Abstract
Genomisk kopi nummer avvik (CNAS) i magekreft har allerede vært mye preget av rekke komparativ genomisk hybridisering (matrise CGH) analyse. Men involvering av genomisk CNAs i ferd med submucosal invasjon og lymfeknutemetastase i begynnelsen av magekreft er fortsatt dårlig forstått. I denne studien, for å løse dette problemet, vi samlet totalt 59 tumorprøver fra 27 pasienter med submukøse-invasiv mage kreft (SMGC), analyserte sine genomiske profiler etter matrise CGH, og sammenlignet dem mellom sammenkoblede prøver av slimhinne (MU) og submucosal (SM) invasjon (23 par), og SM invasjon og lymfeknute (LN) metastase (9 par). Til å begynne med vi antatt at kjøpet av spesifikk CNA (e) er viktig for disse prosessene. Imidlertid observerte vi ingen signifikant forskjell i antallet genomiske CNAs mellom paret MU og SM, og mellom paret SM og LN. Videre kunne vi ikke finne noen CNAs spesifikt knyttet SM invasjon eller LN metastasering. Blant de 23 tilfellene som ble analysert, 15 hadde noen lignende mønster av genomisk profilering mellom SM og MU. Interessant, 13 av de 15 tilfellene viste også noen forskjeller i genomisk profiler. Disse resultatene tyder på at mesteparten av SMGCs er sammensatt av heterogene subpopulasjoner avledet fra det samme klonal opprinnelse. Sammenligning av genomisk CNAs mellom SMGCs med og uten LN metastase avslørt at gevinst på 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 og forsterkning av 17q21 var hyppigere i metastatisk SMGCs, noe som tyder på at disse CNAs er relatert til LN metastasering av tidlig magekreft. I konklusjonen, våre data tyder på at generasjonen av genetisk distinkte subkloner, snarere enn oppkjøp av spesifikke CNA ved MU, er en integrert del av prosessen med submucosal invasjon, og at subkloner som kjøper gevinst på 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 eller forsterkning av 17q21 er sannsynlighet for å bli metastatisk
Citation. Kuroda A, Tsukamoto Y, Nguyen LT, Noguchi T, Takeuchi jeg, Uchida M, et al. (2011) Genomisk Profilering av submukøse-invasiv Gastric Cancer av Array-Based Comparative Genomisk Hybridisering. PLoS ONE 6 (7): e22313. doi: 10,1371 /journal.pone.0022313
Redaktør: Giuseppe Novelli, Tor Vergata-universitetet i Roma, Italia
mottatt: 25 februar 2011; Godkjent: 19 juni 2011; Publisert: 21.07.2011
Copyright: © 2011 Kuroda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis av departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur fra Japan, og Grants-i-Aid for Unge Forskere (B), nr 20790286 (https://www.mext.go.jp), og forskningsfond ved skjønn av presidenten, Oita University (https://www.oita-u.ac.jp/english/index.html). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er fortsatt en av de mest dødelige sykdommer, til tross for sin jevnt nedadgående trend over hele verden. Totalt sett dødelighet på grunn av magekreft er anslått til å være 700.000 tilfeller årlig (10,4% av alle kreftrelaterte dødsfall), ranking andre bare etter lungekreft [1]. Klinisk resultat er bedre når tumorcellene er begrenset til slimhinnen. Imidlertid, når tumorcellene passere gjennom muscularis mucosa, blir det kliniske resultatet dårligere, ettersom risikoen for lymfeknutemetastase, som er en av de viktigste prognostiske faktorer i magekreft, signifikant øker til 18% eller mer, sammenlignet med mindre enn 4% når tumorcellene være begrenset på mukosa [2], [3]. Derfor er en bedre forståelse av de som er involvert i prosessen med å submucosal invasjon mekanismer som kreves.
Det er i dag anerkjent at flertrinns akkumulering av genetiske avvik er ansvarlig for start og progresjon av ulike kreftformer [4]. Faktisk er det blitt rapportert at det totale antallet av genomiske avvik øker med tumorprogresjon i forskjellige typer tumorer [5]. Vi fant også at frekvensene av gevinster på 20Q, 20p12, 1q42, 3q27 og 13q34 og tap på 4q34-qter, 4p15, 9p21, 16q22, 18q21 og 3p14, som hadde vært hyppig påvist i magekreft, var hyppigere i AGC enn i EGC [6]. I mellomtiden har det nylig blitt rapportert at, i løpet av tumorprogresjon, en enkelt svulst celle opprinnelsesland utvikler seg til flere genetisk forskjellige subpopulasjoner gjennom oppkjøpet av et bredt utvalg av genomiske avvik. Den resulterende tumormasse, som består av genetisk heterogene subpopulasjoner, anses å være resistente mot en rekke miljømessige seleksjonstrykk [7], [8], [9], [10].
Array-baserte komparativ genomisk hybridisering (matrise CGH) gir informasjon om genomisk kopinummer avvik (CNAS) over hele genomet [11]. Videre er CGH også anvendelig til studiet av intratumoral genomisk heterogenitet [12], [13], [14], [15]. Selv om flere grupper har brukt matrise CGH til å identifisere regioner som bærer onkogene eller tumorundertrykkende gener i magekreft [6], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25], CNAs relatert til submucosal invasjonen og den tidlige fasen av lymfeknutemetastase har ennå ikke bestemt. Videre, siden de fleste tidligere studier av CNAs i magekreft har analysert bare en prøve for hver svulst, har detaljer om heterogenitet av genomisk profiler innenfor et enkelt magekreft holdt seg stort sett uklart.
I denne studien har vi undersøkt involvering av genomiske CNAs i ferd med å submucosal invasjon og lymfeknutemetastase i tidlig magekreft. For dette formål samles vi tumorprøver fra forskjellige partier av samme tumor separat, analyserte deres genomiske profiler etter matrise CGH, og sammenlignet de genomiske profilene mellom parede prøver av slimhinne (MU) og submucosal (SM) deler, og SM parti og lymfe node (LN) metastaser. Videre, ved å sammenligne CNAs mellom metastatisk og ikke-metastatisk submukøse-invasiv mage kreft (SMGC), identifiserte vi kandidaten CNAs relatert til LN metastasering av tidlig magekreft.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Denne studien ble godkjent av etisk komité for Oita universitetssykehus (Godkjenning P-05-04). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter og /eller deres familier.
Pasienter, vevsprøver og utvinning av genomisk DNA
Tjue sju SMGCs ble kirurgisk reseksjon ved Oita universitetssykehus. Vevssnitt ble kuttet fra formalinfiksert, parafininnebygd vev, og farget med hematoksylin-eosin (HE) for histologisk analyse og med toluidinblått (Wako, Osaka, Japan) for utvinning av genomisk DNA (figur 1A). Ved hjelp av laser-capture mikrodisseksjon, samlet vi 1 til 3 prøver fra MU, SM og /eller metastatisk LN parti av samme SMGC vev separat. Som et resultat, var vi i stand til å oppnå et totalt 59 prøver fra 27 pasienter (tabell 1). Alle prøver inkludert en andel av tumorceller som overstiger 70% av totalen. Genomisk DNA ble ekstrahert i henhold til standarden proteinase K-fordøyelse metode, etterfulgt av fenol /kloroform-ekstraksjon. Ikke-neoplastiske gastrisk vev fra samme pasient ble anvendt som en normal kontroll.
(A) HE (a, c og e) og toluidinblått (b, d og f) farging av huset 18 i lav- (a og b) og høy (c, d, e og f) utsikt makt. Vevssnitt etter mikrodisseksjon er vist i (d) og (f). (B) Oversikt over eksperimentell design. Først ble det genomiske profiler av 23 MU prøver (a) sammenlignet med de av sammenkoblede 23 SM prøver (b). Deretter ble de genomiske profilene til 9 SM prøver (c) sammenlignet med de tilsvarende sammenkoblede 9 LN prøver (d). Til slutt ble det genomiske profiler sammenliknet mellom SM av 12 tilfeller med LN metastase (e) og SM-15 tilfeller uten metastase (f). De enkelte prøver av (a) – (b) er angitt med superscripts i tabell 1.
Array CGH og dataanalyse
Array-CGH analyse ble utført ved hjelp av 44 K oligonukleotid CGH arrays (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, California). Merking og hybridisering ble utført i henhold til protokollen gitt av Agilent Technologies Inc. I korthet 0,85 til 2 ug av tumor-DNA og en lik mengde kontroll-DNA ble kuttet med Alul og Rsal (Promega, Madison, WI, USA) i 24 timer ved 37 ° C. Det fordøyde tumor og kontroll-DNA ble merket med henholdsvis Cy5-dUTP og Cy3-dUTP, ved hjelp av en Genomisk DNA Labeling Kit Plus (Agilent), renset med Microcon YM-30 filter (Millipore, Billerica, MA, USA), og konsentrert til 80,5 mL. Like mengder av tumor og kontroll-DNA ble deretter slått sammen og blandet med human Cot-1 DNA, løst i hybridiseringsbuffer (Agilent Oligo aCGH Hybridisering Kit; Agilent Technologies), denaturert og hybridisert til CGH matrisen ved 65 ° C i 24 timer. Glass ble vasket og deretter skannes i henhold til produsentens anvisninger.
Microarray bildene ble analysert ved hjelp av egenskapsuttrekking v.9.5.3.1 (Agilent Technologies) med lineær normalisering (protokoll CGH-v4_95_Feb07), og den resulterende data ble importert til DNA Analytics v.4.0.81 (Agilent Technologies). Etter normalisering av rådata, ble log2ratio av Cy5 (tumor) til Cy3 (Control) beregnet. Avvikende regioner ble bestemt ved ADM-2-algoritmen ved en terskel på 8,0. For å oppdage gevinster og tap, satt vi verdiene av parametrene for aberrasjon filtre som: minimum antall prober i region 2, minimum absolutt gjennomsnittlig log2ratio for regionen 0,26, maksimalt antall avvikende regioner 10000, og prosentpene per funksjon 0. På samme måte oppdage presiseringer og slettinger, setter vi verdiene av parametrene for aberrasjon filtre som: minimum antall prober i region 2, minimum absolutt gjennomsnittlig log2ratio for regionen 1,0, maksimalt antall avvikende regioner 10000, og prosentpene per funksjon 0. data generert av sonder kartlagt til X og Y kromosomer ble eliminert. Genomiske posisjoner av prober og avvikende regionene var basert på UCSC mars 2006 menneske referansesekvensen (hg18) (NCBI bygge 36 referansesekvens). Alle data er MIAME kompatibel (https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html) og rådata er blitt deponert i MIAME-kompatibel GEO database (http: //www.ncbi.nlm.nih gov /geo /, tiltredelse antall GSE26800). En oversikt over eksperimentell design er vist i figur 1B. For sammenligning av CNAs mellom sammenkoblede MU og SM partier, har vi valgt 23 tilfeller fra de totalt 27 (figur 1 B, a og b), ettersom de genomiske profilene til begge delene i disse tilfellene hadde blitt analysert. På samme måte for sammenligning av CNAs mellom paret SM og LN deler, valgt vi ni av de 12 tilfellene med en LN parti (figur 1 B, c og d). Videre, sammenlignet vi frekvensene av CNAs mellom de tilfellene med og uten LN metastasering (figur 1 B, e og f).
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere [21] ved å bruke anti- EGFR (1:100, Dako, Glostrup, Danmark), anti-CTTN (1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA) og anti-ErbB2 (1:800, Cell Signaling Technology, Berverly, MA, USA) antistoffer.
Statistisk analyse
Paret t-test og Fishers eksakte test ble brukt. Forskjeller på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Genomisk klonalitet og heterogenitet i slimhinnene og submukøse deler av SMGC
For å undersøke involvering av genomiske CNAs i ferd med å submucosal invasjon, vi først sammenlignet med antallet CNAs mellom sammenkoblede MU og SM prøver fra de 23 SMGCs (figur 2A). Elleve av de 23 tilfellene viste en økning i antall CNAs i SM partiet sammenlignet med MU partiet, 11 viste en reduksjon i antall, og de resterende ett tilfelle viste ingen endring (Figur 2A). Som et resultat, var det ingen statistisk signifikant forskjell i antallet CNAs mellom sammenkoblede MU og SM partier (figur 2A, ikke signifikante i paret t-test). Videre, for å identifisere CNAs spesifikt knyttet submucosal invasjon, sammenlignet vi de gjennomsnittlige frekvensene av CNAs i MU del med de i sammen SM del (figur 2B), men klarte ikke å finne noen.
(A) sammenligning av antall CNAs i MU og SM deler. For denne analysen ble prøvene angitt med «a» og «b» i tabell 1 brukes. (B) Genome-wide frekvenser av CNAs i MU og tilsvarende paret SM i 23 tilfeller. Horisontale linjer: oligonukleotidprober er vist i rekkefølge fra kromosomer 1 til 22. Innenfor hvert kromosom, blir kloner er vist i rekkefølge fra p telomere til q telomere. Vertikale linjer: frekvens (%) av gevinster (positive akse) og tap (negativ akse) er vist for hver sonde. (C-F) Representative genomisk profil MU og SM partier av SMGC. Hele genomiske profiler av den parede MU (ovenfor) og SM (nedenfor) partier fra tilfelle 4 er vist i (C). Detaljerte genomiske profiler av Chr9, Chr7 og Chr11 er vist i (D), (E) og (F), respektivt. Horisontale linjer ovenfor sentrum representerer regioner i gevinst, og de under midten representerer regionene i tap. Både MU og SM viser lignende genomisk mønstre i kromosom 9 p (D). Imidlertid forsterkning av 7p12, hvor EGFR-genet befinner seg, blir detektert bare i MU parti (E), og forsterkning av 11q13, hvor CTTN gen befinner seg, blir detektert bare i den SM parti (F).
for å undersøke forskjellen i CNAs mellom MU og SM fra samme svulst, sammenlignet vi genomiske profiler av paret MU og SM i hvert enkelt tilfelle. En representant tilfelle er vist i figur 2C, D, E og F. Den parede MU og SM prøvene delt et lignende mønster av genomisk aberrasjon i kromosom 9 p (figur 2D). Imidlertid var det forskjellige genomiske aberrasjoner i kromosomer 7p og 11 i det samme tilfellet, som vist i Figur 2E og F. Amplifisering av 7p12 ble kun observert i MU, men ikke i SM (figur 2E), og forsterkning av kromosom 11 ble observert bare i SM, men ikke i MU (figur 2F). Disse resultatene antydet at tumorceller i MU og SM i dette tilfellet var klonalt beslektet, men sammensatt av genetisk heterogene subpopulasjoner.
neste, for å bestemme om tumorcellene som viser forsterkningen av 7p12 og de som viser forsterkningen av 11q13 av ved 4 ble virkelig begrenset til MU og SM, henholdsvis, analyserte vi vevssnitt fra tilfelle 4 av immunhistokjemi med antistoffer mot EGFR, som ble amplifisert bare i MU partiet (figur 2E), og CTTN, som ble oppnådd bare i SM porsjon (figur 2F). Som vist i figur 3, ble positive immunreaktivitet for EGFR begrenset til MU partiet (figur 3D, E og F), mens bare SM partiet viste sterk immunoreaktivitet for CTTN (figur 3 G, H og I). Disse resultatene antydet at, i tilfelle fire, tumorcellene med 7p forsterkning i MU kunne ikke har invadert SM, mens de med kromosom 11 forsterkning kan ha invadert SM.
HE farging (A-C), og immunhistokjemi med antistoffer mot EGFR (D-F) og CTTN (G-i) er vist i lav- (A, D og G) og høy- (B, C, E, F, H og i) strømvisninger. EGFR, som ble amplifisert bare i MU parti (se figur 2E), er sterkt positiv kun i MU parti (D, E og F). Samtidig uttrykk for CTTN, som ble vunnet bare i SM (se figur 2F) viser høyere positivitet i SM enn i MU (G, H og I).
Deretter analyserte vi genomisk klonalitet og heterogenitet i MU og SM i andre tilfeller. Blant de andre 22 tilfeller, 14 viste et lignende mønster av genomisk aberrasjon i MU og SM (Tall S1 (6 tilfeller) og S2 (8 tilfeller)), noe som tyder på at kreftceller i MU og SM av disse tilfellene var clonally relatert . Interessant, 12 av de 14 tilfellene viste en signifikant forskjell i genomisk profilmønsteret mellom MU og SM (Tall S1 (6 tilfeller) og S2 (6 tilfeller)), noe som tyder på at disse sakene ble også sammensatt av genetisk heterogene subpopulasjoner.
Genomisk klonalitet og heterogenitet i primær (SM) og metastatisk (LN) deler av SMGC
Neste, for å undersøke involvering av CNAs i ferd med lymfeknutemetastase av tidlig magekreft, sammenlignet vi nummer av CNAs mellom paret primære (SM) og metastatisk (LN) deler av 9 SMGCs (Figur 4A). Tre av de 9 tilfellene viste en økning i antall CNAs i LN partiet, mens de resterende 6 tilfeller viste en nedgang (figur 4A). Som et resultat, var det ingen signifikant forskjell i antall CNAs mellom de sammenkoblede SM og LN partier (figur 4A, ikke signifikante i paret t-test). Videre, for å identifisere CNAs spesifikt knyttet LN metastaser, sammenlignet vi de gjennomsnittlige frekvensene av CNAs i SM med de i den parede LN del (figur 4B), men klarte ikke å finne noen.
(A) Sammenligning av antall CNAs i SM og LN deler. For denne analysen ble prøvene angitt med «c» og «d» i tabell 1 brukes. (B) Genome-wide frekvenser av CNAs i SM og tilsvarende paret LN i 9 tilfeller. Horisontale linjer: oligonukleotidprober er vist i rekkefølge fra kromosomer 1 til 22. Innenfor hvert kromosom, blir kloner er vist i rekkefølge fra p telomere til q telomere. Vertikale linjer: frekvens (%) av gevinster (positive akse) og tap (negativ akse) er vist for hver sonde. (C, D og E) Representative genomisk profil av SM og LN partier av SMGC. Hele genomiske profiler av paret SM (ovenfor) og LN (nedenfor) partier fra Case 9 er vist i (C). Detaljerte genomiske profiler av Chr8 og Chr14 er vist i (D) og (E), respektivt. Horisontale linjer ovenfor sentrum representerer regioner i gevinst, og de under midten representerer regionene i tap. Både SM og LN viser lignende genomisk mønstre i kromosom 8 (D). Imidlertid er gevinst på kromosom 14q oppdaget bare i SM del (E).
For å undersøke forskjellen i CNAs mellom SM og LN av samme tumor, vi sammenlignet de genomiske profiler av paret SM og LN prøver i hvert enkelt tilfelle. Et representativt tilfelle er vist i figur 4C, D og E. Den parede SM og LN prøvene delt et lignende mønster av genomisk aberrasjon i kromosom 8 (figur 4D), noe som tyder på at begge deler ble avledet fra den samme klonal opprinnelse. Imidlertid gevinst på kromosom 14 ble kun observert i SM, men ikke i LN (figur 4E). Resultatene antydet at kreftceller i SM og LN deler av denne saken var clonally beslektet, men består av genetisk heterogene subpopulasjoner.
Vi har også analysert genomisk klonalitet og heterogenitet i SM og LN deler fra andre saker. Blant de andre 8 tilfeller, 5 viste et lignende mønster av genomisk aberrasjon i både SM og LN (figur S3), noe som tyder på at paret SM og LN deler fra disse tilfellene var clonally relaterte. Videre 4 av 5 tilfeller viste en signifikant forskjell i genomisk profilmønsteret mellom SM og LN (figur S3), noe som tyder på at disse sakene ble også sammensatt av genetisk heterogene subpopulasjoner.
Sammenligning av genomisk profiler mellom metastatisk og ikke-metastatisk SMGC
Siden ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet i de frekvenser av CNAs mellom paret SM og LN partier (figur 4B), en hypotese om at vi subpopulasjoner som bærer metastase-relaterte CNAs kan være til stede i den SM så vel som LN del av metastatisk SMGC. Derfor vi neste forhold frekvensene av CNAs i SM delen av metastatiske SMGCs (12 tilfeller) med de ikke-metastatisk SMGCs (15 tilfeller), og fant ut at gevinster på 11q13, 11q14, 11q22 og 14q32 ble påvist oftere i metastatisk SMGCs enn i ikke-metastatisk SMGCs (figur 5A og tabell 2). Vi sammenlignet også frekvensene på høyt nivå kopi nummer avvik, for eksempel forsterkning og sletting, mellom de to gruppene, og funnet ut at forsterkning av 17q21 ble påvist oftere hos pasienter med metastatisk SMGCs enn hos ikke-metastatisk SMGCs (Tabell 3 og Tabell S1) . Disse resultatene antydet at gevinster på 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 og forsterkning på 17q21 er involvert i LN metastasering av SMGCs.
(A) Frekvens (%) av gevinster (positive akse) og tap (negativ akse ) i 12 SMGCs med lymfeknutemetastase (ln (+) 12 saker) og 15 SMGCs uten lymfeknutemetastase (LN (-) 15 tilfeller) er vist. For denne analysen ble prøvene angitt med «e» og «f» i tabell 1 brukes. (B) Immunhistokjemi med anti-ErbB2-antistoff. Primær SM (a, b og c) deler er immunfarget med antistoff mot ErbB2. Saker med forsterkning på 17q21 viste sterk immunoreaktivitet for ErbB2 (a og b), mens tilfeller uten en slik forsterkning ikke (c).
minimal felles region av forsterkning på 17q21 inneholdt 5 gener som er oppført i tabell 3. Siden ErbB2, en velkjent onkogen [26], [27], [28], ble inkludert i listen, gjennomførte vi immunhistokjemisk analyse av ErbB2 overuttrykk i alle 27 tilfeller. Som vist i figur 5B, tilfeller med 17q21 forsterkning oppviste sterk farging for erbB2 i SM, mens ett tilfelle uten forsterkning ikke. Videre ErbB2 overekspresjon var signifikant assosiert med 17q21 forsterkning (tabell 4), tyder på at ErbB2 forsterkning og overekspresjon kan være involvert i LN metastasering av en andel av SMGCs.
Diskusjoner
det er allment akseptert at en svulst oppstår fra en enkelt celle. Men hvordan det utvikler seg til et avansert stadium fortsatt blir debattert. Tidlige studier av tykk- og bukspyttkjertel kreft førte til en forestilling om at utviklingen og progresjonen av disse kreftformene er forbundet med akkumulering av kromosomale avvik, referert til som flertrinns tumorigenesis modellen [29], [30]. For eksempel er det genomiske avvik av APC, KRAS, SMAD4 og TP53 gener involvert i adenom-karsinom-sekvensen i tykktarmen [29]. Imidlertid har slike studier fokusert på bare en andel av tumorrelaterte gener, og neglisjert rollen til de fleste andre gener. Videre denne modellen var ikke i stand til å vurdere betydningen av intratumoral genomisk heterogenitet for svulst utvikling og progresjon. I mellomtiden har nyere studier førte til etableringen av en annen modell, utpekt klonal evolusjon modell [7], [9], [10]. I denne modellen utvikler et enkelt klon i flere forskjellige subpopulasjoner gjennom oppbygging av forskjellige genetiske abnormiteter. Den dominerende populasjonen kan erstattes av forskjellige underpopulasjoner i en enkelt tumormasse gjennom virkningen av miljøseleksjonstrykk og /eller stadium av tumorprogresjon. Som en konsekvens, kan flere genetisk heterogene cellepopulasjoner eksistere innenfor et enkelt tumormasse. Bevis for intratumoral genetisk heterogeniteten i forbindelse med klonal utvikling er blitt oppnådd for en rekke forskjellige faste tumorer, inkludert prostata kreft [14], Barretts øsofagus [31], eggstokk-kreft [32], [33], livmorhalskreft [34], brystkreft [15], [35], neuroblastom [36], bukspyttkjertelkreft [13], [37], og tykktarmskreft [38]. Interessant, i en studie av dødelig prostatakreft, ingen CNAs spesielt knyttet til området av metastaser ble funnet [14]. Tilsvarende, i en studie av høyverdig serøs ovarialcancer, var det ingen bevis for en sammenheng mellom kjøp av cisplatin motstand og spesifikke CNAs [39]. Disse resultater antyder at den flertrinns tumorgenese modellen, hvor bestemte avvik spiller viktige roller i tumorutvikling og progresjon, ikke alltid representere den måten som tumorer skaffe sin ondartet karakter. I denne studien har vi i utgangspunktet en hypotese om at oppkjøpet av spesifikk CNA (e) kan være viktig for submucosal invasjon. Men vi klarte ikke å finne noen CNAs som var hyppigere i SM enn i den sammenkoblede MU prøven. Videre har vi også observert noen signifikant forskjell når det gjelder antall CNAs i de sammenkoblede MU og SM porsjoner. Men vi fant at flertallet av SMGCs var sammensatt av clonally-relaterte, men genetisk forskjellige delpopulasjoner, noe som tyder på at klonal evolusjon kan oppstå under utviklingen av magekreft. Tatt sammen, selv om antallet tilfeller undersøkt var begrenset, våre funn antydet at genereringen av genetisk forskjellige subpopulasjoner i stedet for anskaffelse av spesifikk CNAs i MU partiet kan være viktig for prosessen med submucosal invasjon. På basis av disse funnene foreslår en hypotetisk modell for prosessen med SM invasjon og metastasering LN av tidlig magekreft (figur 6). For å bekrefte denne hypotesen, vil videre studier med større prøver være nødvendig.
Den horisontale linje i midten av figuren angir muscularis mucosa. Grå sirkler indikerer tumorceller. Fargede små sirkler indikerer genomiske avvik. Gastriske tumorer oppstår fra en enkelt celle med en (eller noen) genomisk avvik (a). Den eneste klon deretter prolifererer mer effektivt enn sine naboer (b). Under prosessen med spredning i den gastriske slimhinne, noen tumorceller skaffe nye mutasjoner vilkårlig. Deretter danner hver av genetisk distinkte subkloner en unik undergruppe (c og d). Blant disse subpopulasjoner, kan bare en (e) med kapasitet for invasjonen passere gjennom mukosa muscularis og proliferere i submukosa (d og d «). Viktigere, kan andre kloner ikke invadere i submukosa (c), men kan proliferere og danne subpopulasjoner genetisk distinkte fra den invasive en. Etter invasjon, utvikler en (eller noen) subpopulasjon igjen ytterligere genetisk distinkte subpopulasjoner gjennom klonal evolusjon (e og f), og en med kapasitet for metastasering kan spre seg til lymfeknuter (f og f «). Således blir den primære tumormasse heterogen som en konsekvens av klonal evolusjon.
Våre data indikerer at SMGCs er sammensatt av genetisk heterogene subpopulasjoner er viktige i forbindelse med magekreft forskning og behandling, fordi tumor heterogenitet gjør utvikling av effektive medikamenter vanskelig. Siden genomiske CNAs ha en innvirkning på genekspresjonsprofiler i forskjellige cancere [16], [21], [40], [41], [42], [43], er det mulig at hver av de genetisk distinkte subpopulasjoner i et enkelt svulsten kan variere i både biologisk atferd og respons på kreftmedisiner, inkludert molekylære målsøkende midler. Cooke et al. har foreslått at klargjøring av forskjellige genetiske subpopulasjoner i et enkelt svulst ville tillate effektiv terapi ved anvendelse av et spesifikt middel rettet mot et felles genomisk aberrasjon eller kombinerte midler rettet mot unike genomiske aberrasjoner i hver av de forskjellige subpopulasjoner [39]. Denne strategi kan også anvendes for behandling av mavekreft.
Blant de 23 tilfellene vi analysert, 15 viste en klonal forhold mellom MU og SM deler. Videre 13 av de siste 15 tilfeller viste også forskjeller i CNAs mellom de to regionene, noe som tyder på at klonal evolusjon oppstår ofte i tidlig fase av magekreftutvikling. Forholdet mellom de sammenkoblede MU og SM prøver i de andre 8 tilfeller uten felles CNAs forble uklart. To mulige forklaringer på dette kan bli foreslått. Det ene er at svulster i sammenkoblede deler, som ikke har felles CNAs, utviklet uavhengig av hverandre. Den andre er at de sammenkoblede delene delt andre typer genetiske avvik, for eksempel mutasjoner og trans, som ikke kan oppdages av matrise CGH. I sistnevnte tilfelle, kan neste generasjons sekvensering være nyttig for å analysere slike forhold.
I denne studien gevinster ved 11q13, 11q14, 11q22 og 14q32, og forsterkning på 17q21, var hyppigere i SM delen av metastatisk SMGCs enn i de ikke-metastatisk SMGCs. Interessant, er gevinster på 11q13 og 14q32 velig involvert i levermetastaser av tykktarmskreft [38]. Derfor er disse data tyder på at forsterkningen ved 11q13 og 14q32 kan være involvert i metastasen av gastrointestinale cancere. Kromosom 17q21 havner en potent onkogen, erbB2. Association of ErbB2 uttrykk med clinicopathological funksjonene til magekreft har blitt undersøkt i flere studier [44], [45], [46], [47], [48], [49]. Imidlertid påvirkning av ErbB2-overekspresjon på LN metastase forskjellig blant disse studiene [44], [46], [47]. I den foreliggende undersøkelse, til tross for det begrensede antall SMGCs undersøkt, alle av de med ErbB2 forsterkning og overekspresjon viste lymfeknutemetastase. Videre studier ved hjelp av et større antall SMGCs vil være nødvendig å vurdere betydningen av denne tendensen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Saker som viser både felles og ulike genomiske avvik mellom MU og SM porsjoner. Den venstre panelene viser vanlige mønstre av genomiske avvik i MU og SM for hvert enkelt tilfelle. Senteret og høyre panel viser ulike mønstre av genomisk avvik mellom de to delene i hvert tilfelle
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Saker som viser både felles og ulike genomiske avvik mellom MU og SM porsjoner. Vanlige og ulike mønstre av genomisk avvik mellom MU og SM for hvert tilfelle vises
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Saker som viser både felles og ulike genomiske avvik mellom SM og LN porsjoner. Den venstre panelene viser vanlige mønstre av genomisk avvik mellom SM og LN for hvert enkelt tilfelle. Senteret og høyre panel viser ulike mønstre av genomisk avvik mellom de to delene i hvert tilfelle
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s003 plakater (TIF)
Tabell S1.
Tilbakevendende presiseringer og slettinger i SMGCs.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s004 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Misuzu Taguchi, Yoko Miyanari og Tsuyoshi Iwao for deres utmerkede teknisk assistanse
