Abstract
Endobronchial ultralydveiledet Transbronchial nål aspirasjon (eBUS-TBNA ) og Trans-esophageal ultralydundersøkelse med tynn nål aspirasjon (EUS-FNA) er viktige, nye teknikker for diagnostisering og stadieinndeling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) som har blitt innarbeidet i lungekreft iscenesettelse retningslinjer. Å veilede og optimalisere behandlingsbeslutninger, spesielt for NSCLC pasienter i stadium III og IV,
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjonsstatus er ofte nødvendig. Den samstemmighet av mutasjonen analyse mellom disse cytologiske aspirates og histologiske prøver tatt ved kirurgisk stadieinndeling er ukjent. Derfor studerte vi i hvilken grad allel-spesifikk kvantitativ real-time PCR med hydrolyse prober kan bli pålitelig gjennomført på eBUS og EUS fin nål aspirater ved å sammenligne resultatene med histologisk materiale fra den samme pasient. Vi har analysert en rekke 43 NSCLC pasienter som cytologisk og histologisk materiale var tilgjengelig. Vi viste at disse standard molekylære teknikker kan være nøyaktig brukes på tynn nål cytologiske aspirates fra NSCLC pasienter. Viktigere, viser vi at alle mutasjoner oppdaget i histologisk materiale av primærtumor ble også identifisert i cytologiske prøver. Vi konkluderer med at molekylær profilering kan utføres pålitelig på tynn nål cytologi aspirates fra NSCLC pasienter
Citation. Van Eijk R, Licht J, Schrumpf M, Talebian Yazdi M, Ruano D, Forte GI, et al. (2011) Rapid
KRAS
,
EGFR
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
Mutasjon Analysis of Fine Needle aspirerer fra Non-småcellet lungekreft hjelp allel-spesifikk qPCR. PLoS ONE 6 (3): e17791. doi: 10,1371 /journal.pone.0017791
Redaktør: Ralf Krahe, University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 26 oktober 2010; Godkjent: 11 februar 2011; Publisert: 08.03.2011
Copyright: © 2011 van Eijk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Leiden University Medical Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødelighet i den vestlige verden [1]. For kliniske og terapeutiske formål, er lungekreft tradisjonelt oppdelt i liten celle (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Mens SCLC behandles med kjemoterapi og /eller strålebehandling, NSCLC primært behandles gjennom reseksjon; imidlertid bare 30% av NSCLC har en resectable sykdom (fase I /II) ved tidspunktet for presentasjon [2]. Dette understreker viktigheten av nøyaktig, preoperative mediastinale iscenesettelse i å hindre unødvendige resections. Preoperativ staging kan utføres gjennom transbronchial (eBUS-TBNA) eller transesophageal (EUS-FNA) aspirasjon av mediastinale lymfeknuter. Disse cytologiske prosedyrer er mindre invasiv enn rutine mediastinoskopi fulgt av biopsi av lymfeknutene, men lignende høy spesifisitet og sensitivitet [3] – [9] er oppnådd. Endosonography har blitt innlemmet i lungekreft iscenesettelse retningslinjer som et alternativ for kirurgisk stadieinndeling av mediastinum [10], [11].
I mange tilfeller er tilstrekkelig til å diagnostisere den økte bruken av disse minimalt invasive teknikker og iscenesette pasienten riktig. Selv om mengden av cellemateriale innhentet av disse prosedyrene er relativt liten, er informasjonen forespurt av klinikere raskt voksende, f.eks for NSCLC, immunhistokjemi og molekylær patologi har blitt en del av standard behandling [12].
i tillegg til denne endringen i staging prosedyrer, har den raske utviklingen av nye medisinske behandlinger for NSCLC funnet sted. En undergruppe av NSCLC kreftformer kan huse en aktiverende mutasjon i EGFR kinase domene [13]. Tumorer med disse mutasjonene er ofte følsomme for tyrosinkinaseinhibitorer (TKI). På den annen side, aktive mutasjoner i
KRAS
er forbundet med resistens mot TKI. Selv om de fleste publikasjoner rapporterer at disse mutasjonene er gjensidig utelukkende [14] – [19], tyder bevis [20] som en svulst kan samtidig huse en aktive
EGFR
mutasjon og mutasjoner nedstrøms i veien i
KRAS
genet, noe som betyr at oppstrøms inhibering av EGFR vil ikke ha noen terapeutisk virkning i disse tilfellene. Også mutasjoner i
BRAF Hotell og
PIK3CA
er rapportert i NSCLC. Imidlertid er videre forskning er nødvendig for å fastslå i hvilken grad disse mutasjonene kan få konsekvenser for behandling [21], [22].
På grunn av denne utviklingen og ønsket av pasienter og klinikere å redusere forsinkelse av behandlingen , raske og følsomme molekylære teknikker er nødvendig. Fortrinnsvis bør disse teknikkene være aktuelt på formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) cytologiske prøver [23] – [25] fordi eBUS-TBNA og EUS-FNA aspirasjon prøvene er ofte det første materiale som er ervervet fra pasienter med NSCLC. Allel-spesifikk kvantitativ real-time PCR (qPCR) med hydrolyse prober er en pålitelig og følsom teknikk som kan brukes for dette formål. Oppdager mutasjoner i
EGFR
,
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
med hydrolyse sonder har tidligere blitt beskrevet i NSCLC pasienter [23] – [26 ]. Følsomheten av analysene overgår også 1% sensitivitet forslag sett for
KRAS
mutasjonstesting [27].
De fleste av
EGFR
mutasjoner er p.L858R, jo hotspot mutasjon i ekson 21 og slettinger i ekson 19, som er rapportert å utgjøre opptil 36% av alle aktiverende mutasjoner [15], [28].
KRAS
er mutert i 10% -30% av lungekarsinom og over 95% av alle aktiverende mutasjoner i
KRAS
ligger i ekson 1 (kodon 12 og 13) [28], [ ,,,0],29].
BRAF
p.V600E hotspot mutasjon er rapportert hos 3% av NSCLC og endrer rester viktige i AKT-mediert BRAF fosforylering, som tyder på at avbrudd av AKT-indusert BRAF hemming spiller en rolle i ondartet transformasjon [28] , [30]. Tre hotspot mutasjoner i
PIK3CA
kan være en annen årsak til over-aktivering av PI3K-AKT sti, som fremmer malign transformasjon av menneskets luftveier epitelceller og har blitt rapportert hos ca 4% av lungekarsinom [28 ], [31].
i denne studien sammenlignet vi allel-spesifikk qPCR analyser for de mest hyppige aktiverende mutasjoner i
EGFR
,
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
i tumor-positive tynn nål cytologiske aspirates mot histologisk materiale av primære svulster.
med denne tilnærmingen, rettet vi å finne ut i hvilken grad allel-spesifikk qPCR med hydrolyse prober kan utføres på cytologisk aspirasjon materiale ved å sammenligne mutasjonsstatus og deretter observere samstemmighet mellom cytologisk og histologisk materiale og mellom primærsvulster og metastaser.
materialer og metoder
Etikk Statement
Spesifikk behovet for etisk komité godkjenning var ikke nødvendig for denne studien. Alle prøvene ble håndtert i henhold til de medisinske etiske retningslinjer er beskrevet i de etiske Riktig sekundær bruk av menneskelig vev etablert av den nederlandske Federation of Medical Sciences (www.federa.org, åpnes den 27 oktober 2010). Følgelig til disse retningslinjene alle humant materiale som anvendes i denne studien er anonyme siden kliniske data ikke ble anvendt. På grunn av dette anonymiserings prosedyren enkeltpasienter tillatelse ikke er nødvendig.
Prøve utvalg
Materiale fra 43 pasienter med NSCLC som både tumor-positiv cytologisk og histologisk materiale ble tilgjengelig ble valgt fra Institutt for patologi i Leiden University Medical Center (LUMC) og identifisert gjennom en PALGA database søk; non-gynekologiske cytologiske prøver mellom 2005 og 2009 ble gjennomsøkt ved hjelp av søke-strenger «lunge, ondartede celler og ikke-småcellet lungekreft» og «mediastinum, ondartede celler og ikke-småcellet lungekreft». Fra 447 unike cytologiske prøver, vi valgte tilfeller hvor tumor-positive histologisk materiale av primærtumor var også tilgjengelig (Supplementary Tabell S1). Av de 43 pasientene ble 33 pasienter subtyped: 14 plateepitelkarsinom, 15 adenokarsinomer, 3 adenosquamous karsinom og en stor celle karsinom. De resterende 10 pasienter hadde blitt klassifisert NSCLC bare.
DNA fra 42 kontroll FFPE-prøver ble innhentet fra Molecular Diagnostics (MD) delen av Avdeling for patologi i LUMC. For valideringsformål, en serie av 10 DNA-prøver, hvorav ni hadde en demonstrert
EGFR
ekson 19 sletting av DNA-sekvensering, ble gitt av Nederland Cancer Institute -. Antoni van Leeuwenhoek Hospital
DNA
Før DNA, ble kreftceller beriket å oppnå tumorcelle prosenter 70% (figur 1). De FFPE- tumorvev ble beriket for tumorceller guidet av en hematoxylin og eosin (H E) -stained lysbilde tar 0,6 mm-vev slag fra svulsten fokus i FFPE blokken ved hjelp av en vev microarrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI , USA). Før DNA, ble vevet deparaffinized i xylen og vasket i 70% etanol. For celleblokkene ble 10 slides av 10 mikrometer farget med hematoksylin. Tumorceller ble markert ved å lede med en 5-mikrometer H . E sklie og de tilsvarende svulst feltene på Hematoxylin lysbildene ble microdissected
mikroskopisk detalj av en cytologisk smøre innhentet gjennom tynn nål aspirasjon av en meadiastinal lymfeknute fra en NSCLC pasient. Tumor foci er merket på baksiden av hvert bilde med en diamant spissen. Deretter glassene er fjernet og tumor foci skrapes fra raset ved hjelp av en skalpell blad (ikke vist).
For de cytologiske utstryk, mikrodisseksjon ble initiert ved å markere svulsten foci med en diamant nål på Baksiden iden~~POS=HEADCOMP av Giemsa-farget lysbilde. Deretter ble dekkglass fjernet ved inkubering i xylen ved værelsestemperatur i separate 50 ml rør for å unngå forurensning. Inkubasjon ble utført over natten eller inntil dekkglass ble fjernet (noen ganger opp til en uke). Deretter ble platene vasket i alkohol, tre ganger på 100%, en gang i 70% og en gang i 50%, for å rehydrere vevet. Ved hjelp av et skalpellblad, ble tumoren brennpunktene fra de markerte områdene skrapet og oppsamlet i mikrorør for DNA-isolasjon.
DNA ble isolert ved hjelp av NucleoSpin Tissue XS Genomisk DNA Purification Kit (Machery-Nagel, Duren, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Den gjennomsnittlige DNA renten på cytologiske prøver og celleblokkene var 282 ng og 280 ng, henholdsvis. Men cytologiske utstryk ble løst ved hjelp av metanol i stedet for formalin, så det isolerte DNA var ventet å være av høyere kvalitet. Den gjennomsnittlige DNA-utbytte fra biopsier var betydelig høyere (985 ng).
Før analyse ble DNA-prøvene fortynnet med 5 eller 15 ganger. Vi har observert at DNA fortynnet 15 ganger i løpet av generelt ga en kvantifisering syklus (Cq) 35 (data ikke vist); derfor, i de påfølgende analysene brukte vi 5 × lager DNA-fortynninger i sterilt vann.
Mutasjon deteksjon
De analyser for påvisning av syv ulike
KRAS
, tre
PIK3CA Hotell og en
BRAF
variant ble oppnådd gjennom Custom TaqMan® analysen design Tool (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a /d IJssel, NL). Hydrolyse prober ble utformet med mindre grove bindemiddel (MGB) modifikasjoner på 3′-enden. Disse modifiserte prober har den fordel at forholdsvis korte prober kan utformes med høyere smeltetemperatur (Tm) og øket duplex stabilitet og spesifisitet i forhold til konvensjonelle sonder [32].
EGFR
analysene ble beskrevet tidligere [33]. qPCR reaksjoner ble utført i 10 pl reaksjonsblandinger inneholdende 5 ul Faststart Universal Probe Master (Roche Applied Science), 1 pl 10 x primer og hydrolyse sonde løsninger, 2 ul av 5 x fortynnet DNA og 2 pl sterilt vann i en forseglet LightCycler 480 multibrønnplate 384 (Roche Applied Science) i et LightCycler 480 system (Roche Diagnostics) som følger: 10 minutter ved 95 ° C og 45 sykluser på 15 sekunder ved 92 ° C, 60 sekunder ved 60 ° C og 10 sekunder ved 72 ° C. For validering, utførte vi direkte Sanger-sekvensering ved hjelp av M13 primere som beskrevet tidligere [34] ved sekvense kjernen i Leiden Genome Technology Center. Primer sekvenser er oppført i Tilleggs Tabell S2. Alle DNA Sekvensering ble gjennomført på kjente gener og ingen ny sekvensering ble gjennomført.
Rådata fra LC480 programvaren ble importert til en in-house-laget Microsoft Excel 2003-regneark for å definere mutasjonsstatus. Kvantifiseringen syklus (Cq) ble brukt for kvalitetsvurdering og prøver med CK verdier over 35 (Cq 35) i vill-type kanal ble avvist og ekskludert for videre analyse. For å bestemme nærvær eller fravær av en mutasjon, endepunktet fluorescens-forholdet R
m /r
vekt ble beregnet etter subtrahering av gjennomsnittsbakgrunnssignal fra tre negative kontroller. Regnearket er tilgjengelig på forespørsel. For
BRAF
,
PIK3CA Hotell og
EGFR
p.L858R, mutasjonsstatus var direkte diskriminert (figur 2a). Mutasjoner ble identifisert når R
m /r
vekt- forholdet var høyere enn 0,7, mens et forhold lavere enn 0,3 viste fravær av en mutasjon. Ingen mellomliggende verdier ble observert. I
KRAS
vill type prøver, økt bakgrunnssignal ble observert for c.34G T (R
m /R
vekt ± 0,4) og c.38G C (R
m /R
vekt ± 0,6) assay i mutant sonde kanal. Dette ble trolig forårsaket av ufullkommen hybridisering av disse sonder til villtype-allelet. Innstillingen å identifisere mutasjonen riktig var c.34G TR
m /R
wt 0,7, mens c.38G T mutant ble identifisert når en R
m /R
vekt-forhold cut-off på 0,8 ble anvendt.
EGFR
exon delesjon 19 sonde førte til en nedgang i fluorescens endepunkt, mens det i et villtype-prøve, begge prober ga et signal. Å analysere
EGFR
ekson 19 slettinger, R
m /R
wt 0,8 og Cq 32 ble ansett villtype og R
m /R
wt≤0.6 og CQ 32 indikerte en sletting. Mellomliggende verdier, med R
m /R
vektforholdet mellom 0,6 og 0,8 og Cq 35, kreves bekreftelse hjelp Sanger-sekvense
Panel A viser EGFR p.L858R analysen.. Alle prøvene viser en villtype (kontroll) signal, VIC, nedre panel (grønn og blå linjer), mens bare gruppe 2 (blå linje) viser en mutant FAM signal. Panel B viser EGFR ekson 19 mutasjonsanalyse. Den nederste panelet viser villtype VIC signal for alle prøvene (rød, grønn og lilla linjer). Den øverste panelene viser mutant FAM signal. Gruppe 1 (røde linjer) viser villtype signal, gruppe 2 (rød og lilla) viser mulige mutanter med nedsatt fluorescens, gruppe 3 (grønn linje) viser en nesten helt forsvunnet signal som indikerer en sletting. Bildene er hentet fra LC480 programvareversjon 1.5.0. Y-aksen viser den relative fluorescens for FAM (465-510 nm) og VIC (533-580nm) prober, viser PCR-sykluser. X-aksen
diskusjon
Resultater og
analyse~~POS=TRUNC design og validering
For
BRAF
, en enkelt analyse er designet som oppdager aktiverings hotspot mutasjon p.V600E, noe som resulterer fra c.1799T en substitusjon [35]. For
PIK3CA
, designet vi prober for de tre vanligste erstatninger [36]: c.1624G A (p.E542K), c.1633G A (p.E545K) og c.3140A G ( p.H1047R). Selv om disse tre analysene oppdaget over 85% av alle mutasjoner i NSCLC ble noen av de sjeldne erstatninger i hotspot regionene potensielt savnet. For
KRAS
, designet vi analyser for de sju mest hyppige basepar erstatninger i kodon 12 og 13: c.34G A (p.G12S), c.34G C, (p.G12R), c .34G T, (p.G12C), c.35G A, (p.G12D), c.35G C, (p.G12A), c.35G T (p.G12V) og c.38G A (p.G13D). Sammen utgjør disse analysene oppdage nesten alle erstatninger i
KRAS
, selv om noen sjeldne varianter kan være savnet. Å oppdage p.L858R hotspot og ekson 19 slettinger i
EGFR
vi brukte tidligere rapportert analyser [33].
EGFR
p.L858R mutasjon ble detektert ved anvendelse av en sonde blanding som inneholder en vill-type sonde og to forskjellige mutante prober: en for de mest vanlige varianten (c.2573T G) og en for den sjeldne komplekset c .2573_2574TG GT inversjon
hotspot mutasjon analyse i cytologi materiale fra NSCLC pasienter
for å ta opp i hvilken grad mutasjonen analysen kan bli pålitelig utført på eBUS-TBNA og EUS-FNA aspirasjon materiale. utførte vi de 13 analyser på 43 pasienter med NSCLC som både primærtumor (enten biopsier eller histologisk materiale fra stasjonsberegninger) og tumor-positiv cytologisk materiale hadde blitt samlet inn. Materialet fra de 43 pasientene representerer 29 delskjerner fra histologiske excisions, 23 microdissected biopsier og 3 hel-seksjonen biopsier som ble sammenlignet med 45 microdissected cytologiske prøver og 17 microdissected celleblokker (Supplementary Tabell S1).
Seks pasienter presentert med en
KRAS
mutasjon: c.34G T (N = 2), c.34G A, c.35G A, c.35G C og c.38G A. En pasient gjennomført en delesjon i ekson 19 av
EGFR plakater (c.2238_2252del15) og to pasienter viste
PIK3CA
mutasjoner: c.1633G A og c.3140A G. Sistnevnte tilfelle viste en ekstra
KRAS
mutasjon (p.34G T). Ingen mutasjoner i
BRAF
ble observert.
For noen pasienter, flere histologiske og /eller cytologiske prøver ble analysert. I forskjellige prøver for den samme pasient, ble motstridende resultater for den samme type materiale aldri observeres. Derfor i tabell 1 hver pasient er vist bare en gang, hvor for hver type materiale informasjonen fra alle pasientens prøver blir slått sammen. Dette betyr at klarsignalet for hver analyse tok forrang. I tabell 1 er de resterende manglende samtaler, på grunn av lave signaler angitt med «?».
Den samlede takst i de 13 analyser, etter sammenslåing, beløper seg til 95% (58 ubestemte resultater ut av 1118 tester). Anropsfrekvens for histologisk materiale er vesentlig høyere ved 99% (8 ikke bestemt ut fra 559) enn for cytologisk materiale på 91% (48 av 559). Innenfor cytologisk materiale, er takst for primære svulster lavere (84%) enn for metastaser (96%). Merk at disse observasjonene gjenstår dersom pasienten med lavest kvalitet resultater (prøve 21) er fjernet. Innenfor histologisk materiale kan observeres den samme forskjell i anropsfrekvens, men i en mye lavere grad (98% for primærtumorer versus 99% for metastaser). Når man sammenligner ringeprisene per analysen, observerte vi at de tre analysene på
PIK3CA
genet utført mindre (mellom 88 og 91%) enn de andre 10-analyser (mellom 94 og 99%).
Som kunne observeres, da cytologisk materiale ble hentet fra primære svulster, mutasjons resultater for histologi og cytologi var konkordant i alle tilfeller der begge resultatene ble bestemt. Når cytologisk materiale ble oppnådd fra metastase, i en pasient (nr 40) med et adenokarsinom /bronkoalveolar karsinom (BAC), en KRAS c.34G En mutasjon ble identifisert i mediastinum lymph node som ikke ble påvist i den primære tumor. Dette kan forklares ved det ofte observert genetiske avvik av metastase fra den primære tumor. I dette tilfelle er tidsspenn er 18 år mellom den primære tumor og metastase. Totalt sett er det disharmoni rente bare 0,20% (en analyse av 503 hvor både histologiske og cytologiske resultater bestemmes).
tumorcelleprosent og DNA kvalitet
Fra biopsier og cytologi, bare små svulst foci kan microdissected. Dette resulterer i et lavt utbytte DNA som, i tilfelle av formalinfiksering, er også delvis degradert. For å studere kvaliteten av DNA, sammenlignet vi DNA utbyttet med hensyn til analyseytelse. Vi observerte at den gjennomsnittlige mengden av DNA isolert (295 ng) var lavere i gruppen (n = 15), hvor to eller flere analyser mislyktes [sammenlignet med gruppen uten sviktende analyser (n = 102, 2973 ng)]. Likevel, i den sistnevnte gruppen, 44% av prøvene (n = 45) hadde også en DNA-mengde lavere enn 295 ng. Dette indikerer at CQ verdier er en bedre indikator på DNA kvalitet og ytelse enn DNA konsentrasjonsmålinger.
Allele spesifikke qPCR med hydrolyseonder har blitt rapportert å overgå 1% sensitivitet nivå [27]. Men tatt i betraktning at qPCR effektivitet er også avhengig av DNA-fragmentering, kan DNA isolert fra FFPE-prøver analyseres nøyaktig på et følsomhetsnivå på 10% [26]. Vi bestemte deteksjonsgrensen i serielle fortynninger av DNA fra to svulster bærer en
KRAS
c.34G T eller en c.35G En mutasjon. Dette viste at minimal DNA inngangen må være minst 32 pg, tilsvarende 4-6 celler med høy molekyl DNA, for å gi CQ verdier. 35 (figur 3)
Det øverste panelet viser mutant (FAM) signal for en rekke forskjellige mengder av inngangs DNA i pg bærer c.34G T KRAS mutasjon. Ingen «mutant» signal er observert i en villtype DNA (grønn linje) og vannkontroll (grå linje). I villtype (VIC) panel all DNA show en hvete signal mens vannet kontrollen er negativ (grå linje). Bildene er hentet fra LC480 programvareversjon 1.5.0. Y-aksen viser den relative fluorescens for FAM (465-510 nm) og VIC (533-580nm) prober, viser x-aksen PCR-sykluser.
Videre validert vi analysene i en serie av DNA-isolater fra microdissected FFPE-prøver med kjent
KRAS
,
PIK3CA
,
BRAF
eller EFGR varianter som bestemmes av Sanger-sekvensering. Vi har funnet en 100% korrelasjon med de hydrolyse-probe assays.
validert analysen for
EGFR
exon 19 i en serie på 10 prøver med mulig sekvens bekreftet exon delesjoner 19 og en prosentdel av tumor mer enn 50%. Prøvene ble testet uten forutgående kjennskap til mutasjonsstatus. Hydrolyseanalyseresultatene ble sammenlignet med DNA-sekvensresultatene og alle de ni prøver inneholdende en exon delesjon 19 ble korrekt identifisert og skilles fra villtype prøven (figur 2b). I ett tilfelle var det en 18-bp innsetting i ekson 19. Fordi dette falt utenfor registreringsområdet av sondene, mutant ble ikke oppdaget av sletting analysen (SampleID 1012 i Tilleggs tabell S3). Disse resultatene viser at alle hotspot mutasjoner og
EGFR
ekson 19 slettinger kan oppdages ved hjelp av hydrolyse sonder.
Kryssreaksjoner
Mutasjoner i
KRAS
og
PIK3CA
klyngen i hotspots. For
KRAS
, alle syv analyser hybridiserte til kodon 12 og 13 (nukleotider c.34G, c.35G og c.38G), mens for
PIK3CA
to analyser oppdaget ekson 9 endringer (c .1624G A og c.1633G A). Som sondene potensielt hybridisert i samme region, kryssreaksjon mellom de ulike
KRAS
eller
PIK3CA
analyser kan observeres som et resultat av økt fluorescens avlesninger fra ufullkomment matchet prober eller primere [26 ]. I tillegg kan kryssreaktivitet resultere fra (sjeldne) basepar erstatninger som ikke dekkes av de benyttede analysene.
Kryssreaksjoner ble undersøkt i en serie på 42 MD prøver å bære en
KRAS
mutasjon i posisjon 34, 35 eller 38. i alt 294 assays (42 x 7) ble utført. Riktig mutasjonsstatus ble identifisert når en R
m /R
vektforholdet cut-off 0,7 ble brukt; imidlertid, i 68 forsøk, ble det observert en kryssreaktivitet signal. Fem kryss-reaktivitet signaler hadde R
m /R
wt 0,7, men i disse tilfellene, analysen for ekte mutasjonen hadde R
m /R
wt 1.0. Kryssreaktivitet ble bare observert for sonder som dekker det samme basepar posisjon (i posisjon 34 eller 35). Kryssreaktivitet mellom signaler fra basepar 34 eller 35 og posisjon 38 ble ikke observert (Supplementary tabell S4). Derfor er det sannsynlig at ingen kryss-reaktivitet effekter ble observert for to forskjellige
PIK3CA
sonder.
Klinisk praksis
De beskrevne metoder kan implementeres i klinisk praksis. De molekylær diagnostikk testresultatene kan genereres i løpet av kort tid. I daglig praksis er cytologisk eBUS-TBNA eller EUS-FNA aspirasjon materialet morfologisk skrevet av patologer. Deretter blir prøvene gruppert for mikrodisseksjon på en ukentlig basis. Mikrodisseksjon er viktig for å oppnå høy tumorcelle prosenter for å detektere EGFR exon 19 delesjon, og til å tillate andre analyser med lavere følsomhet enn den beskrevne fremgangsmåte, f.eks Sanger-sekvensering. Etter ekstraksjon av DNA, blir de hydrolysen probe-analyser utført på DNA-fortynninger. Ved slutten av den andre dagen, er qPCR resultatene analyseres i et egenutviklet Microsoft Excel-basert analyseverktøyet for å tolke resultatene, for eksempel, bestemme mutasjon statusen til hver sonde og tolke effekten av kryss-reaktivitet. Resultatene blir deretter rapportert til klinikken. En begrensning av hotspot analyse er, per definisjon, at bare de hotspot mutasjoner blir oppdaget, mens Sanger-sekvensering kan identifisere alle mutasjoner i PCR fragment. I noen tilfeller, der mutasjonen analysen ikke oppfyller kvalitetsinnstillingene, vil Sanger-sekvensering utføres. For Sanger-sekvensering, må ekstra PCR reaksjoner, reaksjoner produkt renselser og elektroforese skal utføres, noe som vil kreve to ekstra dager i analysen rørledningen.
Konklusjon
Vi konkluderer med at somatisk mutasjon hotspot analyse for
KRAS
,
PIK3CA
,
BRAF Hotell og
EGFR
av fine nål ambisjoner om mediastinale lymfeknuter i NSCLC er nøyaktig og pålitelig. Somatisk hotspot mutasjonsanalyse for
KRAS
,
PIK3CA
,
BRAF Hotell og
EGFR
kan sikkert utføres ved hjelp av allel-spesifikk qPCR med hydrolyse sonder; mutasjons resultater fra cytologiske prøver og de primære svulster er svært konkordant.
kan utføres Somatiske mutasjon analyse i NSCLC for molekylær iscenesettelse og veiledning av behandlingen beslutninger på eBUS og EUS tynn nål aspirates, prosedyrer som er mindre invasiv for pasienten enn rutine mediastinoskopi.
Våre funn tyder på at den molekylære genetisk analyse av NSCLC bør innarbeides med standard eBUS og EUS prosedyrer. Dette kombinert tilnærming vil resultere i nøyaktig diagnostisering og stadieinndeling av disse pasientene, og vil også bidra til å veilede de optimale behandling beslutninger, spesielt i stadium III og IV NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1. .
Generell oversikt
doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s001 plakater (XLS)
Tabell S2. .
Primer sekvenser
doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s002 plakater (XLS)
tabell S3.
EGFR ekson 19 validering eksperiment
doi:. 10,1371 /journal.pone.0017791.s003 plakater (XLS)
Tabell S4.
Cross reaktivitet i KRAS analyser
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s004
(XLS)
Takk
Vi takker teknikere på molekylær diagnostikk gruppe i LUMC Avdeling for patologi for testing protokollene i ulike biologiske innstillinger og feilsøking ulike aspekter av studien.
