Abstract
I løpet av tumorprogresjon, kan EphA2 reseptor få ligand-uavhengig pro-onkogene funksjoner på grunn til Akt aktivering og redusert Efrin-A ligand engasjement. Effektene kan reverseres ved ligand stimulering, noe som utløser den iboende svulst undertrykkende signalveier av EphA2 inkludert hemming av PI3 /Akt og Ras /ERK veier. Disse observasjonene argumentere for utvikling av små molekyl agonister for EphA2 som potensielle svulst intervensjonsmidler. Gjennom virtuelle screening og cellebaserte analyser, rapporterer vi her identifisering og karakterisering av doxazosin som en roman lite molekyl agonist for EphA2 og EphA4, men ikke for andre Ef reseptorer testet. NMR-studier viste omfattende kontakter av doxazosin med EphA2 /A4, recapitulating både hydrofobe og elektrostatiske interaksjoner som nylig er funnet i EphA2 /Efrin-A1 kompleks. Klinisk anvendt som et α1-adrenoreseptor-antagonist (Cardura®) for behandling av hypertensjon og godartet prostata hyperplasi, doxazosin aktivert EphA2 uavhengig av α1-adrenoreseptor. I likhet med Efrin-A1, doxazosin hemmet Akt og ERK kinase aktivitet i en EphA2 avhengig måte. Behandling med doksazosin utløst EphA2 reseptor internalisering, og undertrykket haptotactic og kjemotaktisk migrering av prostatakreft, brystkreft, og glioma celler. Videre, i en ortotopisk xenograft modell, doxazosin redusert distal metastasering av humane prostata kreftceller og forlenget overlevelse i resipientmus. Så vidt vi vet, er doxazosin den første lite molekyl agonist av en reseptor tyrosin kinase som er i stand til å hemme ondartet atferd
in vitro Hotell og
in vivo
Citation. Petty A, Myshkin E, Qin H, Guo H, Miao H, Tochtrop GP, et al. (2012) et lite molekyl Agonist av EphA2 reseptortyrosinkinasehemming hemmer tumorcellemigrasjon In Vitro og prostatakreft metastase in vivo. PLoS ONE 7 (8): e42120. doi: 10,1371 /journal.pone.0042120
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 22 februar 2012; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 15 august 2012
Copyright: © Petty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health i BW (CA155676-01, DK077876), BW og HM (CA152371), og priser til BW fra FAMRI og bønn fra Maria Foundations. JS ble støttet av Singapore National Medical Research Council Grants NMRC /1216/2009. I silico screening ble støttet av en bevilgning fra Ohio Supercomputer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. P. er ansatt Reichert, Inc. Binding analyse ble utført ved hjelp av standard biosensor chips og SR7000DC Dual Channel SPR System, et produkt av Reichert miljø- og biovitenskap. Det er ingen andre patenter, produkter under utvikling eller andre markedsførte produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Som medlem av erytropoietin-produserende hepatocellulær (Ef) familien av reseptor-tyrosin-kinaser (RTK), EphA2 ble opprinnelig kalt epitelcelle-kinase, eller Eck, på grunn av dens utbredte ekspresjon i epitelceller
in vitro
og
in vivo product: [ ,,,0],1]. Senere studier viste at EphA2 ble overuttrykt i kreft hos mennesker, og at overekspresjon var korrelert med ondartet progresjon og dårlig prognose [2], [3]. Et stort antall studier har vist at overekspresjon EphA2 og aktivering fremme tumorgenese, noe som tyder på en mulig rolle som et oncogen [4], [5], [6], [7], [8]. Overekspresjon av EphA2 i bryst epitelceller indusert morfologisk transformasjon [8], mens i prostatakreft og gliom cellelinjer, forhøyet EphA2 uttrykk forårsaket økt kjemotaktisk celle migrasjon og invasjon [9].
kontrast de pro-onkogene roller, mange studier har vist at EphA2 aktivering av sin ligand, Efrin-A1, regulerer celle oppførsel på en måte som mer forenlig med det å være en tumor suppressor, inkludert induksjon av apoptose, hemming av celleproliferasjon, og undertrykkelse av cellevandring [7], [ ,,,0],10], [11], [12].
In vivo
studier viser at EphA2 aktivering av systemisk administrert Efrin-A1 reduserer tumorigenicity og invasivitet av karsinom xenografter [13], [14]. Videre viser EphA2 sletting mus økt mottakelighet for karsinogen-indusert hud tumorigenesis [15].
Nyere studier har begynt å kaste lys over de paradoksale observasjonene [3], [16]. Det er åpenbart at EphA2 reseptoren har diametralt motsatte roller i tumorigenesis [9]. Ved ligand stimulering hemmer EphA2 celle migrasjon i tråd med de veletablerte frastøtende roller Ef reseptorer i regulering cellemotilitet [17], [18]. I direkte kontrast, i fravær av ligand, fremmer EphA2 cellemigrering, som er korrelert med dets ekspresjonsnivå. Mekanistisk er EphA2 funnet å være et substrat av Akt som aktiveres i forskjellige humane cancere [9], [19]. Akt fosforylerer EphA2 på serin 897 befinner seg i riktig eksponert sløyfe mellom kinase domene og steril α motiv (SAM). Mutagenese, farmakologiske og cellulære studier viser S897-fosforylering er avgjørende for migrasjons-stimulerende virkninger av EphA2 i fravær av ligand [9]. EphA2 overekspresjon er ofte ledsaget av tap av ekspresjon eller mislocalization av Efrin-A1 i brystkreft [20], gliom [21] og hud-tumorer [15]. Den reduserte Efrin-A uttrykk kombinert med øket EphA2 ekspresjon og hyppig Akt aktivering tilveiebringe en ettergivende miljø for å fremme ligand-uavhengig pro-invasiv Akt-EphA2 krysstale, som kan være delvis ansvarlig for EphA2 overekspresjon i løpet av tumorprogresjon og korrelasjonen av EphA2 uttrykk og ugunstig prognose. Støtte denne forestillingen, immunhistokjemisk undersøkelse av menneskelige glioma prøver med et antistoff mot fosfor-S897 avdekket at aktiveringen av Akt-EphA2 signalering er assosiert med malign progresjon [9].
Viktigere ligand stimulering av tumorceller in vitro inaktiverer Akt og forårsaker defosforylering av EphA2 på S897 [9], og peker på den intrikate todelingen av EphA2 funksjoner, dvs. ligand avhengig svulst undertrykkelse og ligand-uavhengig svulst forfremmelse. Andre tumor suppressor funksjoner av EphA2 blir også aktivert ved ligand-induserte EphA2 aktivering, inklusive inaktivering av Ras /ERK-reaksjonsveien. Den ligand-avhengig signalisering kulminerer ved inhibering av cellemigrering og proliferasjon, selv om de spesifikke responser blir modulert ved cellulær sammenheng, for eksempel Ras-aktivering status i et gitt tumorcelletype. Disse studiene motivert oss til å foreslå at små molekyl agonister for EphA2 kan utnyttes som nye kreftbehandling. Som illustrert i figur 1A, kan slike agonister ikke bare skille de pro-onkogene Akt-EphA2 krysstale, men også aktivere iboende ligand-avhengig tumor suppressor funksjoner av EphA2.
(A) Skjematisk illustrasjon av den forutsagte virkningene av små molekylagonister i induserende ligand-avhengig signalisering. (B) Krystallstruktur av EphA2 ligandbindende domene (LBD) i kompleks med Efrin-A1. Uthevet er den hydrofobe lommen og arginin 103 av EphA2-LBD som samhandler med G-H sløyfe Efrin-A1 og glutamat 119 av Efrin-A1, henholdsvis. EphA2-LBD ble rotert -10 ° mot klokken for å bedre avsløre bindende lommen. (C) Lite molekyl screening identifiserer doxazosin (forbindelse 11) som en ny EphA2 agonist. MDA-231-A2-celler ble behandlet med Forbindelse 1-11 (50 uM i 0,2% DMSO) i 30 minutter, og cellelysater ble utsatt for immunblot for fosforylerte EphA /B-kinaser (pEphA /B) og total EphA2. (D) Kjemisk struktur av doxazosin (DZ). (E) Dose-respons av EphA2 aktivering med DZ. MDA-231-A2-celler ble behandlet med de angitte doser av DZ i 30 minutter og lysater ble immunoutfelt med et EphA2-spesifikt antistoff og blottet som i (C). Behandling med 1 ug /ml Efrin-A1-Fc (EA1-Fc) i 10 minutter tjente som en positiv kontroll. Merk redusere mengden EphA2 følgende Efrin-A1 og doxazosin behandling. (F) for immunoblot pEphA /B på lysater fra MDA-231-A2-celler forbehandlet med 1 uM fenoksybenzamin og deretter behandlet i 1 time med angitte doser av DZ. Behandling med 1 ug /ml Efrin-A1-Fc (EA1-Fc) tjente som en positiv kontroll. Behandling med 0,2% DMSO for enten en time (til venstre), eller 5 timer (høyre) tjente som kjøretøykontroller. (G) Representative plottet fra overflate-plasmonresonans (SPR) analyse av DZ binding til det rekombinante ligandbindende domene av EphA2. Kurver fra bunn til topp representerer konsentrasjoner av 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25, 50 mikrometer. Fast bestemt på K
D-verdi er vist i plottet. (H) Molekylær modellering av overflatearealet skjema som viser aminosyrene av EphA2 potensielt er involvert i direkte interaksjon med doxazosin. De fire aminosyrer av den Efrin-A1 sløyfe er vist i rødt. Bilder ble opprettet ved hjelp av UCSF Chimera.
I denne studien har vi søkt å identifisere små molekyl agonister ved hjelp av en kombinasjon av struktur-baserte virtuelle screening og cellebaserte analyser. Vi rapporterer oppdagelsen og karakterisering av doxazosin som en roman agonist for EphA2 og EphA4. Videre, i et nyetablert orthotopic xenograft modell av metastatisk prostatakreft, systemisk administrering av doxazosin undertrykte betydelig distal metastaser og langvarig total overlevelse. Så vidt vi vet, er dette det første eksempelet på et lite molekyl RTK agonist med anti-kreft effekt
in vitro Hotell og
in vivo
.
Resultater
struktur-baserte virtuelle screening og cellebaserte analyser identifiserer doxazosin som en agonist stand til å indusere katalytisk aktivering av EphA2 reseptortyrosinkinasehemming
for å identifisere små molekyl agonister for EphA2, tok vi en struktur-baserte
i silikon plantev
screening tilnærming. Vår molekylær modellering av EphA2 ligand-bindende domene (LBD) basert på krystallstrukturen av EphB2 LBD [22] avslørte at bindingen lommen på EphA2 kan ta opp til 4 aminosyrer, noe som tyder på at det kan romme små molekyler med en molekyl vekt (MV) på ca. 500 Dalton [23]. Denne forestillingen ble bekreftet nylig ved bestemmelse av krystallstrukturen av EphA2 /Efrin-A1-komplekset [24] (figur 1B). Størrelsen faller i rekke vanlige legemidler [25], noe som gjør EphA2 LBD et ønskelig mål for medisiner. Mot denne enden, vi initiert
in silico
screening for å søke etter små molekyler som interagerer gunstig med ligand-bindende lomme av EphA2 avledet fra molekylmodellering [23] før krystallstrukturen ble tilgjengelig. Flere conformations for hver struktur ble generert med OMEGA (OpenEye) og hver konformasjon var forankret individuelt ved DOCK [26]. Vår første screening av over 750.000 forbindelser identifisert en rekke små molekyler som potensielt kan samhandle med ligand-bindende lommen.
De kommersielt tilgjengelige topp-scoring forbindelser ble screenet for deres evne til å indusere EphA2 aktivering i MDA-MB -231 brystkreftceller. Fordi MDA-MB-231-celler uttrykker endogent EphA2 så vel som andre Ef reseptorer, inkludert EphA1, overuttrykt vi EphA2 (figur S1) for å minimalisere bidraget fra andre Ef reseptorer i vår analyse. Cellene ble stimulert med forbindelsene 50 uM. Totale cellelysater ble probet med en tidligere beskrevet antistoffer som gjenkjenner de aktiverte Ef-reseptorer [27]. Figur 1C viser resultater fra et representativt undersett av forbindelser med strukturer som er gitt i figur S2. Blant de små molekyler som ble testet, sammensatte 11, eller doxazosin, aktivert EphA2 i størst grad. Opprinnelig utviklet som en antagonist for α1-adrenoreseptor, doxazosin (figur 1D) er en FDA-godkjent legemiddel (Cardura®) som vanligvis brukes klinisk for behandling av hypertensjon og benign prostatahyperplasi (BPH). For å bekrefte bestemt EphA2 aktivering av doxazosin, vi analyserte nivåer av aktivert Ef reseptor i MDA-231-A2 celler etter behandling med gjentatte doser av doxazosin og EphA2 immunoprecipitation. Doksazosin aktivert EphA2 reseptor på en doseavhengig måte. Aktivering var påviselig 25 mikrometer og ble sterkere på 50 mikrometer eller høyere (figur 1E). I likhet med de innfødte ligander, var det også nedbrytning av EphA2 etter eksponering for høye doser av doxazosin, som er karakteristisk for de fleste RTK ved ligand-indusert aktivering inkludert Ephs [42].
Doxazosin induserer katalytisk aktivering av EphA2 uavhengig av α1-adrenoreseptorantagonisme
Fordi doxazosin er en godt karakterisert antagonist av α1-adrenoreseptor, oppsto et spørsmål om EphA2 katalytisk aktivering av doxazosin kan skyldes en indirekte effekt av sin α1-adrenoreseptorantagonisme. For å løse dette spørsmålet, forbehandlet vi MDA-231-A2 celler med godt karakterisert irreversible α1-adrenoreseptor hemmer, fenoksyben [28], [29], [30], og deretter analysert for induksjon av EphA2 fosforylering av doxazosin. MDA-231-A2-celler ble valgt fordi de har tidligere blitt vist å uttrykke både α1a og α1b-adrenoreseptorer [31]. Det ble ikke observert forskjell i EphA2 aktivering av doxazosin følgende fenoksyben forbehandling versus ingen forbehandling (figur 1F), som viser at doxazosin aktiverer direkte EphA2 uavhengig av sin α1-adrenoreseptorantagonisme.
To andre topp-scoring forbindelser, dobutamin og labetalol (forbindelser 9 og 10), fungerer som en β1-adrenoreseptor-agonist og en α /β-adrenoreseptor-antagonist, henholdsvis. Behandling med dobutamin mislyktes i å aktivere EphA2 opp til 500 pM, mens labetalol ikke klarte å aktivere selv ved 500 pM, som bekrefter at doksazosin er faktisk mer potent og at aktiveringen er ikke et direkte resultat av generell adrenoreseptor-binding (figur S3A).
Doxazosin direkte samhandler med EphA2 LBD
Fordi doxazosin ble oppdaget via virtuelle screening rettet mot ligandbindende lommen på EphA2, det var forventet å direkte binde seg til domenet. For å teste dette, binding av doxazosin til tidligere beskrevet rekombinant LBD av EphA2 [24] ble analysert ved hjelp av Surface plasmonresonans (SPR). Vi fant at doxazosin direkte bundet til EphA2 LBD med en dissosiasjonskonstant (K
D) fra 47,6 pM (figur 1G). Binding av både dobutamin og labetalol ble også testet og vist seg å oppstå med mye lavere affinitet enn doxazosin (K
D = 1,5 mm og 0,44 mm, henholdsvis) (figur S3b). Tatt sammen, disse resultater viser at doxazosin binder direkte til EphA2 LBD.
Ved den siste bestemmelsen av røntgenkrystallstrukturen av EphA2-LBD i kompleks med Efrin-A1 [24], sammenlignet med det vi med homologi modell av EphA2 [23] anvendt i den opprinnelige screening. Til tross for noen forventede forskjeller, EphA2 bindingssetet av homologien modell generelt tilsvarende den i krystallstrukturen (fig S4), som støtter den generelle gyldighet av den molekylære modellen for den virtuelle screening. Neste, vi gjentok dokking av doxazosin inn i ligand bindingssetet fra EphA2 krystallstruktur. Figur 1 H viser doxazosin forankret i det EphA2 krystallstruktur, i en orientering som ligner på den i NMR-strukturen i EphA2-doxazosin kompleks (nedenfor). En ny runde med virtuelle screening ble også gjennomført ved hjelp av EphA2 LBD krystallstruktur. Men av de 30 nye topp-scoring forbindelser testet, vi fant ikke agonister som viste bedre aktiviteter enn doxazosin (ikke vist).
Doxazosin aktiverer EphA2 reseptor i ulike celletyper
For å kunne analysere om EphA2 agonist aktivitet av doxazosin er celle kontekstuavhengig, evaluert vi effekten av doxazosin på flere celletyper. Vi først utnyttet HEK 293 celler som overuttrykker EphA2 (HEK 293-A2) som vi beskrev tidligere [9]. HEK-293-celler uttrykker lave nivåer av endogene EphA-reseptorer [12]; overekspresjon av EphA2 i disse celler tillater ytterligere demonstrasjon av spesifikk aktivering av det eksogene kinase. I likhet med MDA-231-A2-celler, ble signifikant aktivering av EphA2 sett i HEK 293-A2-celler etter behandling med doksazosin starter på 25 pM (figur 2A). Neste vi testet PC-3-celler som uttrykker høye nivåer av endogen reseptor EphA2 [32]. Doxazosin aktivert også endogen EphA2 i PC-3 celler, selv om det ikke var tydelig til 50 mikrometer. De forskjellige kinetikk mellom disse celletypene kan skyldes delvis til de forskjellige uttrykk nivåer av EphA2 i de tre forskjellige cellelinjer eller spesifikk cellulær kontekst. I tillegg EphA2 aktivering i PC-3 celler støtter videre α1-adrenoreseptor-uavhengig mekanisme, som disse cellene mangler påvises α1a-adrenoreseptor uttrykk [33].
(A) immunoblotter for pEphA /B på lysatene fra PC-3 og HEK 293-A2 (293-A2) cellelinjer ble behandlet i 30 minutter med angitte doser av doxazosin (DZ). (B) immunoblot av pEphA /B på lysater fra MDA-231-A2 (231-A2) og 293-A2 cellelinjer som ble behandlet med 50 uM DZ i 0,2% DMSO for angitte tider. (C) Doxazosin aktiverer selektivt EphA2 og EphA4 reseptorer. Immunoblot for pEphA /B på lysater fra HEK 293-cellelinjer som uttrykker gitt Ef-reseptorene etter behandling med angitte doser av doxazosin (DZ) i 60 minutter. Behandling med 1 ug /ml Efrin-A1-Fc-ligand (EA1-Fc) i 10 minutter (EphA2) og 30 minutter (Vector, EphA1, EphA4), samt 30 minutters behandling med Efrin-A5-Fc (EA5-Fc ) (EphA3) og Efrin-B1-Fc (EB1-Fc) (EphB3) tjente som positive kontroller. Blotting for total Ef kinaser fungerte som lasting kontroller.
Vi har evaluert neste tids løpet av aktivering i både MDA-231-A2 og HEK 293-A2 celler ved behandling med en enkelt 50 mikrometer dose doxazosin. Betydelig EphA2 aktivering kan oppdages så tidlig som fem minutter etter behandling i MDA-231-A2 cellelinje, som toppet seg rundt 30 min (figur 2B). EphA2 aktivering også ble tydelig etter 10 min behandling med doxazosin i HEK 293-A2 celler, selv om det fulgte en tregere kinetikk.
Doxazosin aktiverer fortrinnsvis EphA2 og EphA4 kinaser
Det er 14 pattedyr Ef reseptorer at andelen betydelig sekvenshomologi [34]. Dette førte oss til å undersøke om doxazosin kan også aktivere andre Ef reseptorer. For dette formålet, ble HEK 293 cellelinjer overekspresjon EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, og EphB3 kinaser utnyttet. Vi fant ut at doxazosin aktivert både EphA2 og EphA4 kinaser etter en lignende dose-respons-forholdet (Figur 2C). Det ble imidlertid ikke aktivering av EphA1 sett i samme konsentrasjoner, og aktivering av EphA3 var svake sammenlignet med EphA2 og EphA4. EphB3 har høyere basalnivåer aktivering (figur 2C), som ikke ble ytterligere aktivert. Faktisk var det en merkbar nedgang i EphB3 aktivering på doxazosin eksponering. Det er også et moderat nivå av endogen EphB4 ekspresjon i HEK 293-celler; mangel på aktiverte Ef kinase signaler følgende doxazosin eksponering i vektorkontrollceller indikerte at den endogene EphB4 ikke ble aktivert enten (Figur 2C). Disse dataene viser at doxazosin aktiverer fortrinnsvis EphA2 og EphA4 mellom de ulike Ef reseptorer testet.
NMR struktur avslører omfattende direkte interaksjoner av doxazosin med EphA4
Den doble selektivitet av doxazosin for EphA2 og EphA4 åpnet opp en mulighet for å undersøke den strukturelle basis av interaksjonene ved hjelp av NMR-spektroskopi. Fordi EphA2 LBD uttrykt i
E. coli
var helt uløselig og ikke kunne refolded etter gjentatte forsøk, vi fokusert på interaksjoner av EphA4 LBD med doxazosin. Først vurderte vi EphA4 binding til doxazosin ved isoterm kalorimetri. Dissosiasjonskonstant (K
D) ble beregnet til å være 12,4 pM (figur S5a), lik som EphA2 /doksazosin interaksjoner måles ved SPR (figur 1G). Far-UV sirkulærdikroismeanalyse viste at doxazosin binding induserer ingen signifikant sekundær struktur endring i EphA4 LBD (figur S5b).
For å karakterisere bindende grensesnitt, kjøpte vi en rekke
1H
15N heteronuclear enkelt kvante sammenheng (HSQC) spektra av EphA4 LBD ved å legge doxazosin på forskjellige molare forhold. En gradvis tilsetning av doxazosin resulterte i en progressiv skift på en undergruppe av HSQC topper (figur 3A), i samsvar med relativt lav affinitet interaksjon. De fleste av disse HSQC toppene viste ikke ytterligere skift på molforholdene utover 01:05. Derfor ble den kjemiske forskyvning indeks (CSI) ved dette forholdet beregnet (figur 3B). Ved binding til doxazosin, flere klynger av rester gikk dramatiske endringer. Mens noen av de skift overlapper med de tidligere beskrevne C1 antagonister av EphA4 [35], mange av skiftene var unike for doxazosin (figur 3B). De ekstra skift fordeles over konvekse overflaten av Efrin-bindende kanal, inkludert Val72-Cys73-Asn74 på E-strand, Thr104-Leu105-Arg106 på G-streng, Leu166 på K-strand og Ile192-Ala193 på M-strand . Jo større kontaktområde kan forklare den høyere affinitet av doksazosin for EphA4 enn for C1.
(A)
1H-
15N NMR-spektra HSQC av EphA4 LBD i fravær (blå) og i nærvær (rød) av doxazosin (DZ) ved et molart forhold på 1:05 (EphA4:DZ). Flere rester lokalisert i løpet av den konvekse overflaten av EphA4 Efrin-bindende kanal er merket. (B) Residue-spesifikk kjemisk skift indeks (CSI) av EphA4 LBD i nærvær av doksazosin ved et molart forhold på 1:05 (EphA4:DZ). Betydelig-skiftet rester deles med C1 er farget i lys brun, mens restene betydelig bare forskjøvet med doxazosin binding er i rødt. (C) Forankrings modell av EphA4-doxazosin kompleks i bånd. Binding regioner identiske med de for C1-binding ble farget i brunt, mens de unike for doxazosin binding i rødt. G, K, M og E er brukt til å donere p-tråder av den konvekse overflaten av EphA4 /Efrin-bindende kanal. (D) EphA4 rester å ha direkte kontakt med doxazosin. Rester på D-E og J-K sløyfer er i brunt, de på den konvekse overflaten i fiolett, og Arg106 i cyan. Grønn stiplede linjene indikerer hydrogenbindinger mellom eren doxazosin og EphA4 rester. (E) – (F) Den samme forankrings modell med det elektrostatiske potensialet i EphA4 LBD vist. (G) EphA4 LBD i frie og doxazosin-bundet statene vise forskjellig squared generalisert for parameter S
2 (figur S6a). Blå: S
2 forskjell ≤-0,01; red: S
2 forskjell ≥0.01; brun: ingen vesentlig endring eller S
2 verdier ikke bestemt. (H) Konformasjonell utveksling av EphA4 i fri (venstre panel) og doxazosin-bundet stater (panel høyre). Rester med R
ex 5 (figur S6B) vises i baller og farget i rødt. (I) med dokk modell av EphA2-doxazosin kompleks. Kontakt rester i D-E og J-K sløyfer er merket i brunt, på den konvekse overflaten i cyan, og Arg103 i fiolett. Den fiolette dash brukes til å indikere hydrogenbindinger mellom eren doxazosin og EphA2 rester.
For å visualisere EphA4-doxazosin interaksjon grensesnitt, vi bygget modeller av EphA4-doxazosin kompleks med hyse programvare i kombinasjon med CNS, slik som beskrevet tidligere for den EphA4-C1-komplekset [35]. De fem laveste energimodeller er vist i figur S5C og S5D. Doxazosin har omfattende samhandling med EphA4 rester på D-E og J-K looper, samt kontakter med de konvekse p-tråder bestående av Val72-Cys73-Asn74, Thr104-Leu105-Arg106 og Ile192-Ala193 (figur 3C, D). Figur 3E fremhever samspillet mellom de to doxazosin metoksygrupper og EphA4 hydrofobe rester Met60 og Ile159. Interessant nok har EphA4 en ytterligere binding lomme, karakterisert ved et positivt ladet Arg106 som omgir elektronegative oksygenatomer i benzodioxin og karbonylgrupper på doxazosin (figur 3D, E, F). Sammen de strukturelle studier viser direkte interaksjoner mellom EphA4 og doksazosin, og KD er i samme konsentrasjonsområde som er nødvendig for cellulær aktivering av reseptoren (figur 2).
Binding til doxazosin stabiliserer ryggraden i EphA4 LBD
Nylige bevis viser at protein dynamikk utover den statiske strukturen spiller en viktig rolle i forskjellige biologiske prosesser, inkludert signaloverføring [36], [37], [38], [39]. For å få strukturell innsikt i hvordan doxazosin kunne fungere som en EphA2 agonist, karakterisert vi ryggrad dynamikken i EphA4 LBD i fri tilstand sammenlignet med det i kompleks med doxazosin (se Methods S1). I korthet, målte vi den ryggrad
15N avslapping data T1, T2 og heteronuclear NOE-verdier, som deretter ble analysert med «Model-free» formulism [40], [41], [42]. Analysen genererte «squared generaliserte orden parametre», S
2, som reflekterer den ryggraden stivhet på PS-ns tidsskala. Figur S6a demonstrerer økt S
2 verdier for et større antall av rester ved EphA4 binding til doxazosin sammenlignet med gratis EphA4. Mange av rester med betydelig høyere S
2 verdier ble kartlagt til ryggraden i EphA4 (figur 3G). Denne observasjonen viser at doxazosin stabilisert ryggraden i EphA4 LBD på ps-ns tidsskala.
Ytterligere bevis som støtter stabilisering av EphA4 LBD av doxazosin kom fra den kjemiske valutakursen, R
ex, som gjenspeiler de konformasjonsendringer på us-ms tidsskala på enkelte rester. Som vist i fig S6B, mange rester på tvers av EphA4 LBD i fri tilstand oppviste betydelige R
ex verdier, noe som indikerer at de gjennomgår omfattende konformasjonsendringer. I motsetning binding til doxazosin reduseres betydelig R
ex verdier for de fleste rester, bortsett Asn74-Val75 og Thr121. Endringene i R
ex-verdiene ble deretter kartlagt tilbake til EphA4 struktur (figur 3 H), viser dramatiske reduksjoner i konformasjonsendringer i doxazosin-bundet vs. fri tilstand. Samlet, vår strukturell analyse og protein dynamikk modellering viser at doxazosin forårsaker betydelig stabilisering av EphA4 LBD, noe som kan bidra til de agonistiske funksjoner av doxazosin.
En ny modell for EphA2-doxazosin kompleks spår ytterligere agonister
Neste, modellert vi EphA2-doxazosin interaksjoner omfatter begrensninger fra EphA4-doxazosin struktur. Sequence og strukturelle justeringer avdekket rester bevart mellom EphA2 og EphA4 LBDs som viste betydelige peak endringer i EphA4 ved binding til doxazosin. Disse tilsvarer Ile58, Met59, Val69, Cys70, Asn71, Thr101, Val102, Arg103, Arg159, Leu163, Val189 og Ala190 av EphA2. Figur 3I illustrerer strukturen i EphA2-doxazosin kompleks bygget med hyse programvare. I likhet med den EphA4-doxazosin kompleks, metoksygruppene av doxazosin interagere med hydrofob overflate som dannes av Ile58, Met59 og Ala158, mens Arg103 av EphA2 samvirker med karbonylgruppen og oksygenatomene i benzodioxin del av doxazosin (figur 3I). I tillegg er benzyl ringen av benzodioksin sitter i et hydrofobt hulrom i EphA2 hovedsakelig utgjøres av Cys70, Thr101 og Ala190 sidekjeder (figur 3i). Bemerkelsesverdig, i det nylig fastslått røntgen ko-krystallstrukturen av EphA2-Efrin-A1-komplekset [24], Efrin-A1 interagerer også med det hydrofobe lomme og Arg103 av EphA2 (figur 1B), noe som tyder på at doksazosin kan rekapitulere to distinkte måter reseptor interaksjoner med mors ligand.
Doxazosin utløser EphA2 avhengig hemming av ERK og Akt kinase aktiviteter
Aktivering av EphA2 reseptor ved Efrin-A1 ligand hemmer både ERK1 /2 og Akt kinase aktiviteter i de fleste normale celler og en undergruppe av kreftceller [9], [12], [43]. Etter å ha vist at doxazosin kan etterligne Efrin-A1 i binding til og aktivering EphA2 reseptor, spurte vi om doxazosin behandling kan hemme ERK1 /2 og Akt aktivisering også. Vi først testet dette ved å utnytte A172 glioma celler utviklet for å overuttrykker EphA2 reseptor (A172-A2). I motsetning til MDA-MB-231 celler som har aktivert Ras, og er motstandsdyktige mot Efrin-A1-Fc-indusert hemming av ERK1 /2, A172-celler havn vill-type-Ras og har høye basalaktiverings nivåer av ERK1 /2 og Akt, som var følsomt overfor Efrin-A1-indusert hemming (figur 4A, langt kjempe kjørefelt). I likhet med andre celletyper som ble testet (figur 1 og 2), doxazosin også aktivert EphA2 på A172 glioma-celler på en doseavhengig måte med start omkring 25 pM (figur 4A). Videre behandling med 50 uM og 100 uM doxazosin var tilstrekkelig til å bevirke betydelig inhibering av Akt og ERK1 /2 aktivering. Virkningene på Akt hemming sammenfalt med EphA2 aktivering i disse cellene, og en høyere konsentrasjon som var nødvendig for ERK1 /2-hemming (figur 4A). I likhet med MDA-231-A2 celler (figur 1E), observerte vi nedbrytning av EphA2 følgende doxazosin behandling i A172 celler.
(A) Immun av lysater fra A172-A2 celler behandlet med angitte doser av doxazosin (DZ ) i 0,2% DMSO i 90 minutter. Behandling med 1 ug /ml Efrin-A1-Fc-ligand i 10 minutter tjente som en positiv kontroll. Lysates ble immunopresipitert med Efrin-A1-Fc (IP: EA1-Fc) som gitt i metoder, og undersøkt for pEphA /B og total EphA2. Totale cellelysater ble analysert for fosforylerte former av ERK1 /2 og Akt, samt total ERK1 /2 og Akt. (B) Immunoblot av totale cellelysater fra LK133A-Vec og LK133A-A2-celler behandlet med angitte doser av doxazosin (DZ) i 0,2% DMSO i 90 minutter. Behandling med 1 ug /ml Efrin-A1-Fc i 10 minutter tjente som en positiv kontroll. Lysates ble undersøkt for fosforylerte formene for EphA /B, Akt, og ERK1 /2, samt total EphA2, Akt, og ERK1 /2.
Mens resultatene ovenfor viste at doxazosin behandling kan undertrykke Akt og ERK-aktivering, forble et viktig spørsmål om denne effekten resultater spesielt fra EphA2 aktivering. For å løse dette spørsmålet, vi utnyttet en udødelig leveren epitel cellelinje, LK133A, isolert fra en hepatoma indusert av DEN i EphA2 knockout mus. Retroviral vektor ble brukt for å gjenopprette EphA2 ekspresjon i disse cellene (LK133A-A2), og celler transdusert med en tom vektor ble anvendt som kontroll (LK133A-Vec). Figur 4B viser at, i fravær av EphA2, hverken doxazosin eller Efrin-A1-Fc var i stand til å hemme ERK og Akt aktiviteter i LK133A-Vec celler (figur 4b). Faktisk var det en merkbar økning i ERK og Akt aktivering av doxazosin. Gjeninnføring av EphA2 uttrykk gjenopprettet ERK og Akt-inhibering ikke bare ved Efrin-A1-Fc, men også av doxazosin, som ble fulgt av EphA2 aktivering.
