Abstract
hormoner, inkludert østrogen og progesteron, og deres reseptorer spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av ovarialcancer. Androgen, har dets reseptor og coactivators også vært implisert i disse prosessene. P44 /Mep50 /WDR77 ble identifisert som en subenhet av methylosome komplekset og i det siste karakterisert som en steroid-reseptor coactivator som forbedrer androgen reseptor så vel som østrogen reseptor-mediert transkripsjonen aktivitet i en ligand-avhengig måte. Vi har tidligere beskrevet tydelig uttrykk og funksjon av P44 i prostata, testis, og brystkreft. I denne rapporten undersøkte vi uttrykket og funksjon av P44 i eggstokkreft. I motsetning til funn i prostata og testikkelkreft og lignende til brystkreft, viser P44 sterk cytoplasma lokalisering i morfologisk normal eggstokk overflate og egglederen epitel, mens kjernekraft P44 er observert i invasiv ovarialcancer. Vi har observert at P44 kan tjene som en coactivator av både androgenreseptoren (AR) og østrogenreseptor (ER) i eggstokkceller. Videre overekspresjon av kjernefysisk-lokaliserte P44 stimulerer spredning og invasjon i eggstokkreft celler i nærvær av østrogen eller androgen. Disse funnene sterkt at P44 spiller en rolle som formidler effekten av hormoner i løpet av eggstokkreft tumorigenesis
Citation. Ligr M, Patwa RR, Daniels G, Pan L, Wu X, Li Y, et al. (2011) uttrykk og funksjon av androgen Receptor Coactivator P44 /Mep50 /WDR77 i eggstokkreft. PLoS ONE 6 (10): e26250. doi: 10,1371 /journal.pone.0026250
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 7 mars 2011; Godkjent: 23 september 2011; Publisert: 13 oktober 2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Northwestern Memorial Hospital Dixon translasjonell forskningsfondet tilskudd til JJW. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den femte største dødsårsaken av kreft hos kvinner, og den nest mest dødelige gynekologisk kreftform i USA [1]. Ovarialcancer står for om lag 3% av totalt antall krefttilfeller hos kvinner. National Cancer Institute anslår at i 2010, ville 21,880 kvinner bli diagnostisert og 13,850 kvinner ville dø av kreft i eggstokk [2].
Eggstokkreft er en gruppe av heterogene sykdommer og består av ulike histologiske typer, noe som kan lett bli differensiert ved histologisk evaluering [3]. Gjeldende kliniske retningslinjer fastsatt av Verdens helseorganisasjon skille åtte histologiske kreft undergrupper: papillær serøs karsinom (PSC), endometrioid karsinom (EMC), mucinous karsinom (MUC), klarcellet karsinom (CCC), overgangsordning celle carcinoma (TCC), plateepitelkarsinom , blandet epitelial, og udifferensiert, med serøs carcinoma som viser den mest maligne fenotypen [4], [5]. Genome-wide global genet analyse definerer videre distinkte uttrykk profiler av forskjellige typer eggstokkreft [6]. Ulike histologiske typer eggstokkreft synes å være regulert av ulike patogene trasé [7]. Mest EMC og PSC liggende moderat til høye nivåer av ER [8], [9], [10] og AR uttrykk [11], [12].
steroid hormonreseptorer, som for eksempel ER, progesteron reseptor ( PR), og AR, er involvert i utviklingen av endokrine organ kreft, inkludert kreft i eggstokkene [12], [13], [14]. Østrogener er kjent for å være regulatorer av vekst og differensiering av normale eggstokkene, samt i utviklingen av ovarialcancer, men mekanismen for denne hormonell regulering forblir tvetydig. Østrogen virker via to nukleære reseptorer, østrogen reseptor alfa (ERα) og estrogen receptor beta (ERβ) som binder til en østrogen respons element (ERE) i promoterregionen av målgener, som regulerer deres transkripsjonelle aktivitet [15]. Tilsvarende er AR også en ligand-aktivert transkripsjonen faktor. Bindingen av androgen til AR resultater i kjernefysiske lokalisering av hormonet-reseptor kompleks sammen med coactivators og basal transkripsjonen maskiner. En gang i kjernen det da binder seg til en androgen respons element (ER), som regulerer uttrykket av målgener [16].
AR er en utbredt sex steroid reseptor uttrykt i eggstokkreft. Åttifire prosent av tumorer uttrykker AR, i motsetning til bare 74% av tumorer som uttrykker ER og 41% uttrykker PR [17]. Det er en høyere risiko for eggstokkreft i innlegget menopause inn, er androgener er de primære steroider utskilt av eggstokken [18]. Høy ekspresjon av PR er forbundet med god prognose i multivariant analyse for eggstokkreft [19]. Men resultatene er kontroversielt for korrelasjonen av disse tre reseptorer med prognose og overlevelse hos pasienter [12], [20].
P44 er et 44 kDa AR-veksel protein, noe som har vist seg å øke AR transkripsjonen aktivitet. Den inneholder 342 aminosyrerester og fire antatte WD40 gjentar [21]. Videre eksisterer P44 i en methylsome kompleks med arginin-metyltransferase-5 (PMRT5), og er også en subenhet av overlevelsen av motor neuron (SMN) kompleks [22]. På grunn av fosforylering av dets subenhet, er det SMN kompleks aktive i cytoplasmaet, hvor den fremmer U snRNP sammenstilling [23]. Den ekspresjon og funksjon av P44 proteinet har blitt rapportert i prostata, testiklene, og brystkreft. Interessant, observerte vi forskjellige mønstre av ekspresjon og funksjon i disse reproduksjonsorganene [21], [24], [25]. Vi fant distinkt intracellulær lokalisering av P44 i benign (som atom protein) og ondartet (som cytoplasmatisk protein) prostatavevet. Nuclear ekspresjon av P44 hemmer prostata kreft vekst under påvirkning av androgen [21]. I motsetning til dette ble P44 uttrykt som et cytoplasmisk protein i godartet bryst epitel og som et kjerneprotein i brystkreft. Nuclear P44 fremmet brystkreftcellevekst i nærvær av østrogen [21], [24]. Våre funn tyder på at P44 fungerer som en kofaktor påvirke organspesifikk tumorigenesis i sex steroid hormonregulerte tumorer.
I denne studien undersøkte vi uttrykket av P44 i godartede og ondartede menneskelige eggstokkene celler. Vi har funnet at P44 ble uttrykt forskjellig i forskjellige typer av eggstokkreft. I endometrioid og serøs eggstokkreft, ble P44 uttrykt som en kjernefysisk protein. Imidlertid P44 ble uttrykt som en cytoplasmatisk protein i benign ovarie (OSE), eggleder (FT), og endometrial (EM) epitel. Våre data viste også at AR og ER spille en rolle i regulering av atom-cytoplasma translokasjon av P44 i eggstokk-kreft og deretter kreftcellevekst og invasjon.
Resultatene
Ekspresjon og cellulær lokalisering av AR coactivator P44 i menneskelig eggstokkreft: potensiell regulering av lokalisering av androgen og østrogen
for å avgjøre om P44 er assosiert med eggstokkreft, undersøkte vi P44 uttrykk i godartet eggstokk, livmor, og egglederen vev og ulike histotypes av ovariekarsinomer av immunhistokjemi. For å bestemme cellulær lokalisering av P44, uttrykk for P44 i cytoplasma og kjerner var semi-kvantitativt scoret separat (se Materialer og metoder).
P44 var immunoreactive i både cytoplasma og kjerner. I normale vev, inkludert FT, EM, og OSE, det var høyere nivå av P44 immunoreactive i cytoplasma enn i kjerner (cytoplasmatiske til atom forholdet var ca 02:01, figur 1B). I alle 5 typer eggstokkreft karsinom, inkludert MUC, CCC, EMC, serøs borderline (SBT), og PSC, var det en økning av kjerne immunoreaktivitets for P44 i forhold til cytoplasma (figur 1A, Tabell 1), selv om kjernefysisk P44 nivåer variert mellom ulike histologiske typer eggstokkreft. SBT hadde høyest immunoreaktivitets for P44 i kjerner og MUC hadde lavest (figur 1B, S1). Multiple ANOVA analyse viste at det var signifikante forskjeller i P44 immunoreaktivitets i atomkjerner mellom godartet (FT: 0,89 ± 0,17, EM: 0,55 ± 0,15, OSE: 0,54 ± 0,14) og ondartet (CCC: 1,64 ± 0,13; EMC: 1.71 ± 0.16; PSC: 2,06 ± 0,14, og SBT: 2,67 ± 0,17) epitel (p 0,01). Paret t-test viste at det ikke var signifikant forskjell fra P44-immunreaktivitet i kjerner parvis mellom FT og PSC, OSE og PSC, EM og EMC, henholdsvis (p 0,05). PSC, EMC, og CCC karsinom viste lignende immunointensity av P44 i kjerner av ANOVA analyse (p 0,05, figur 1B, S1). I motsetning til dette var det minimal forskjell fra cytoplasmatisk immunreaktivitet for P44 mellom hver av benigne og maligne epitel (p 0,05, figur 1B). Generelt, EMC, PSC, og SBT hadde relativt rikelig ER ekspresjon og disse tumorene viste relativt høye nivåer av P44 immunoreaktivitet i kjerner (figur 1A, 1B, fig S1). Resultatene av forskjell i cellulær lokalisering av P44 mellom normalt vev og eggstokkreft kan foreslå en rolle av P44 som en østrogenreseptor megler i tumorigenesis av eggstokkreft.
A. Eksempler på P44 uttrykk ved immunhistokjemi i 4 ulike histologiske typer eggstokkreft og normal eggleder og endometrium (forstørrelse 200x). B. semikvantitativ analyse av P44 immunointensity og dens cellulær lokalisering i fire ulike histologiske typer eggstokkreft og normal egglederen og endometrium. Mørkegrå søylene er atom P44 og lys grå barer er cytoplasma P44. Små T-stolper representerer standard feil. C. Western blot-analyse av AR, ERα og ERβ ekspresjon i forskjellige cellelinjer, blant annet T29, SKOV-3, OVCAR-3. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Den primære antistoff fortynning brukes til P44 var 1:5000, for AR 1:1000, for ERα og ERβ 1:2000 og for β-aktin 1:5000.
For å evaluere forholdet av P44 med AR og ER i eggstokk-kreft, vi først undersøkt uttrykket nivåer av disse reseptorene i de utvalgte ovarie cellelinjer. Western blot analyse viste at P44 uttrykk var høyere i eggstokkreft cellelinjer ovčar-3 og Skov-3 enn godartet ovarian overflaten epithelial (OSE) cellelinje T29. Nivåene av P44 uttrykk positivt korrelert med ERα /β og AR uttrykket (figur 1C). Spesielt har vi funnet at ERα uttrykk var høyere i Skov-3 og omvendt, ERβ isoformen viste de høyeste nivåene i OVCAR-3 cells.To bestemme P44 cellulær lokalisering og regulering av østrogen og androgen i godartede og ondartede OSE celler, vi undersøkte lokalisering av P44 under tre forskjellige medie forhold: hormon-fritt medium og medium med definerte nivåer av enten androgen eller østrogen ved immunfluorescens mikroskopi. Som vist i figur 2, godartede T29 cellene hadde høyere nivåer av cytoplasmisk P44 og, til en viss grad, atom P44 i alle tre mediaforhold. I SKOV-3, ble P44 lokalisert hovedsakelig i kjernen i hormon-fri, androgen (10 nM syntetisk androgen R1881) og østrogen (10 nM 17β-østradiol) media (figur 2). I OVCAR-3-celler, ble P44 lokalisert i både kjernen og cytoplasmaet i hormon-fritt medium, og lokalisert til kjernen, i nærvær av enten androgen eller østrogen (figur 2).
P44 primært antistoff og rhodamin -konjugert kanin polyklonale sekundært antistoff ble anvendt. DAPI ble brukt til å farge kjerner. (Forstørrelse: 400x)
AR coactivator P44 fungerer som både AR og ER coactivator i eggstokkene celler
P44 er et coactivator av AR og ER og har tydelig uttrykk i prostata og bryst celle linjer [21], [24]. For å avgjøre om P44 fungerer som en transkripsjon aktivator i eggstokkreft cellelinjer, vi utførte en in vivo transkripsjonen analysen bruker dual luciferase reporter system. Vi transient transfektert T29 celler med vektor som uttrykker P44 og enten et par av vektorer som uttrykker AR og et luciferase reporter under styring av fire androgen responselementer (figur 3A), eller ERα, og et luciferase reporter under kontroll av østrogenresponselementer (figur 3B). I nærvær av androgen, P44 aktivert androgen reseptor-drevet transkripsjon på en doseavhengig måte, som fører til så mye som 2,6-ganger økning av reporter aktivitet sammenlignet med kontrollen. På samme måte, i nærvær av østrogen, P44 aktivert østrogenreseptor avhengig transkripsjon i en doseavhengig måte: rapportørsignalet økes så mye som 4,5 ganger sammenlignet med kontrollen. Når P44 ble uttrykt alene, i fravær av enten AR eller ER, ble ingen virkning på reporter aktivitet observert, både i nærvær og fravær av hormoner i mediet (data ikke vist), noe som bekrefter P44 aktivering via hormonreseptorer. Disse funnene indikerer at P44 faktisk fungerer som en coactivator av både androgen og østrogen reseptorer i eggstokkene celler.
A. Vektorer inneholdende P44 og AR ble transfektert inn i T29-celler sammen med en reporter vektor inneholdende luciferase genet under kontroll promoter som inneholder 4 androgen responselementer. B. Vektorer inneholdende P44 og ERα ble transfektert inn i T29-celler sammen med den ER-luc reporter vektor. Reporter aktivitet ble uttrykt som relative enheter.
AR coactivator P44 fremmer eggstokkreft cellevekst og invasjon
For å dissekere effekten av P44 på eggstokkreft celleproliferasjon, vi først transfektert retrovirale vektorer uttrykke NLS-P44 inn Skov-3 celler. NLS-P44 er konstruert med nukleære lokaliseringssignal (NLS) fusjonert i ramme til N-terminalen av P44. Skov-3 celler er ikke i stand til å svare på østrogen aktivering [26], [27]. Etter å ha bekreftet at transfektert P44 ble uttrykt, fortsatte vi å analysere den proliferative status for cellene (Figur 4A). I begge hormon-fri og østrogen-supplert medium, overekspresjon av NLS-P44 hadde ingen virkning på vekst av SKOV-3-celler (p 0,05). Imidlertid, i nærvær av androgen, overekspresjon av NLS-P44 førte til tilnærmet 33% reduksjon i cellevekst (p 0,01). Avtagende nivåer av P44 ved behandling av de SKOV-3-celler med den tilsvarende siRNA førte til lignende resultater. Mens i media inneholdende androgen knockdown av P44 førte til omtrent 25% reduksjon av veksten (p 0,05), og ~15% reduksjon av veksten av cellene i hormonfritt medium (p 0,05), var det ingen statistisk signifikant effekten av siRNA behandling på vekst av celler i medium inneholdende østrogen (figur 4C). Siden østrogen reseptor i SKOV-3-celler er ikke-responsive til østrogen, vil resultatene bekreftet våre fremgangsmåter for studien
A, B:. SKOV-3-celler (A) og OVCAR-3-celler (B) ble transfektert enten med pBabe-NLSp44 overekspresjon vektor eller en kontrollvektor, og kultivert enten i hormonfritt medium eller i nærvær av androgen eller østrogen. Overekspresjon av P44 ble bekreftet ved western blot (prøver tatt annenhver dag), og cellene ble tellet hver dag. C, D: SKOV-3-celler (C) og OVCAR-3-celler (D) ble behandlet med P44 siRNA ved hjelp Hiperfect og dyrket enten i hormonfritt medium eller i nærvær av androgen eller østrogen. SiRNA behandling ble gjentatt annenhver dag. Overekspresjon og knockdown av P44 ble bekreftet ved western blot (prøver tatt annenhver dag), og cellene ble tellet hver dag.
I motsetning til SKOV-3 cellelinjen, er responsive OVCAR-3-celler til østrogen stimulering [28]. Faktisk, når OVCAR-3-celler ble dyrket i medium supplementert med østrogen eller androgen (figur 4B og D, åpne trekanter og firkanter), begge viste økt proliferasjon sammenlignet med celler dyrket i hormonfritt medium (55% og 40%, respektivt ). I motsetning til situasjonen i Skov-3 celler, observerte vi en sterk positiv effekt av kjernefysisk P44 overekspresjon på vekst av OVCAR-3 celler i media supplert visne enten androgen eller østrogen. I nærvær av androgen, overekspresjon av NLS-P44 resulterte i 1,5 ganger økning i vekstraten, og i nærvær av østrogen den observerte veksten induksjon var 1,6 ganger. Det var ingen signifikant påvirkning av cellevekst ved P44 overekspresjon i hormon-frie medier (figur 4B).
Vi observerte også en sterk, men negativ, effekt av uttømming av P44 i ovčar-3 celler ved hjelp av siRNA bekreftet proteinnivået ved western blot-analyse. Mens overekspresjon av P44 hadde ingen signifikant innvirkning på veksten i hormonfritt medium, knock-down av P44 protein nivåer førte til 25% reduksjon av veksten i hormonfritt medium. I hormon supplert media veksten reduksjon forbundet med P44 uttømming dukket opp enda sterkere. I østrogen media, forårsaket P44 uttømming 40% reduksjon av tumorcellevekst, mens i nærvær av androgen denne forskjellen utgjorde 33% (figur 4D).
Vi testet videre P44 effekter på celle invasjon evne ved hjelp av en
in vitro
Matrigel invasjonen assay. Vi har observert øket invasivitet av cellene i mediet supplert med androgen i forhold til hormonfritt medium. Behandling av celler med østrogen ikke endre antall celler som krysser membranen (figur 5A). Når vi overuttrykt NLS-P44 på SKOV-3-celler, var det ingen forandring i evnen til cellene for å invadere gjennom Matrigel membranen, enten i hormonfritt medium eller media supplementert med androgen eller østrogen. Hvis du vil blokkere endogen P44 uttrykk, introduserte vi P44 siRNA inn Skov-3 celler. I medie mangler hormoner, gjorde uttømming av P44 ikke påvirke tumorcelle invasjon gjennom Matrigel, som det ikke påvirke tumorinvasjon i østrogenholdige medier. I media supplert med androgen, mangel på P44 ekspresjon betydelig redusert celle invasjon opp til tre ganger (figur 5C)
A, B:. SKOV-3-celler (A) og OVCAR-3-celler (B) var transfektert enten med pBabe-NLSp44 overekspresjon vektor eller en kontroll vektor; C, D: SKOV-3-celler (C) og OVCAR-3-celler (D) ble behandlet med P44 siRNA ved hjelp Hiperfect og dyrket enten i hormonfritt medium eller i nærvær av androgen eller østrogen. Overekspresjon og knockdown av P44 ble bekreftet ved western blot (se figur 4). Celler ble sådd ut på Matrigel membraner i hormon-fritt medium. Androgen eller østrogen ble brukt som chemoatractants i bunnkammeret.
Vi testet også effekten av P44 på invasjonen i OVCAR-3 celler. I likhet med Skov-3 celler, økning eller reduksjon av P44 uttrykk ikke påvirke celle invasjonen i hormon-frie medier (figur 5B, D). I androgen eller østrogen-supplert media, ble mer enn to gangers økning av Matrigel invasjonen bemerket (figur 5B). Konsekvent, knockdown av P44 i ovčar-3 celler resulterte i en dramatisk reduksjon av invasjonen evne i den hormon supplert media.
Diskusjoner
Steroid hormoner er viktige faktorer i utvikling og progresjon av eggstokkreft kreft. De hormonreseptorer og deres kofaktorer er avgjørende for hormon handling. Mest eggstokkene karsinomer, inkludert serøs og endometrioid typer, viser varierte nivåer av ER, PR, og AR uttrykk [12], [27]. Uttrykk for sex steroid hormonreseptorer og deres kofaktorer i eggstokkreft gi mål for antihormonbehandlinger. Således er det vesentlig for å karakterisere rollen av kjønnshormoner og deres kofaktor-mediert tumorgenese i eggstokkreft. Det har blitt rapportert at AR er en viktig markør i eggstokk-kreft [29], men de molekylære mekanismer for AR forbundet aggressiv oppførsel kreft i eggstokkene [30], [31], [32] er fremdeles dårlig forstått.
i våre tidligere studier, fant vi at AR coactivator P44 spiller en viktig rolle i både prostata og brystkreft, noe som indikerer involvering av AR veien i tumorigenesis av disse endokrine organer. I denne studien, søkte vi tilsvarende prinsipper for å bestemme bidraget av P44 til onkogene funksjoner i ovariekreft tumorgenese, i forhold til androgen eller østrogen. Vi fant ut at cytoplasma P44 er sterkt uttrykt i godartet eggstokkreft, livmor, og egglederen overflate epitelceller. Men i forskjellige krefttyper, har P44 differensialmobil uttrykk mønstre, reflektert av ulike nivåer av cytoplasmatiske og kjernefysiske lokaliseringer. P44 er betydelig overuttrykt i høyverdig serøs karsinom, endometrioid karsinom, klarcellet karsinom, og serøse borderline tumorer (Figur 1a). Spesielt er atom P44 ekspresjon signifikant høyere i eggstokkreft vev enn i deres matchede benigne motstykker, som støtter den funksjonelle rolle av kjerne P44 i tumorgenese av eggstokkreft. Tilsvarende, western blot analyse viste sammenlignbare nivåer av P44 mellom OVCAR-3 og SKOV-3 (figur 1C) når cellene ble dyrket i komplett medium (med fenol rød og ikke-trekull strippet serum), men i androgen-supplert medium, immunfluorescens farging viste at P44 er uttrykt ved høyeste nivå i kjernen (figur 2). Det vil være av stor interesse å avgjøre i fremtidige studier om nivåene av ER, AR og P44 uttrykk er forbundet med spesifikke histologiske typer eggstokkreft, svulst klasse, stadier, og overlevelse.
For ytterligere å definere funksjonelle rollene til P44, undersøkte vi P44 i godartede og ondartede OSE cellelinjer i nærvær og fravær av androgen eller østrogen. Vi brukte godartet immortalisert eggstokk overflate epitelisk cellelinje T29 og to maligne eggstokk-kreft-cellelinjer Skov-3 og OVCAR-3 i denne studien. Det ble rapportert at SKOV3 ikke svare på østrogen mens OVCAR-3 celler reagerer på østrogen stimulering. Etter avtale, har vi funnet at østrogen ikke påvirker P44 lokalisering, celleproliferasjon, eller invasjon i Skov-3 celler, mens østrogen forbedret P44 kjernefysiske lokalisering, celleproliferasjon, og invasjonen i OVCAR-3 celler. Mens både ERα og ERβ er uttrykt i SKOV-3-celler (figur 1C), kan SKOV-3 manglende respons på østrogen være på grunn av mutasjon i ERα [27], noe som indikerer at funksjonen til P44 kan være mediert ved ERα, i stedet for ERβ.
P44 betydelig forbedret ondartet OSE celleproliferasjon og invasjon i nærvær av androgen eller østrogen, noe som indikerer at ekspresjon av AR eller VR er nødvendig for P44 for å stimulere mitogenese og invasjon (figur 1C). P44-mediert tumorigent funksjon synes å være forskjellig mellom prostata og eggstokkreft. I prostata cancer, inhiberer kjerne P44 celleproliferasjon i en androgen-avhengig måte. I eggstokkreft cellelinje OVCAR-3, fremmer kjerne P44 cellevekst. Spesielt skal det bemerkes at atom P44 fremmer invasjon i både androgen og østrogen media. Resultatene fra ovariekreft er tilsvarende det som vi observerte i bryst. Brystkreft, fremmer kjerne P44 tumorcelleproliferasjon i en østrogenavhengig måte [24]. Selv om våre siRNA-mediert knockdown eksperimenter vist at vår P44 antistoff spesifikt gjenkjent et enkelt protein arter i prostata, bryst og eggstokk, kan vi ikke helt utelukke muligheten for at sterkt beslektet, men funksjonelt forskjellige proteiner (f.eks spleisevarianter av P44) fungere som distinkte hormon reseptor kofaktorer i hver av disse vev. Med dette forbeholdet, våre funn tyder på at P44 kan også fungere gjennom en ER-mediert funksjonell vei i eggstokkvev.
I sammendraget, våre data indikerte atom P44 er involvert i eggstokkreft spredning og invasjon. Disse prosessene er regulert av androgen og østrogen. P44 kan være et potensielt mål for behandling av eggstokkreft.
Materialer og metoder
Case utvalg, TMA og IHC
Sakene ble samlet etter kirurgi ved Northwestern Memorial Hospital og New York University fra 1996 til 2009. Godkjenninger av Institutional Forsk (IRB) fra begge institusjoner ble oppnådd (unntatt). En total av 105 tilfeller av kreft i eggstokkene ble oppsamlet for denne studien (tabell 1). Alle PSC og EMC saker ble hentet fra NYU vev bank og alle andre typer eggstokkreft, samt normal kontroll vev, ble hentet fra NWU vev bank. Dette inkluderte histologisk diagnose av høyverdig papillær serøs karsinom (PSC, N = 32), serøs borderline tumor (SBT, N = 9), endometrioid ovarialcancer (EMC, N = 34), mucinous ovarialcancer (MUC, N = 15 ) og klarcellet ovarialcancer (CCC, N = 15). Normal kontroll vev som brukes i denne studien inkluderte: 30 normale egglederne (FT, de nærmeste normale kontroller for høy klasse serøs karsinom), 20 normale endometria (EM, de nærmeste normale kontroller for endometrioid karsinom), og 28 normale eggstokker (OSE, eggstokkreft overflaten epitel, som daglig kontroll vev).
Alle karsinom var eggstokkene primære. Tissue microarray (TMA) Preparatet er beskrevet i vår tidligere studie [33]. I korte trekk, ble 0,6 og 1 mm vev kjerner samlet inn fra hvert tilfelle av godt bevarte tumorsnitt og høy tetthet TMA ble utarbeidet i to receipting blokker.
Produksjon, affinitet rensing, og spesifisiteten av kanin polyklonale P44 antistoff som brukes, er blitt beskrevet tidligere [34]. Preimmunt serum ble benyttet som kontroll. Spesifisiteten av P44-antistoffet ble bekreftet ved et siRNA-analyse som viste redusert ekspresjon P44 til P44 RNA-interferens [21]. De relative nivåer av P44 uttrykk ble scoret semi-kvantitativt ved kombinasjon av immunointensity [0 (negativ), 1+ (svak), 2+ (svak), 3+ (moderat), og 4+ (sterk) uttrykk] og immunopercentage ( 1 som 0-10%, 2 som 10-50%, 3 som 50-75% og 4 som 75-100%)]. Statistiske analyser ble utført ved t-test.
Cellekultur og celleproliferasjonsanalyse
cellelinjene SKOV-3 [35] og OVCAR-3 [28] ble oppnådd fra American Type Culture Samling. Godartet immortalisert ovarie overflate epitelcellelinje T29 [36], som tidligere beskrevet i detalj, ble opprettholdt i medium 199 og MCDB105 (Sigma). De to ovarian cancer cellelinjer Skov-3 og OVCAR-3 ble dyrket i McCoys 5a-medium (Invitrogen) og henholdsvis RPMI 1640 (Gibco), supplert med 10% FBS og 1 U /ml penicillin og 1 ug /ml streptomycin. For å måle den formeringshastigheten, 2 x 10
4-celler ble utsådd i 6-brønners plater. Ved de passende tidspunkter ble cellene behandlet med 0,25% trypsin og 0,38 mg /ml EDTA (Gibco) og tellet ved bruk av et hemocytometer (Reichert).
Western blot-analyse
Western blot-analyse var brukes til å sjekke P44, AR, ERα, og ERβ uttrykk i fullstendig medium, knockdown av P44, og overekspresjon av P44 plasmider (pBabe vektor og pBabeNLSp44) i eggstokkene cellelinjer. Cellene ble enten dyrket i 10 cm skåler, 6 godt eller 24 brønners plater. Lyseringsbuffer inneholdende protease inhibitor cocktail (Sigma) i 1:100-forholdet ble tilsatt til pelletene for resuspensjon. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse, og egnet mengde av protein ble påsatt for elektroforese på en SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE). Proteinet ble deretter overført til nitrocellulosemembran for Western blot-analyse. Membranene ble blokkert i 1 time i 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann og Tween 20 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20). Blottene ble deretter inkubert med antistoffer dannet mot AR, ERα, ERβ (Santa Cruz Biotechnology), P44 og β-aktin i 2 timer ved værelsestemperatur, vaskes med Tris-bufret saltvann Tween 20 tre ganger. Etter vaskinger ble blottene inkubert i 2 timer med passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (GE Healthcare). Proteinbåndene ble påvist ved hjelp av forbedret chemiluminescence kit (GE Healthcare).
Immunofluorescent mikros
T29, Skov-3, og OVCAR-3-celler ble dyrket ved to densities- 3 × 10
4 og 1 x 10
4 per brønn i tre ulike medieforhold (hormon-fri, androgen og østrogen) på kamret lysbilder. Cellene ble først skylt tre ganger i PBS og fiksert i 20 minutter med 4% paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur. Etter fiksering ble cellene permeablized med metanol og aceton (01:01) og inkuberes ved -20 ° C i 20 minutter. Cellene ble vasket 3 ganger i PBS og blokkert i en time med en oppløsning av 5% BSA i TBS-T. Cellene ble deretter inkubert med primært antistoff P44 (1:250) i 2 timer ved romtemperatur. Etter inkubering med primært antistoff, ble cellene farget med rhodamin-konjugert kanin-polyklonalt antistoff (1:500) (Abcam) i 1 time i mørke ved romtemperatur. For telleren farging DAPI ble påført (1:1000) og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter i mørket. Den intracellulære lokalisering av P44 ble deretter undersøkt ved hjelp av Nikon Digital DXM1200 F mikroskop med Nikon-ACT-programmet.
RNA interferens analysen
Tre sirnas mest effektive i å redusere nivået av P44-proteinet i eggstokkene celler ble slått sammen i ekvimolare mengder og anvendt i etterfølgende forsøk generelt ved konsentrasjon på 100 nM (tabell 2). Egge siRNA (Ambion) ble anvendt som en kontroll.
Celler ble dyrket i 6-brønners plater til ønsket konfluens i 2 ml passende medium inneholdende serum uten antibiotika. 100 nM av siRNA ble fortynnet i 423 ul Opti-MEM medium (Gibco) uten serum, etterfulgt av 75 ul HiPerfect reagens (Qiagen) og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur for å tillate dannelse av kompleksene transfeksjonsteknikker. Cellene ble deretter inkubert med transfeksjonsagensene komplekser under sine normale betingelser i 48 timer
Elektroporering
Tre plasmider -. PBabe vektor, pBabeNLSp44 [21], og GFP (kontroll) – ble transfektert inn i celler ved hjelp av elektroporering. Cellene ble dyrket i tre tilstander – hormon-fritt, androgen (10 nM), og østrogen (10 nM). Cellene ble dyrket til 80% konfluens. De pelleterte cellene ble deretter resuspendert i 100 ul Nucleofactor oppløsning (82 ul av oppløsning 18 pl av supplement oppløsning) (Lonza) for hver reaksjon. Fire ng av plasmidet ble deretter kombinert og celle /DNA-suspensjonen ble overført til elektroporering kyvette. Nucleofactor program anbefalt for hver cellelinje av produsenten, ble valgt og anvendt. Etter elektroporering kyvetten ble fjernet, og cellene umiddelbart overført til 10 ml av tilsvarende medium med FCS og inkubert i 48 timer under normale vekstbetingelser.
Luciferase-analyse
In vivo-reporter transkripsjon Analysen ble utført bruke Dual-reporter Luciferase Assay System (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Den lysmengde ble målt ved Lumat LB9507 luminometer (Berthold). Vektorene pcDNA-langt, pcDNA-ERα, og reporteren vektorer ER-luc og pGL3-are4 ble kjøpt fra Addgene.
Matrigel invasjonen assay
Celler ble resuspendert i medium uten serum på
