med tre vaskinger med 0,4 M Tris, pH = 7,5, dehydrert med etanol og tørket. Platene ble farget med 20 ug /ml etidiumbromid oppløsning og betraktes under en fluorescerende belysning ved bruk av 530-550 nm eksitasjon og 590 nm filter barrierefilter (U-MNG kube, Olympus, Tyskland). Alle trinn ble utført i mørket for å hindre ytterligere DNA-skade. For å evaluere komet parametre, ble lysbilder undersøkt parallelt hjelp Viscomet bildeanalyse programvare. Totalt 150 tilfeldig valgte celler fra tredoble lysbilder ble undersøkt for hver prøve (50 celler per lysbilde). Bildeanalyse ble utført ved 200 x forstørrelse. Celle Bildene ble projisert på en høyoppløselig Heper-HAD ™ (Sony, Japan) CCD-kamera (8 biter [Applitec, Israel, LIS-700]) og analysert med Viscomet bildeanalyse programvare ved hjelp av MV Delta ramme grabben (Matrix Vision , Tyskland). DNA-skade ble målt ved bruk av følgende parametere: komet utstrekning (avstanden fra den fremre hode kant til den bakre kant av halen), prosent hale-DNA (prosentandel av DNA i halen), og hale utstrekning øyeblikk (hale lengde X prosent hale-DNA ). Lysbilder ble kodet og én etterforsker analysert alle lysbilder for å minimere scoring variasjon
Migrasjon Analyser
Migrasjon av celler ble evaluert av to analyser. Sårtilhelingen analysen og en modifisert Boyden kammer analysen (transwell assay).
sårheling analysen ble utført i henhold til ref [22]. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 0,2 x 10
6 celler /brønn i seks-brønners kulturplater og tillatt å danne et konfluent monolag. Sjiktet av celler ble deretter skrapet med et P200 pipettespiss for å skape et sår på ~ 1 mm bredde. Bilder av sårene ble tatt til fange på
t
= 0 og 24 timer ved × 40 forstørrelse og såret området ble bestemt ved hjelp av Scion Bilde for windows alpha 4.0.3.2 programvare. Evnen av cellene for å lukke såret, det vil si, deres motilitet, ble evaluert ved å bestemme helbredet området. Andel tilhelet område ble beregnet på følgende måte: (sår område på
t
= 0-såret på
t
= 22) /sår område på
t
= 0) × 100. Platene ble merket for å sikre konsekvent fotodokumentasjon.
Modifisert Boyden kammeret ble utført som beskrevet tidligere [23]. Celler ble sådd i tre paralleller på polykarbonatfiltere med 8 um porer som er plassert på det øvre rom av 24-brønners Transwell kamre (Costar, Cambridge, Mass, USA). Den nedre overflate av transwell kamrene ble belagt med fibronektin (5 ug /filter). Kulturmedium ble tilsatt til det nedre kammer. Cellene ble tillatt å migrere i 18 timer ved 37 ° C og filtrene ble så fiksert med metanol og farget med Giemsa beis. Cellene på den øvre overflaten av filteret ble fjernet med en bomullspinne. Endelig ble celler som har migrert til den nedre side av filteret fotografert og tellet under et mikroskop.
Dyr
atymiske kvinnelig eller mannlig BALB /c
nu /nu
mus, 5-6 uker gamle, ble kjøpt fra Harlan Ltd (Jerusalem, Israel). Musene ble holdt under patogenfrie forhold i topp filtrert bur og matet en vanlig diett. Alle prosedyrer ble utført ved bruk av anlegg og protokoller godkjent av Animal Care og bruk komité for Hadassah-Hebrew University School of Medicine.
Menneske Xenotransplantat Murine Modell
CRL 1867 celler (human bukspyttkjertel carcinoma) ble høstet ved trypsinering av konfluente kulturer, vasket og resuspendert til 1,0 x 10
8 celler /ml i vekstmedium. Mus ble inokulert med CRL 1687 celler i 100 ul medium under rygghuden en dag etter bestråling av hele kroppen ved 400 cGy, levert av en lineær akselerator (Varian Climac 6 x) ved en kilde til hud avstand på 80 cm, og en dose på 170 cGy /min. Mus ble behandlet med 30 mg /kg i.p. GRN 163L 3 ganger per uke i flere uker, og starter en dag etter tumorinjeksjon. Kontrollgruppen ble injisert med PBS (0,2 ml i.p.). Tumorvekst ble overvåket hver 6-8 dager ved kalibermålinger av to vinkelrette diametere på xenotransplantater (D
en, med større diameter og D
2, med mindre diameter). Tumorvolum ble målt ved å benytte formelen: n /6 (D
1 x D
2), og uttrykt som gjennomsnittlig tumorvolum ± SE (i mm
3). Ved 41-55 dager etter celleinjeksjon, ved tidspunktet for avliving, ble tumorene skåret fri for bindevev, veiet og halvparten av dem ble frosset i flytende nitrogen. Den andre halvparten ble brukt for bestemmelse telomerlengde og patologiske parametere.
Histologi
På slutten av forsøkene ble musene avlivet og tumoren, bukspyttkjertel, lunge og vev ble fjernet. Vev ble fiksert i 10% formalin, innstøpt i parafin, farget med hematoksylin og eosin, og evaluert ved lysmikroskopi.
Resultater
In vitro
Studier
telomerase hemming med GRN163 forkorter telomerer.
Administrasjon av GRN163 resulterte i 70-90% hemming av telomerase (fig. 1a). Denne hemmingen vedvarte opp til 72 timer og gjentatte målinger gjennom de 16 måneder av eksperimentet bekreftet kontinuerlig inhibering av telomerase på dette området (ikke vist). I alle cellelinjer telomerer ble forkortet i et område på 20-30% og 40% etter 3 og 16 måneder, henholdsvis (fig. 1 B).
a. SK-N-MC, MCF-7 og K562 ble utsatt for 5um av GRN163. Telomeraseaktivitet ble vurdert ved TRAP-analyse etter 24 timer. C- kontroll ubehandlede celler, M- mistilpasning ikke-spesifikk oligo egge, I-telomerase-inhibitor GRN163. R8- standard TRAP kontroll, N- negativ kontroll uten celleekstrakter, IC-intern PCR kontroll. Omfanget av telomerase-inhibering er angitt i prosenter under banene. b. SK-N-MC celler ble kontinuerlig utsatt for 5 uM av GRN163. Telomerlengde ble målt ved hjelp av Southern blot. C- kontroll ubehandlede celler, Ia- telomerlengde av celler eksponert for telomerase-inhibitor i tre måneder, Ib- telomerlengde av celler eksponert for telomerase-inhibitor i 16 måneder, molekylstørrelsesmarkør M-. Bety telomerlengde er betegnet under hvert kjørefelt, og prosentandelen av telomere matfettet er vist i tillegg. c. Grafisk fremstilling av omfanget av telomerer forkortes etter eksponering av SK-N-MC celler til GRN163 for 1 år, målt ved Southern blot.
telomerer forkortes men ingen telomerase hemming
per se
sensitizes celler spesifikt til cisplatinaindusert.
Som vist i fig. 2 og tabell 1 telomerer forkortes øket følsomhet av de tre cellelinjene til cisplatina i en lengde avhengig måte. Telomerase hemming
per se
hadde ingen selvstendig effekt på celler følsomhet for cisplatinaindusert. IC
50 av cisplatinaindusert redusert fra 0.13μg /ml til 0.07μg /ml etter 16 måneder. Telomerer forkortes påvirket ikke signifikant cellenes følsomhet for doxorubicin og vinkristin. Tabell 1 oppsummerer disse resultater og fig. 2 viser i detalj endringer i følsomheten av SK-N-MC-celler til cisplatina. Ettersom alle cellelinjer oppførte seg på samme måte i denne sammenheng, har vi valgt SK-N-MC celler som en modell for videre karakterisering av mekanismene bak telomerer forkortes indusert sensibilisering av kreftceller til kjemoterapi og differensial følsomhet for cisplatinaindusert.
en. Spredning av celler med kortere telomerer utsatt for cisplatinaindusert. SK-N-MC celler ble kontinuerlig utsatt for GRN163. Følsomheten av cellene til cisplatina ble beregnet etter tre og 16 måneder med telomerase inhibering. Tallene angir IC
50 av medikamentet i disse tidspunkter (etter 22% og 40% reduksjon av telomerlengde). P-verdi refererer til forskjellen mellom WT og korte tlf-16 måneder. b. Cellesyklus status for SK-N-MC celler med kortere telomerer utsatt for 0.13μg /ml cisplatinaindusert. SK-N-MC-celler med en forkortet telomerer ble utsatt for cisplatina og status cellesyklusen ble evaluert ved hjelp av FACS. + Eller – refererer til eksponering for cisplatinaindusert. C. apoptotiske indeksen for SK-N-MC celler med kortere telomerer utsatt for cisplatinaindusert. De samme cellene ble analysert ved hjelp av FACS for deres apoptotisk indeks, som er representert ved sin preG1 status. Tallene angir LD
50 av cisplatinaindusert i celler med intakt eller forkortede telomerer.
telomerer forkortes påvirker ikke cellesyklus status etter eksponering for cytotoksiske legemidler.
telomerer forkortes ikke påvirke cellesyklusstatus av cellene (stolpene A og C i figur 2b.). Eksponering av cellene til cisplatina resulterte i reduksjon av G0 /G1 og økning av G2 /M-fasen av cellesyklusen. Disse endringene ble ikke påvirket av forkorting av telomerer (fig. 2b). Dessuten gjorde telomerer forkortes øke apoptotiske frekvensen av cellene på grunn av kjemoterapi (Fig. 2c).
telomerer forkortes tregere migrering av kreftceller.
Siden
in vitro
migrering av kreftceller er ansett som en gyldig representasjon av metastatisk potensial, vurderte vi effekten av telomerer forkortes på denne funksjonen også. Migreringen ble vurdert ved å transwell membran (Boyden kammer) (Fig. 3a, b) og sårheling (fig. 3c, d) analyser. Som vist på fig. 3, i transwell membranen analysen av cellene med en forkortet telomerer migrerte betydelig langsommere enn kontrollcellene. Den sårheling analysen viste også tendenser til tregere migrering, men resultatene var ikke statistisk signifikans.
migrasjon av celler med kortere telomerer ble evaluert av transwell og sårtilheling analyser. en. Transwell membran assay. Celler med intakte eller forkortede telomerer ble tillatt å migrere gjennom en membran i 16 timer, Gimza farget og tellet. Et representativt bilde vises. b. Grafisk demonstrasjon av gjennomsnittlig celletall av fire uavhengige forsøk. c. Sårtilhelingen assay. Celler med kortere telomerer ble sådd ut på petriskåler, og kulturen ble «ripete» og fulgt i 24 timer. Gjennomsnittlig målinger av celle frie hullene ble gjort. Et representativt eksempel er vist. d. Grafisk demonstrasjon av gjennomsnittlig celletall av fire uavhengige forsøk.
De påfølgende studier ble utført for å belyse de mulige mekanismene bak fenotypiske endringer indusert av telomerer forkortes.
telomerer forkortes er forbundet med økt DNA-skade og nedsatt evne til DNA-reparasjon som vurderes av komet assay. Cisplatinaindusert svekker ytterligere DNA reparasjon i celler med forkortede telomerer.
Telomerer forkorting kan forsterke DNA skade respons på grunn av tap av sin beskyttende funksjon. For å vurdere nivået av DNA skader i celler med kortere telomerer, ansatt vi kometen analysen. Som vist på fig. 4a, b telomerer forkortes var assosiert med DNA-skade på cellene. Tail utstrekning øyeblikk parameter (som gjenspeiler halelengden X prosent hale-DNA, mens halen lengde er avstanden i mikrometer fra hodet sentrum til enden av halen) var 30% høyere i cellene med kortere telomerer. Vurdering av alle andre komet analyseparametere avslørt lignende resultater, og den samlede kometen intensiteten økte i om lag 16% i disse cellene.
a. Prinsippet om kometen analysen. Cellene kjerner ble utsatt for elektroforese og farget med etidiumbromid. Broken DNA vandrer ut av kjernene og danner komet. Tre grader av DNA-skader vises: kontrollkjerner med intakt DNA (som representerer DNA-skader i celler med intakt telomerer, # 1), mellomtilstand i celler med delvis ødelagt DNA (som representerer celler med mild telomerer forkortes, # 2) og celler med en forkortet telomerer husing skadet ødelagt DNA (som representerer celler med forkortede telomerer, # 3). b. Kvantitering av omfanget av DNA-skade status av celler med en forkortet telomerer, utført ved screening 50 bilder per sample i firedobler. På venstre-Tail grad øyeblikk parameter, på høyre totale komet intensiteter. c. Kvantitering av omfanget av evne til cellene for å reparere DNA-skade påført av doksorubicin (høyre panel) eller cisplatina (venstre panel) 2 og 4 timer etter medikament indusert skade. Analysen ble utført ved screening av 50 bilder per sample i firedobler. DNA skade status ble bestemt ved å beregne halen grad øyeblikket.
For å forstå hvorfor celler med kortere telomerer er mer følsomme for cisplatinaindusert enn å doxorubicin, cellene ble eksponert for disse stoffene i én time, etterfulgt av endring av medium til medium uten medikament. DNA skade nivåer ble evaluert 2 og 4 timer etter legemiddeleksponeringen ved hjelp kometen analysen. Som vist på fig. 4c, begge legemidlene indusert DNA-skade, men celler med en forkortet telomerer mislyktes i å reparere DNA-skade forårsaket av cisplatina, mens den induserte skader doksorubicin ble reparert på en lignende måte ved celler med både intakte og forkortet telomerer.
telomerer forkortes er forbundet med dannelse av telomer-skader indusert foci (TIF) hvis reparasjon er svekket i celler med forkortede telomerer. en. b. c.
