Abstract
Bakgrunn
vimentin er en allestedsnærværende mesenchymale mellomfilament støtte mekanisk-strukturelle integriteten til hvilende celler når du deltar i adhesjon, migrasjon, overlevelse, og cellesignaleprosesser via dynamisk montering /demontering i aktiverte celler. Bløtvevssarkomer og noen epiteliale kreftformer stiller «epitelial til mesenchymale overgang» fenotyper uttrykke vimentin. Withaferin-A, kan en naturlig utvunnet bioaktive stoffet, molekylært målrette vimentin, så vi søkte å vurdere dens virkning på tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
dermed belyse rollen vimentin i narkotika indusert reaksjoner.
Metoder og funn
Withaferin-A fremkalte markert apoptose og vimentin spalting i vimentin-uttrykke kreftceller, men betydelig mindre i normale mesenchymalceller. Dette proapoptotiske respons ble opphevet etter vimentin knockdown eller ved blokade av caspase-indusert vimentin degradering via kaspaseinhibitorer eller overekspresjon av mutert caspase-resistente vimentin. Uttalte anti-angiogene effekter av Withaferin-A ble påvist, med bare minimale effekter sett i ikke-prolifererende endotelceller. Videre Withaferin-A betydelig blokkert mykvevssarkom vekst, lokalt residiv og metastaser i et panel av bløtvev sarkom xenograft eksperimenter. Apoptose, redusert angiogenese, og vimentin degradering ble alle sett i Withaferin-A behandlede prøver.
Konklusjoner
I lys av disse funnene, evaluering av Withaferin-A, dets analoger, eller andre anti- vimentin terapeutiske tilnærminger i bløtvevssarkom og «epitelceller til mesenchymale overgang» kliniske sammenhenger er hjemlet
Citation. Lahat G, Zhu QS, Huang KL, Wang S, Bolshakov S, Liu J et al. (2010) vimentin er en roman Anti-Cancer terapeutisk mål; Innsikt fra
In Vitro Hotell og
In Vivo
Mus Xenotransplantat Studies. PLoS ONE 5 (4): e10105. doi: 10,1371 /journal.pone.0010105
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 26 september 2009; Godkjent: 03.03.2010; Publisert: 16 april 2010
Copyright: © 2010 Lahat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av NCI /NIH R01 stipend CA138345 (til DL) med en Amschwand sarkom Cancer Foundation frø stipend (til SW). MD Anderson Cancer Center cellelinje karakterisering og cytogenetiske kjernefasiliteter er begge støttes av en NCI Cancer Center Support Grant. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
består av mer enn 50 histologiske subtyper, bløtvevssarkom (STS) kan deles inn i to hovedgrupper: de med spesifikke genetiske endringer (trans eller punktmutasjoner) og relativt enkle Karyotyper, og de med komplekse, ubalansert aneuploid Karyotyper [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Økt forståelse av molekylære avvik kjøring begynnelse og progresjon av flere STS undertyper som tilhører den første gruppen (f.eks c-Kit mutasjoner i gastrointestinal stromal tumor [GIST] eller 17; 22 trans fører til PDGF-B over-uttrykk i dermatofibrosarcoma protuberans [DFSP]), har resultert i kliniske anvendelser av effektive målrettet terapi (f.eks Imatinib mesylate) med betydelig forbedret resultatet [6]. Slike terapeutiske fremskritt er veldig oppmuntrende og fremheve behovet for å identifisere andre nye molekylære mål i flere STS undergrupper
De fleste STS tilhører den andre gruppen skjuler aneuploide Karyotyper.; denne gruppen består hovedsakelig av malignt fibrøst histiocytoma (MFH, også kalt uklassifiserte pleomorphic sarkom [UPS]), leiomyosarcomas, maligne perifere nerve slire svulster (MPNST), og dedifferensierte eller pleomorphic liposarcomas. Mens kliniske presentasjon og sykdomsmanifestasjoner varierer avhengig av den spesifikke histologisk subtype, som en helhet, disse komplekse Karyotype STS har en sturen prognose, med en 5-års overlevelse på mindre enn 50%. Til tross for innledende lokal kontroll (oppnås ved kirurgi med eller uten stråling), lokalt residiv og systemisk spredning forekommer vanligvis og mangel på effektive behandlingsalternativer i disse kliniske scenarier er det store uløste problemet i STS. I kontrast til den genetiske enkelhet av STS i den første gruppe, den biologiske og molekylære mangfold av komplekse Karyotype STS vesentlig begrenser identifikasjon av enkelt og spesifikke «onkogen avhengighet» avvik. Mens utfordrende, belyse nye behandlingsformer som kan ha nytte for et bredt spekter av komplekse Karyotype STS er avgjørende.
Siden tidlig på 1960-tallet, planter og mikrober har gitt flere nyttige, naturlig utvunnet, små organiske molekyler som innehar anti-kreft egenskaper [7], [8], [9], [10].
Withania somnifera plakater (ashwagandha) er en medisinsk plante som vanligvis brukes i indisk tradisjonell medisin for å behandle et bredt spekter av forstyrrelser [11], [12], [13], [14], [15]. Withaferin-A (WFA), en svært oksygenrikt C-28 ergostane-type steroid lakton, er en bioaktive stoffet isolert fra
Withania somnifera
. WFA utviser forskjellige farmakologiske aktiviteter, herunder anti-inflammatoriske, immunmodulerende og antiangiogene effekter [15], [16], [17], [18]. Flere linjer av bevis tyder på at WFA har anti-kreft egenskaper, manifestert ved direkte rettet mot tumorceller, og indirekte, som hindrer [tumorassosiert neovaskulatur [19], [20]. Nyere studier har vist at WFA undertrykker menneskelige brystkreft og prostata kreft celler vekst
in vitro Hotell og
in vivo
ved å indusere merket apoptose [19], [21], [22]. WFA-indusert cytoskeletal arkitektur endringer [23], [24], [25], reaktive oksygenarter generasjon [26], [27], mitokondriell dysfunksjon [26], og proteosomal hemming [21] er også blitt foreslått. Normale, nontumorigenic celler ble funnet å være mer motstandsdyktige enn tumorcellene til WFA-indusert apoptose [22]; selektivitet for ondartede celler mens sparsom normale celler er en svært ønskelig funksjon av potensielle anti-kreft terapeutiske midler.
De eksakte mekanismene av WFA handling er ikke entydig definert. Flere molekylære mål er blitt foreslått, inkludert transkripsjonsfaktor NF-kB [28], [29]; den signalmolekyl AKT [27]; apoptosiske molekyler par-4, FOXO-3, og Bim [22]; og proteosomal chymotrypsin subenhet β5 [21]. En nylig studie benyttet en kjemisk genetisk og proteomikk eksperimentell tilnærming [30], i hvilken et biotinylert WFA analog ble anvendt som en probe for å trekke ned WFA bindingspartnere i endotelceller. Denne strategien resulterte i identifikasjon av vimentin, en type III mellomliggende filament, som en ny WFA substrat. Videre ble WFA-modifisert vimentin seg å utløse betydelige proapoptotiske og antiangiogenic effekter, mens vimentin knockdown resulterte i redusert WFA følsomhet. Disse eksperimentene har innsikt i WFA aktivitet og markere potensielle nytten av vimentin som en roman anti-kreft terapeutisk mål.
STS er mesenchymale og derfor all uttrykke vimentin, uavhengig av deres histologisk subtype. Derfor er det sannsynlig at anti-vimentin terapeutiske strategier kan lokke fram anti-STS effekter i et bredt spekter av STS. Denne hypotesen bedt oss å fastslå effekten av WFA på komplekse Karyotype STS
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi brukte humane cellelinjer som representerer leiomyosarkom, MPNST, fibrosarkom, og UPS /pleomorphic liposarkom å vurdere effekten av vimentin på WFA følsomhet. Våre resultater tyder på at STS er svært følsomme for WFA, en effekt som er betydelig større enn i vimentin-negative epiteliale kreftformer. WFA induserer en caspase-avhengig nedbrytning av vimentin, noe som resulterer i markert anoikis uavhengig apoptose og STS-assosierte antiangiogene effekter. Resultatene støtter sterkt vurderingen av WFA eller dets analoger som en roman klinisk strategi for pasienter som hadde disse ødeleggende malignitet.
Resultater
sarkom celler er svært følsomme for WFA
Å evaluere effekten av WFA på komplekse Karyotype STS vi valgt et panel av menneskelige STS cellelinjer som representerer fibrosarkom (HT1080), leiomyosarcoma (SKLMS1), MPNST (STS26T), og høy grad av pleomorphic sarkom /liposarkom (PLS-en). Denne sistnevnte cellelinje er nylig etablert i vårt laboratorium (se data S1 og figur S1 for ytterligere detaljer). Behandling av de ovenfor nevnte celler med WFA resulterte i en signifikant reduksjon i antallet festede celler og merket morfologiske endringer, inkludert celleavrunding og kjerne kondensasjon (figur 1A). Virkningene av WFA fant sted så tidlig som 2 timer etter behandlingsstart, og var dose- og tidsavhengig (figur S2). Cellevekst analyser viste en WFA-indusert, redusert doseavhengig i STS cellevekst (figur 1B). Mean ± SD WFA IC
50-verdier (etter 24 timer med behandling) ble registrert som 0,4 mikrometer ± 0,07, 0,41 mikrometer ± 0,03, 0,37 mikrometer ± 0,12 og 0,53 mikrometer ± 0,1, for HT1080, SKLMS1, STS26T, og PLS -1, respektivt. Tilsvarende lave doser av WFA (0,5 uM) markert hemmet STS celle kolonidannelse kapasitet (figur 1C). Til slutt, effekten av WFA på STS forankringsuavhengig vekst ble undersøkt. Alle STS-celler evaluert demonstrert en evne til å vokse i bløt agar; denne veksten ble opphevet etter 24 timer av WFA (0,5 mm) behandling (figur 1D). Samlet utgjør disse data tyder på at menneskelig STS celler er svært sensitive for veksthemmende effekten av WFA.
A)
WFA behandling (1 mikrometer /24 timer) resulterer i merkede morfologiske endringer, inkludert celle-avrunding og kjernekraft kondens, i STS celler;
B)
MTS analyser viser en WFA-indusert, redusert doseavhengig i STS cellevekst;
C)
WFA (0,5 mikrometer /24 timer) markert hemmer STS celle kolonidannelse kapasiteten målt etter ti dager;
D)
WFA (0,5 mikrometer /24 timer) opphever STS celle forankringsuavhengig vekst målt etter tre uker. Grafer representerer gjennomsnittet av tre gjentatte forsøk ± SD.
WFA induserer merket apoptose i STS celler, men mindre apoptose i normale humane fibroblaster og myogeniske celler
For å evaluere effekten av WFA på STS celle overlevelse, gjennomførte vi Annexin V /FACS analyser. STS-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av WFA (0-5 mm) i 4 timer og 24 timer; en signifikant induksjon av apoptose var tydelig selv i løpet av den korte tidsperiode, spesielt når høye doser ble anvendt (mer enn 2,5 uM, s 0,05, figur 2A). En dose- og tidsavhengig økning i tumorcelle-apoptose ble observert i alle celler som ble testet. Apoptoseinduksjon ble også gjenspeiles i den observerte økningen i aktivert caspase 3 og PARP cleavage (Western blot-analyse [WB]; figur 2B)
A)
Annexin-V /FACS analyser som viser merket. WFA-indusert apoptose i STS celler (svarte linjene representerer 4 h WFA behandling og grå søylene representerer 24 h);
B)
WFA (1 mikrometer /24 timer) induserer caspase-3 (Casp-3) spalting og PARP aktivering i STS celler (WB-analyse);
C)
STS cellene er resistente mot anoikis sammenlignet med normale humane dermale fibroblaster (NHDF). WFA (1 uM /24 hr) induserer apoptose i begge festet og flytende STS-celler;
D)
Transmisjon elektronmikroskopi (TEM) bilder som skildrer STS celle apoptose (stor pil-atom kondens, liten pil-cytoplasma blebbing) som svar på WFA. Nekrose er demonstrert i flytende STS-celler;
E)
NHDF er mer motstandsdyktige mot virkningene av WFA (IC50: 3,7 uM ± 0,15) sammenlignet med STS-celler. Grafer representerer gjennomsnittet av tre gjentatte forsøk ± SD.
Neste, vi vurdert om WFA-indusert apoptose kunne tilskrives svulst celle tap av vedheft og løsrivelse fra kultur plate, noe som resulterer i anoikis. Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) gjennomgikk betydelig apoptose når de dyrkes i suspensjon, mens STS-celler var resistente mot anoikis og ingen signifikant økning i apoptose kan bli observert (figur 2C). WFA økt apoptose av både festet og flytende STS celler.
WFA-indusert apoptose ble ytterligere bekreftet ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Tegn på apoptose, inkludert kromatin kondens og cytoplasma svinn, var tydelig i løpet av fire timer. Etter 24 timer ble merket apoptose observert, sammen med kjernemembranen tap og cytoplasmisk blebbing; disse effektene ble lagt merke til i både festet og flytende STS celler. Flytende nekrotiske STS celler ble også observert (~20-30% av totale flytende celler).
Sist, vurderte vi effekten av WFA på normale mesenchymale celler (Figur 2E og S3). Primære kulturer av NHDF og humane tarm glatte muskelceller (HISMC) ble behandlet med økende doser av WFA i 24 timer. I motsetning til våre observasjoner i STS-celler, avtar i celleantall og morfologiske forandringer var tydelig ved mikroskopi bare etter at høye doser av WFA ( 2,5 uM). Mean ± SD WFA IC
50 verdiene var 3,7 mikrometer ± 0,15 og 3,2 mikrometer ± 0,21 for NHDF og HISMC hhv. Disse verdiene var mer enn 9 ganger høyere enn det som ble observert i STS celler. Tilsvarende WFA induserte en signifikant lavere hyppighet av apoptose i disse normale celler (P 0,05). Samlet utgjør disse data tyder på at WFA er en potent proapoptotiske sammensatte. STS celler er svært følsomme for WFA, mens normale mesenchymalceller er mer motstandsdyktig mot dens virkninger.
WFA opphever STS celle migrasjon og invasjon
Vi har evaluert ved effekten av WFA på STS celle migrasjon og invasjon. STS-celler ble forbehandlet med lave doser av WFA (0,5 mm) i 4 timer, og da WFA ble vasket av nøye og en ripe sårtilheling analysen ble gjennomført. Vi observerte en markert nedgang i migrasjon (figur S4A). I tillegg ble modifisert Boyden kammere anvendt for å kvantifisere effekten av WFA på migrering og invasjon. STS-celler ble forbehandlet med en lav dose av WFA (0,5 uM) i 4 timer. Etter seponering av WFA ble cellene vasket og talt; bare levedyktige celler ble ytterligere utnyttet. WFA betydelig hemmet migrasjon og invasjon i alle STS cellene undersøkt (P 0,05, figur S4B).
En mulig påminnelse til disse eksperimentene er at virkningen demonstrerte kanskje reflektere antiapoptotic eller veksthemmende effekter av WFA fremfor dets direkte effekter på motilitet og /eller invasjon. For å løse denne muligheten, i forbindelse med de ovennevnte eksperimenter, forbehandlet vi STS-celler med en lav dose av WFA (0,5 uM i 4 timer) eller DMSO (kontroll); ved avbrytelse av WFA ble cellene vasket og tellet, og levedyktige celler ble re-belagt. Celle telling ved slutten av forsøket viste bare en liten reduksjon ( 10%) i antallet levedyktige WFA-behandlede celler i forhold til antall styre-behandlede celler (data ikke vist). Sammen disse resultatene tyder på at WFA opphever STS cellemotilitet og invasjon.
WFA induserer vimentin degradering og vimentin knockdown minsker cellenes følsomhet for WFA
En fersk studie identifisert vimentin som mulig WFA molekylære mål [30]. Derfor vurderte vi effekten av WFA på vimentin uttrykk og degradering. WFA behandling resulterte i redusert helaftens vimentin nivåer og økt uttrykk av vimentin nedbrytningsprodukter i alle STS celler testet (figur 3A). WFA effekt på vimentin er dose og tidsavhengig; høye konsentrasjoner WFA resultere i vimentin spalting etter bare fire timer etter behandling, mens vimentin degradering blir lagt merke til etter 24 timer med lavere doser.
A)
WFA behandling (5 mikrometer /4 h) resultater i redusert full lengde (FL) vimentin nivåer og økt uttrykk av vimentin nedbrytingsprodukter (VDP) i alle STS celler testet. En WFA doseavhengig effekt på SKLMS1 celler behandlet i 4 timer, er også vist. Vimentin cleavage er lagt merke til sekundært til lave WFA konsentrasjoner etter 24 timer med behandling;
B)
Anti-vimentin SMARTpool siRNA (20 nM) utløser en markert nedgang i vimentin uttrykk i SKLMS1 celler (WB). Vimentin knockdown vesentlig blokker WFA-indusert (1 mikrometer /24 timer) apoptose;
C)
Endogen vimentin ble først slått ned i SKLMS1 celler ved hjelp av anti-vimentin antisense phosphorodiamidate morfolino oligomerer. Etter knockdown, vimentin ble kraftig gjen uttrykt i cellene (WB). I likhet med resultatene av siRNA knockdown, anti-vimentin morfolino oligomerer signifikant blokkerer WFA-indusert (1 uM /24 hr) apoptose. Re-uttrykk for vimentin gjenoppretter SKLMS1 følsomhet for WFA;
D)
STS celler (SKLMS1 og PLS1) uttrykker betydelig høyere nivåer av løselig vimentin i forhold til normale mesenchymale celler (glatte muskelceller: HA-SMC og HC-SMC og fibroblaster: NHDF). (NT siRNA = ikke rettet mot siRNA, Vim siRNA = anti-vimentin siRNA smartpool; NT morfolino = ikke målretting morfolino; Vim KD = vimentin knockdown)
For å finne ut om effekten av WFA på STS-celler er i det minste delvis mediert gjennom vimentin, valgt vi å bruke en vimentin knockdown tilnærming. Anti-vimentin SMARTpool siRNA fremkalte en betydelig reduksjon i vimentin uttrykk i SKLMS1 celler (WB, figur 3B). Vimentin knockdown
per se
induserte ikke signifikant apoptose i STS celler, sammenlignet med mock eller ikke-måls siRNA transfeksjon. Som forventet per forsøkene ovenfor, WFA behandling resulterte i betydelig apoptose i håne og ikke-målretting siRNA transfekterte celler. Men vimentin knockdown vesentlig blokkert WFA-indusert apoptose. Sammen utgjør disse data tyder på at WFA-indusert vimentin nedbrytning er nødvendig for økt terapeutisk effekt.
For å bekrefte potensielle rolle vimentin i WFA-indusert apoptose, brukte vi en redning eksperimentell tilnærming. Endogen vimentin ble først slått ned i SKLMS1 celler ved hjelp av anti-vimentin antisense phosphorodiamidate morfolino oligomerer. Disse morpholinos målrette vimentin pre-mRNA kan dermed tvunget re-uttrykk for vimentin ved transfeksjon en vimentin konstruere motstandsdyktig mot den kontinuerlige tilstedeværelsen av morfolino oligomerer. Etter knockdown, vimentin ble kraftig tilbake uttrykt i cellene (WB, figur 3C); Cellene ble behandlet med WFA eller DMSO som kontroll og ble underkastet Annexin V /FACS-analyse. I likhet med resultatene av siRNA knockdown, anti-vimentin morfolino oligomerer behandling signifikant blokkert WFA-indusert apoptose. Re-uttrykk for vimentin restaurert SKLMS1 følsomhet for WFA (figur 3C).
Både STS celler og normale mesenchymale celler uttrykker vimentin. Imidlertid, som vist i figur 2, induserer WFA mer signifikante pro-apoptotiske virkninger i STS-celler sammenlignet med normale mesenchymale celler (dvs. fibroblaster og muskelceller). De tidligere publiserte data som er beskrevet ovenfor (30) identifisert WFA å binde seg til tetramerisk, løselig vimentin. Derfor søkte vi å vurdere nivåene av dette vimentin fraksjonen i normale kontra STS celler. Som vist i figur 3D, tumorceller uttrykker betydelig høyere nivåer av løselig, fri vimentin sammenlignet med normale mesenchymale celler. Dette funnet gir en mulig forklaring på våre observerte differensial WFA effekter.
WFA-indusert vimentin nedbrytning er caspase avhengig
vimentin degradering ofte oppstår gjennom aktivering av caspase veien. For å vurdere om WFA-indusert vimentin nedbrytning er et resultat av caspase cleavage, vi forbehandlet STS med Z-VAD (Promega, Madison, WI), en pan-caspase-hemmer, før WFA terapi (for 24 h). Z-VAD forbehandling førte til nedsatt vimentin nedbrytning sammen med lavere nivåer av både spaltet kaspase-3 og aktiverte PARP (figur 4A). Videre Z-VAD forbehandling vesentlig oppheves WFA-indusert apoptose (etter 24 timer av WFA behandling) i STS-celler (Figur 4B). Deretter etter vimentin knockdown hjelp morfolino oligonukleotider, ble SKLMS1 celler transfektert til å uttrykke enten villtype vimentin eller vimentin mutert ved caspase kutteseter (D85N og D259N). WFA (1 mm) indusert markant apoptose i villtype vimentin transfektert celler som ble observert vimentin degradering og caspase-3-aktivering (Figur 4C). Imidlertid ble det observert en signifikant reduksjon i WFA-indusert apoptose i celler som uttrykker det muterte vimentin, og vi merke til en dramatisk reduksjon i både vimentin degradering og kaspase-3 aktivering (figur 4C). Samlet utgjør disse data tyder på en mulig WFA-indusert ond sirkel, hvor WFA binding til vimentin utløser sin degradering av caspases og sa nedbrytnings resulterer i ekstra caspaseaktivering og apoptose.
A)
Pretreatement (4 h) i SKLMS1 celler med Z-VAD (en pan-kaspaseinhibitor) resulterer i redusert WFA-induserte (24 h) vimentin degradering sammen med lavere nivåer av både spaltet kaspase-3 og aktiverte PARP;
B)
Z-VAD (4 h) forbehandling opphever signifikant WFA-induserte (24 h) apoptose i SKLMS1 celler;
C)
vimentin slått ned SKLMS1 celler ble transfektert til å uttrykke enten villtype vimentin eller vimentin mutert ved caspase kutteseter (D85N og D259N). WFA (1 mikrometer /24 timer) induserer markert apoptose i villtype vimentin transfektert celler der vimentin degradering og caspase-3-aktivering kan oppdages (WB). Imidlertid er en betydelig reduksjon i WFA-indusert apoptose i celler som uttrykker det muterte vimentin, er lagt merke til, så vel som en reduksjon i både vimentin degradering og kaspase-3 aktivering. (WT Vim = villtype vimentin; Mut Vim = mutert vimentin; Vim FL = full lengde vimentin; VDP = vimentin nedbrytningsprodukter)
WFA-indusert molekylære dereguleringer er, i hvert fall delvis, formidlet av vimentin
Flere molekylære mekanismer har tidligere vært foreslått å ligge under WFA anti-tumorigen effekter, inkludert hemming av AKT-fosforylering [27], oppheving av NF-kB funksjon [20], [31], og direkte proteosomal inhibering [21] . Vi først søkt å evaluere hvorvidt disse molekylære dereguleringer forekommer i STS-cellene i respons til WFA behandling. Vi observerte en WFA dose- og tidsavhengig reduksjon i nivåer pakt, men ikke totalt AKT nivåer, i STS-celler (Figur 5A). Tilsvarende er en doseavhengig reduksjon i NF-kB (p65) ble også påvist, men denne reduksjonen forekom bare etter 24 timers behandling. NF-kB aktivitet, på den annen side, ble vist å bli inhibert tidlig etter behandlingen, noe som tyder på andre enn redusert NF-kB proteinekspresjon påvirker NF-kB aktivitet mekanismer. I tillegg fant vi en markert dose- og tidsavhengig opphopning av ubiquitinmolekyler, støtte WFA-indusert proteosomal hemming i disse cellene.
A)
WFA behandling induserer en dose og tid – avhengig reduksjon i pakt uten effekt på total AKT. Tilsvarende er en doseavhengig reduksjon i NF-kB (p65) protein uttrykk også sett, men denne reduksjonen forekommer kun etter 24 timers behandling. NF-kB aktivitet i PLS1 celler, som vist i diagrammene som representerer luciferase-rapportøranalyseresultatene, er vist å bli inhibert tidlig etter behandling (fire timer). En markert dose- og tidsavhengig akkumulering av ubiquitinmolekyler er også vist;
B)
vimentin knockdown i SKLMS1 celler opphever WFA (2,5 mikrometer /24 timer) indusert Pakt hemming, NF-kB protein nedgang, og økte nivåer av protein ubiquitinering. Tilsvarende, vimentin knockdown blokker WFA (1 uM /4 timer)-indusert reduksjon i NF-kB aktivitet. Grafer representerer gjennomsnittet av tre gjentatte forsøk ± SD.
Våre resultater tyder på en avgjørende rolle for vimentin i cellenes respons på WFA. Derfor søkte vi å vurdere om effektene av WFA på disse ulike veier kan, i hvert fall delvis, bli formidlet gjennom vimentin. SKLMS1 celler ble transient transfektert med anti-vimentin siRNA eller ikke-målsøkende siRNA og deretter behandlet med WFA. Vimentin knockdown avskaffet WFA-indusert Pakt hemming, NF-kB protein nedgang og aktivitet blokade, og økte nivåer av protein ubiquitinering (figur 5B). Disse eksperimentene gir ytterligere bevis på at effektene av WFA formidles gjennom vimentin og markere nye potensielle vimentin funksjoner.
WFA induserer apoptose i endotelceller dyrket i STS kondisjonerte media
Analogt med solide maligniteter, STS bestå av både tumor og tumor-assosierte normale celler; STS vekst, migrasjon, og formidling avhenge av krysstale mellom disse to avdelinger. STS er generelt svært vaskulære og angiogene, noe som resulterer i økt metastatisk potensial. Tidligere data tyder på at WFA kan huse antiangiogenic egenskaper [17], [30]. For ytterligere å utvide disse innledende observasjoner og å evaluere den potensielle antiangiogene effekter av WFA i sammenheng med STS mikromiljøet, evaluerte vi virkningen av WFA på endotelceller dyrket i vanlig kontrollmedium (som mangler angiogene faktorer, etterligne hvilende endotelceller), og på endotelceller dyrket i STS-kondisjonert medium (CM, hermet prolifererende angiogene endotelceller). Vi brukte både menneskelig endothelial (HDMEC) og murine endotelceller (LEC) og observerte en signifikant høyere WFA-indusert veksthemming i endotelceller dyrket i STS-CM enn i kontrollmedium (gjennomsnitt ± SD WFA IC
50: 0,42 mikrometer ± 0,16 vs. 1,4 mikrometer ± 0,04 i HDMEC og 0,38 mikrometer ± 0,09 vs. 2,3 mikrometer ± 0,1 i LMU; P 0,05, figur 6A). Tilsvarende WFA indusert høyere nivåer av apoptose i endotelceller dyrket i STS-CM enn i kontrollmedium (figur 6B).
A), En betydelig høyere rate av WFA-indusert (24 h ) veksthemming er sett i endotelceller (human dermal microvessel endotelceller-HDMEC og murine lunge endotelceller-LEC) dyrket i STS kondisjonert medium (CM) enn i kontroll vanlig medium (RM);
B)
WFA (1 mikrometer /24 timer) induserer høyere nivåer av apoptose i endotelceller dyrket i STS-CM enn i kontroll medium;
C)
WFA (1 mikrometer /24 timer) induserer betydelig høyere forekomst av vimentin degradering og caspase-3-aktivering i endotelceller dyrket i STS-CM enn i hvilende endotelceller;
D)
WFA (1 mm) opphever migrasjon og invasjon av endoteliale celler dyrket i STS-CM;
E)
WFA (2 mg /kg) fører til en betydelig reduksjon i det midlere antall CD31-positive (røde) blodkar sammenlignet med kontroll DMSO behandling i en
in vivo
gelfoam assay . CD-31 (rød) /TUNEL (grønn) dobbel flekker avslører endotelceller apoptose i WFA-behandlede mus. Grafer representerer gjennomsnittet av tre gjentatte forsøk ± SD. (Vim FL = full lengde vimentin; VDP = vimentin nedbrytningsprodukter)
Endotelceller er mesenchymale opprinnelse og dermed uttrykke vimentin, så vi evaluert effekten av WFA på vimentin uttrykk og spalting i både vanlige media og STS-CM. Interessant, WFA indusert betydelig høyere forekomst av vimentin degradering og caspase-3-aktivering i endotelceller dyrket i STS-CM enn i hvilende endotelceller (figur 6C). Deretter vurderte vi effekten av WFA på endotelceller migrasjon og invasjon. I likhet med den tidligere beskrevne eksperimentell tilnærming anvendes med STS-celler, anvendte vi levedyktige endotelceller forbehandlet med kortvarig WFA (4 h) i modifiserte Boyden kammer analyser. Som forventet, STS-CM forbedret endothelial celle migrasjon og invasjon. Mer viktig, WFA opphevet migrasjon og invasjon av endotelceller dyrket i STS-CM, men ikke som de dyrket i vanlig medium (figur 6D).
Og sist, for å bekrefte at den observerte WFA antiangiogen effekt oppstår
in vivo
også, utførte vi en Gelfoam angiogenese analyse Gelfoam svamper ble inkubert i STS-CM og implantert subkutant i flankene av SCID-mus. To dager etter implantering ble musene behandlet med i.p. WFA (2 mg /kg; n = 4) eller DMSO (n = 4) i 10 påfølgende dager; ved avslutning av undersøkelsen ble Gelfoams skåret ut og underkastet IHC-analyse (figur 6E). WFA behandling resulterte i en betydelig reduksjon i det midlere antall CD31-positive blodkar sammenlignet med kontrollbehandling DMSO (41 ± 7,2 vs. 5,3 ± 6, henholdsvis; P 0,05). CD-31 /TUNEL dobbel farging avslørt endotelceller apoptose i WFA-behandlede mus. Disse resultatene tyder på at WFA potensielt opphever cellevekst, hemmer migrering og invasjon, og induserer apoptose i prolifererende endotelceller i mikromiljøet STS.
Epithelial opprinnelse kreft følsomhet for WFA er forbedret i celler som utviser epitelial til mesenchymale overgang ( EMT)
Vår sentrale hypotese er at celler som uttrykker vimentin forventes å vise en høyere WFA følsomhet. I motsetning til STS, trenger de mer vanlige epiteliale opprinnelse kreft ikke naturlig uttrykke vimentin. Men betydelige data indikerer at både invasjon og metastasering kan kritisk avhengig av kjøp av en «mesenchymale» fenotype ved begynnende kreftcelle [32], [33], [34]. Ett av kjennetegnene ved denne epitelial til mesenchymale overgang, er indusert vimentin uttrykk. Tar hensyn til dette, analyserte vi vimentin uttrykk i et panel av carcinoma cellelinjer og evaluert sitt svar på WFA. Tre av de celler (MCF7, HT29, og TMK1) utviste ingen vimentin mRNA og protein ekspresjon, og de to andre (MDA231 og A549) uttrykt vimentin (figur 7A). Celler som uttrykker vimentin var betydelig mer følsomme for WFA enn de som ikke uttrykker vimentin (gjennomsnitt ± SD WFA IC
50 Verdiene i MDA231 og A549-celler var 1,3 uM ± 0,42 og 1,8 uM ± 0,37, henholdsvis, og 2,9 uM ± 0,31, 7,8 uM ± 2,34, 3,1 ± 0,18 uM i MCF-7, HT29, og TMK1 celler, respektivt; P 0,05). Tilsvarende WFA (1 uM i 24 timer) fremkalte en signifikant høyere apoptotisk hastighet i vimentin-uttrykkende carcinomceller (P 0,05, figur 7B). WB analyse åpenbarte videre vimentin degraderingsprodukter i MDA231 celler i forbindelse med forbedrede spaltes kaspase-3 og aktiverte PARP uttrykk nivåer (figur 7C). I motsetning til dette, bare minimal eller ingen ekspresjon av spaltet caspase-3 og aktiverte PARP ble demonstrert i MCF7 og HT29-celler, respektivt. Dataene som presenteres her lenger støtte rolle vimentin som WFA molekylære mål, noe som tyder på en mulig terapeutisk effekt av WFA på epiteliale kreftformer stiller EMT fenotyper.
A)
WFA-indusert veksthemming tilsvarer å vimentin uttrykk nivå i epiteliale opprinnelse kreftceller;
B)
WFA (1 mikrometer i 24 timer) utløser en betydelig høyere apoptotisk rate i vimentin-uttrykke carcinoma celler;
C)
WB analyse viser vimentin degradering MDA231 celler i forbindelse med forbedrede spaltes caspase-3 og aktivert PARP uttrykk nivåer. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
