Abstract
Bakgrunn Mål
Tykktarmskreft forekomst og dødsfall er redusert med oppdagelse og fjerning av tidlig stadium, behandle neoplasi men vi mangler bevist biomarkører følsomme for både kreft og pre-invasive adenomer. Målet med denne studien var å finne ut om adenomer og kreft vise karakteristiske mønstre av biomarkør uttrykk og å undersøke om en vev oppdaget (og validert) biomarkør er forskjellig uttrykt i plasma hos pasienter med kolorektal adenomer eller kreft.
Metoder
Kandidat RNA biomarkører ble identifisert ved oligonukleotid microarray analyse av kolorektal prøver (222 normal, 29 adenom, 161 adenokarsinom og 50 kolitt) og validert i en tidligere utestet kohort av 68 kolorektal prøver å bruke en spesialdesignet oligonukleotid microarray. En validert biomarkør,
KIAA1199
, ble analysert ved hjelp QRT-PCR på plasma hentet RNA fra 20 koloskopi erklært friske kontroller, 20 pasienter med adenom, og 20 med kreft.
Resultater
Genome-wide analyse avdekket reproduserbare genekspresjonssignaturer for både adenomer og kreft sammenlignet med kontroller. 386/489 (79%) av adenom og 439/529 (83%) av adenokarsinom biomarkører ble validert i uavhengige vev. Vi har også identifisert gener differensielt uttrykt i adenomer i forhold til kreft.
KIAA1199
ble valgt for videre analyse basert på konsistent oppregulering i neoplasi, tidligere studier og sin interesse som uncharacterized genet. Plasma
KIAA1199
RNA-nivåer var signifikant høyere hos pasienter med kreft eller adenom (31/40) i forhold til neoplasi frie kontroller (6/20).
Konklusjoner
kolorektal neoplasi viser karakteristiske mønstre av genuttrykk.
KIAA1199
er forskjellig uttrykt i neoplastiske vev og
KIAA1199
transkripsjoner er mer rikelig i plasma hos pasienter med kreft eller adenom sammenlignet med kontroller
Citation. Lapointe LC, Pedersen SK, Dunne R, Brown GS, Pimlott L, Gaur S, et al. (2012) Discovery og validering av molekylær Biomarkører for tykktarms Adenomer og kreft med søknad til Blood Testing. PLoS ONE 7 (1): e29059. doi: 10,1371 /journal.pone.0029059
Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center, Kina
mottatt: May 30, 2011; Godkjent: 20 november 2011; Publisert: 19 januar 2012
Copyright: © 2012 Lapointe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delfinansiert av Flinders University of South Australia og Commonwealth Scientific and Research organisasjon Industri (CSIRO) i Australia. Drs. Dunne, Molloy og Brown er ansatt ved CSIRO. Disse organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Det ble også levert av Clinical Genomics Pty Ltd, et selskap som er involvert i oppdagelsen og kommersialisering av biomarkører for tykktarmskreft. Drs. Lapointe, Pedersen, Gaur, McEvoy og Thomas er ansatt i klinisk Genomics Pty Ltd og professor Young er en betalt konsulent for klinisk Genomics Pty Ltd. Funder dermed spilt roller i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og forberedelse av manuskriptet. Mrs. Pimlott og Dr. Wattchow har ingenting å avsløre
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble delfinansiert av Clinical Genomics Pty Ltd, et selskap som er involvert i oppdagelsen og kommersialisering av biomarkører for tykktarmskreft. Drs. Lapointe, Pedersen, Gaur, McEvoy og Thomas er ansatt i klinisk Genomics Pty Ltd Prof. Young er en betalt konsulent for klinisk Genomics Pty Ltd Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP kan behandles hvis oppdaget og fjernet på et tidlig stadium med 95% av pasientene som overlever utover fem år [1]. Det er økende bevis for at fjerning av pre-invasive tykktarms lesjoner, dvs. adenomer ved polypektomi senker forekomsten av, og dødeligheten, tykktarmskreft [2] – [4]. Derfor forebygge tykktarmskreft ved å fjerne skjerm oppdaget adenomer blir stadig mer vektlagt som et viktig mål for tykktarmskreft screening. Enkle screeningtester for tiden tilgjengelig, men er suboptimal for adenom deteksjon, selv om fekal immun tester for globin er mye bedre sammenlignet med tidligere tester [5] – [7]. Befolkningsscreeningprogrammer kan bli bedre hvis en praktisk blodprøve var tilgjengelig som er sensitiv og spesifikk for både de tidligste, mest treatable stadier av tykktarmskreft og også følsom for pre-invasive adenomer. En slik test vil lette en rasjonell screening tilnærming ved å tillate oss å lede koloskopi ressurser til de fagene som er sannsynlig å få mest mulig nytte av den invasive prosedyren [8].
genuttrykksmønster er i økende grad viser lovende for identifisering av kandidat biomarkører for tykktarmskreft, men disse kandidatene mangler ofte hensiktsmessig validering og lite informasjon er tilgjengelig for biomarkører som også er følsomme for adenomer. Antatte biomarkører som følge av funn basert forskning må være strengt validert hvis de skal være klinisk nyttig [9] – [12]. Validering, dvs. teste hypotesen om at søker biomarkører er ekte indikatorer på en fenotype, ideelt sett gjør bruk av en pasient kohort som er klinisk uavhengig av funnet kohort. Videre sammenheng mellom genutrykksmønster i vev og biomarkør oppdagelse i blodet er ikke godt definert.
Formålet med denne studien var å finne ut om adenomer og kreft vise karakteristiske mønstre av biomarkør uttrykk og å undersøke om en vev -discovered (og validert) biomarkør er differensielt uttrykt i plasma fra pasienter med kolorektal adenomer eller kreft. Spesiell oppmerksomhet er gitt til adenom uttrykk mønstre som adenom biomarkører har i stor grad blitt ignorert i litteraturen.
Vi fulgte vårt mål å avdekke sensitive biomarkører for både kolorektal adenomer og kreft ved å følge en tre-fase strategi for oppdagelse, validering og klinisk assay testing. Først ble høy-dimensjonale genuttrykk microarray data analysert for å finne kandidat biomarkører i både kreft og adenomer fra colorectum. For å validere genekspresjon kandidater, ble en spesialdesignet oligonukleotid mikromatriser ( «Adenom Biomarker Gene Chip») konstruert og fabrikert for å inneholde et bredt utvalg av hypotetiske markører funnet under discovery fasen samt markører valgt fra litteraturen. Kandidat biomarkører ble validert ved hjelp av Adenom Biomarker Gene Chip i et uavhengig sett av neoplastiske prøver. Til slutt ble den potensielle kliniske nytten av en lovende vev-validert kolorektal neoplasi biomarkør målt i RNA ekstrahert fra plasma av kolorektal adenom og kreftpasienter og koloskopi-bekreftet friske kontroller. Denne sekvensiell prosess følger de to første stadiene av en fem-trinns evaluering av biomarkører foreslått av Pepe et al [13].
Resultater
neoplastiske kontra ikke-neoplastisk transkriptomet
av 44,928 probesets analysert for genuttrykk forskjell, observerte vi 11,183 (24,9%) probesets å være forskjellig uttrykt i neoplastiske vev i forhold til ikke-neoplastiske vev inkludert colitic prøver. Til sammenligning, observerte vi 2,701 (6,0%) probesets likeledes differensielt uttrykte mellom normal (n = 222) og kolitt (n = 42) vevsekstrakter (Tabell 1). Disse uttrykk data ble også analysert ved den fullstendige genom-nivå ved hjelp av prinsipal komponent analyse (PCA) (figur 1). Den største kilden til ekspresjon endring ble observert i disse 454 mikromatriser (som vist ved begge betyr uttrykket forandring og PCA-plott) korrelert med tilstedeværelse eller fravær av neoplasi. Dette fenotypiske effekten var uavhengig av om de ikke-neoplastiske vev utstilt kolitt og også uavhengig av om de neoplastiske vev var adenomatøs eller kreft
(A) Discovery microarray datasettet. 222 normal, svart; 42 kolitt /IBD, grønn; 29 adenomer, blå; og 161 adenokarsinomer, red. (B) Validering microarray datasettet: 30 normal, svart; 19 adenomer, blå; og 19 adenokarsinomer, red.
Ved å innføre et krav om to ganger endring i signalintensitet mellom neoplastiske og ikke-neoplastiske vev, antall forskjellig uttrykt probesets falt fra 11 183 til 446 (tabell 1). Således viste bare 4,0% av de differensielt uttrykte probesets (1,0% av probesets generelle) minst to ganger uttrykk endring. Interessant, mens antall probesets oppviser en differensial reaksjon av en hvilken som helst størrelse er tilnærmet likt delt mellom probesets med økt ekspresjon i neoplastiske vev (6,227; 55%) og probesets med redusert ekspresjon (4956; 44%), etter å ha påført de to gangers kriterium antall under-uttrykt probesets med nedsatt intensitet i neoplastiske vev var mye større enn antallet probesets med øket intensitet, 338 (76%) versus 108 (24%) henholdsvis. Trenden ble observert i både ikke-neoplastisk versus adenom og ikke-neoplastisk versus kreft sammenligninger. På den annen side, sammenligning av normale og kolitt prøvene viste tilnærmet like mange gener med høyere (60) og nedre (73) ekspresjonsnivåene mellom fenotyper. Mellom adenom og kreft, var det imidlertid betydelig flere gener oppregulert (145) i kreft versus ned regulerte (43). Et sammendrag av differensial uttrykk endring av fenotype er vist i tabell 1 og en liste over godkjente gener opp- og ned-regulert i kreft sammenlignet med adenomer er vist i tabell S1 og S2, henholdsvis.
Probesets som avslørte differensial uttrykk mellom neoplastiske (adenomer og kreft) og ikke-neoplastiske vev (normale og kolitt) ble kartlagt til antatte genet symboler med de nyeste microarray merknadsfiler. 108 probesets forhøyet i neoplastiske vev ved minst to ganger ble kartlagt til 97 genet symboler og 338 redusert probesets ble kartlagt til 264 genet symboler (Tabell S3).
fenotype-spesifikke gener
sett av differensielt uttrykte gener ble ytterligere analysert ved anvendelse av en ny analysemetode som er utviklet av oss å forutsi transkripter som kan bli uttrykt i en fenotype (f.eks neoplasia) men ikke i et annet (f.eks friske kontroller). Ved å bruke denne metoden, ble 23 probeset målene identifisert som mulige kandidater for neoplastisk spesifikke genuttrykk, dvs. hypotetisk slått på i neoplastiske vev men avslåtte i ikke-neoplastiske kontroller. I tillegg ble 35 gener identifisert som kandidater for ekspresjon i ikke-neoplastiske vev bare, dvs. innkoplet i ikke-neoplastiske vev, men avslåtte i neoplastiske vev. Et eksempel på en probeset viser en proto neoplastisk spesifikk reaksjonsmønster er vist i figur 2A, og den fullstendige listen over probesets tilsvarer hypotetisk slått på og avslåtte gener er vist i tabell S4 og S5, henholdsvis.
(A) Discovery datasett, 222 normal, svart; 42 IBDs, grønn; 29 adenomer, blå; 161 adenokarsinomer, red. (B) Validering datasett: 30 normal, svart; 19 adenomer, blå; 19 adenokarsinomer, red. Y-aksen. Normalisert probeset intensitet (log2)
Custom «Adenom Biomarker» gen chip
PCA plot av funndata (fig 1A) viser en sterk neoplasi vs. non-neoplasi segregering involverer de første to viktigste komponent akser, med adenomer og kreft gruppert sammen. For valideringsdata (figur 1B), bekrefter den første hovedkomponent som den største kilden til variansen over disse probesets er tilstedeværelse eller fravær av neoplasi. Den andre hovedkomponent, viser imidlertid at adenomer er gruppert separat fra kreftprøver.
Validering av kandidat biomarkører for kolorektal neoplasi
Av de 108 probesets hvis målene ble antatt å være over- uttrykkes ved minst to ganger i neoplastiske funn vev, ble 103 probesets (95%) forhøyet i de neoplastiske validerings vev (
P
≤0.05, MHT), og av disse 92 (85%) ble forhøyet med ved minst to ganger. Tilsvarende, 297 av de 338 (87%) probeset mål antatt å være under-uttrykt i neoplastiske vev ble også under uttrykt i valideringsforsøk (
P
≤0.05, MHT); i neoplastiske prøver, 247 (73%) av disse genene viste halvparten eller mindre av uttrykket hos normale kontroll vev. Validerings resultatene etter fenotype kontrast er vist i tabell 2. En liste over validert opp- og ned-regulert probesets er vist i tabell S6 og S7, henholdsvis.
Kvantitativ PCR-analyse for å måle RNA biomarkør nivåer i vev eller plasma
en av de mest forskjellig oppregulert probesets både oppdagelsen (fig 3A) og validering (fig 3B) oppdaget transkripsjoner fra
KIAA1199
, et gen av ukjent funksjon. I valideringsdatasettet, probeset 1008852-HuGene_st (
KIAA1199
) ble uttrykt mer enn 25 ganger høyere i kolorektal neoplasi i forhold til ikke-neoplastiske kontroller (Tabell S6). Disse resultatene bekreftet tidligere rapporter, som fant at
KIAA1199
mRNA kan være en kandidat biomarkør for kolorektal adenom [14]. Basert på vår gjentatt observasjon av differensial uttrykk i neoplastiske vev, den tidligere bevis på oppregulert uttrykk i både adenomer og kreft og det interessante faktum at
KIAA1199
ikke tidligere har vært preget i form av struktur eller funksjon, vi valgte
KIAA1199
å teste ideen om at vevet uttrykk mønstre kan gjenspeiles i blodet. For ytterligere å undersøke biomarkør potensialet i
KIAA1199
vi utviklet en real-time PCR-analyse for påvisning av RNA-transkripter avledet fra denne locus.
(A)
KIAA1199
uttrykk målt via probeset 212942_s_at i oppdagelsen datasettet av 454 kolorektal vevsprøver (x-aksen indeksert av fenotype); Norm: 222 normale prøver, svart; IBD: 42 «kolitt» prøver, grønn; ADE: 29 adenomer, blå; CA: 161 kreftprøver, red. Y-akse: normalisert probeset intensitet (log2). (B)
KIAA1199
uttrykk målt via probeset 1008852-HuGene_st i valideringsdatasettet i 68 kolorektal vevsprøver. X-aksen; Norm: 30 kolon vevsprøver normale, svart; ADE: 19 adenomer, blå; CA: 19 kolorektal kreft prøver, red. Y-akse: normalisert probeset intensitet (log2). (C) En kvantitativ real-time SYBR-grønn
KIAA1199
PCR-analyse brukes til RNA ekstrakter som brukes til validering microarray data: 30 normal, svart; 21 adenomer, blå; 20 tykktarmskreft, røde prøver. Data er gjennomsnittsverdier for duplikater, normalisert mot HPRT1 og avbildet som delta-delta-Ct-verdier. Legg merke til at tre ekstra neoplastiske prøver var tilgjengelig for PCR eksperimenter som ikke ble testet av tilpassede microarray.
Først en SYBR-grønn basert real-time PCR for
KIAA1199
ble brukt å bekrefte vevet validering microarray data; resultatene var i god overensstemmelse med de mikroarray data for dette gen (figur 3C). Deretter ble
KIAA1199 plakater (og
GAPDH
kontroll) transkripsjonsnivåer målt i RNA ekstrahert fra plasma brøkdel av 40 pasienter med kolorektal neoplasi (adenom eller adenokarsinom) og 20 friske kontroller (alle kategorier ha er bekreftet av kliniske patologiske funn) bruker kommersielt tilgjengelige TaqMan qPCR analyser.
GAPDH
RNA transkripsjoner var påvist i alle 60 plasmaprøver ble testet (fig 4A) og moderat høyere
GAPDH
RNA-nivåer ble observert i plasmaprøver fra pasienter diagnostisert med tykktarms adenomer eller kreft sammenlignet med friske donorer (ikke signifikant, p-verdiene 0,05). Høyere konsentrasjoner av
KIAA1199
RNA transkripter ble detektert i plasma fra pasienter med kolorektal neoplasi enn i plasma fra friske kontroller (fig 4B).
KIAA1199
RNA ble påvist i plasma fra 31 av de 40 (77,5%) pasienter med kolorektal neoplasi og i 6 ut av 20 (30%) neoplasi-frie pasienter.
(A )
GAPDH Hotell og (B)
KIAA1199
RNA-nivåer i plasma fra 20 friske forsøkspersoner (svart) og fra 20 pasienter med kolon adenomer (blå) og 20 CRC pasienter (rød). Data er gjennomsnitts Ct verdier (tre paralleller) normalisert for utvinning avkastning forskjeller og avbildet som fold-change forskjeller i forhold til median uttrykk målt i de 20 normale personer. P-verdier ble beregnet ved hjelp av tosidige Mann-Whitney t-test.
Diskusjoner
Denne studien bekrefter at kolorektal mRNA transkripsjoner er uttrykt forskjellig i både adenom og kreft vev i forhold til kontrollene , med noen transkripsjoner blir oppregulert i neoplasi mens andre er nedregulert. Vi bekreftet at 103 av 108 (95%) probesets funnet å være oppregulert i neoplasi ble også uttrykt forskjellig under validering testing. 87% (297/338) av nedregulert probesets ble også bekreftet under validering testing. Genom kovarians mønstre viste at nærvær eller fravær av neoplasi korrelert med den største kilden til varians på tvers av alle probesests og alle matriser i uttrykket data (figur 1A). Omtrent 25% av 44,928 oppdagelse probeset målene ble uttrykt forskjellig mellom neoplastisk vev og ikke-neoplastiske kontroller. Alle andre fenotype kontraster resultert i færre probesets viser en differensial respons. Disse resultater viser at neoplastisk status har en større innvirkning på genekspresjon enn, for eksempel, kolitt eller til og med forskjellen mellom pre-invasiv adenom vev og ondartet kreft.
Resultatene er enig med en hyppig observert trend i kolorektal cancer genuttrykk forskning som viser et høyere antall gener er nedregulert i adenom og kreft vev sammenlignet med ikke-neoplastiske kontroller [15]. Dette uttrykket mønster kan reflektere økte nivåer av hypermethylation forbundet med onkogenese [16].
På den annen side, viser denne undersøkelsen at flere gener synes å være oppregulert i overgangen fra adenom til adenokarsinom (tabell S1) . Denne observasjonen kan reflektere underliggende økt histologisk kompleksiteten av kreft sammenlignet med adenom vev eller, mer interessant, kan demonstrere en sammenheng mellom økt antall uttrykte gener og progresjon til en invasiv fenotype og metastasering. Den største gruppen (14%) av gener opp-regulert i kreft sammenlignet med adenomer er fra kollagenet familien, men listen inneholder også fire forskjellige arter av matrise metaloproteinases som antyder økt aktivitet av gener med invasjon potensial (tabell S1).
videre er denne studien involverte utformingen av en tilpasset mikromatrise som inneholdt et sett av gener som viser at adenomer kan separeres fra kreft prøver basert på genuttrykksmønster (figur 1B). Disse resultatene støtter ideen om at ikke bare er den neoplastiske genutrykksmønster konservert mellom oppdagelsen og valideringsdata, men også adenom vs. kreft uttrykk signatur likeledes er bevart. Vi kjenner ikke til noen tidligere genuttrykk studie som har vist evne til å skille mellom ikke-neoplasi, pre-invasive neoplasi og invasive fenotyper. Dette utvalget av gener åpner for identifisering av biomarkører for bruk i sensitiv og spesifikk påvisning av adenomer.
Den andre Målet med denne studien var å undersøke om utvalgte kandidat biomarkører oppdaget i vev var påvisbare og forskjellig uttrykt i plasma hos pasienter med adenomer eller kolorektal kreft sammenlignet med ikke-neoplastisk kontrollplasma. Dette trinnet er avgjørende for oversettelse av vev funn i klinisk anvendelige endepunkter. Ellers må markør oppdagelse starte i diagnostiske kliniske prøver (f.eks blod) som utgjør større utfordringer enn å starte med relativt RNA-rik Dypfryst vev. Denne rapporten beskriver en proof-of-concept plasma-baserte qPCR metode som måler mRNA transkripsjoner av
KIAA1199
, et gen av ukjent funksjon som vi bekrefter å være forskjellig uttrykt i både vev og plasma av kreft og adenom pasienter.
Biomarkører for kolorektal neoplasi
Det er et stort og voksende litteratur av tykktarms genuttrykk relaterte eksperimenter [17], [18]. Studien som presenteres her utvider og forbedrer på at kroppen arbeid. En forholdsvis stor meta-analyse av Chan et al. av 25 genekspresjon funn studier relatert til kolorektal kreft identifisert fem gener å være oppregulert i sju eller flere uavhengige analyser, inkludert
TGFBI
,
IFITM1
,
MYC
,
SPARC
,
GDF15 product: [17]. Alle fem av disse genene ble bekreftet å være oppregulert i vår studie.
Få studier løse uttrykk forskjeller mellom kolorektal adenom og normal kolorektal vev. Galamb et al. brukte mikromatriser å identifisere et sett av tre gener (
KIAA1199
,
FOXQ1
, og
CA7
) som ble uttrykt forskjellig i adenomer i forhold til vanlige kontroller, samt en sett av fem gener (
VWF
,
IL8
,
CHI3L1
,
S100A8
, og
GREM1
) som kan diskriminere kreft vev fra normale kontroller [19]. Av disse genene, vår studie fant at
KIAA1199
,
FOXQ1 Hotell og
IL8
ble uttrykt forskjellig i adenomer (og i kreft) i forhold til normale kontroller.
KIAA1199
Denne studien bekrefter tidligere rapporter som
KIAA1199
viser et forhøyet nivå av mRNA uttrykk i forstadier adenomer, en oppregulering som vedvarer i kreftvev [14]. Dette genet var også en av de beste merkene er identifisert av Marra laboratorium som en tidligere ukjent mål av Wnt-indusert uttrykk og en mulig ny biomarkør for kolorektal neoplasi. Sabates-Bellver et al. viste at
KIAA1199
ekspresjon i normal slimhinne var begrenset til celler i den nedre del av tarm krypter, mens forhøyede
KIAA1199
ekspresjon ble observert i alle de adenomer som de studert.
rolle
KIAA1199
er ikke kjent, men bevis på Wnt-induserbarheten tyder dette genet kan være en del av nedstrøms kaskade av Tcf /LEF transcriptionally aktiverte gener som vanligvis trengt på gastrointestinal neoplasi [14] . Gastric adenokarsinomer uttrykker høye nivåer av
KIAA1199
er korrelert med dårligere fem års overlevelse utfall i forhold til de pasientene med lav
KIAA1199
uttrykk [20]. Colon kreft celler behandlet med selektive cyklooksygenase-2-hemmere vise reduserte
KIAA1199
uttrykk [21], mens høye nivåer av
KIAA1199
mRNA er positivt korrelert med celle dødelighet i humane fibroblaster [22].
En proof-of-concept blodprøve for adenomer
til tross for den raskt voksende database av mulige kreft biomarkører, noen lovende kandidater i løpet av første oppdagelsen forskning overleve påfølgende validering testing med uavhengige vev. En enda mindre brøkdel av kandidater fortsette å vise løftet når disse genene er valgt for analysen utvikling og klinisk testing. Vi har identifisert hundrevis av biomarkører for kolorektal neoplasi som har overlevd validering i uavhengige kliniske prøver. For en overbevisende neoplastisk vev biomarkør,
KIAA1199
, vi har også testet en enkelt-gen qPCR analyse som viser løfte i å skille mellom plasmaprøver fra pasienter med kolorektal neoplasi og fra friske individer. Dette genet, som var en av mange «validerte» gener, ble valgt for videre studier basert på biomarkør ytelse rapportert her, tidligere rapporter som viste
KIAA1199
å være forhøyet i kolorektal neoplasi og fordi den biologiske funksjonen til dette genet er ukjent. Plasma
KIAA1199
nivåer ble forhøyet hos pasienter som hadde koloskopi-bekreftet adenomer eller kreft i forhold til å kontrollere plasma fra neoplasi frie individer, selv om den tilsynelatende sensitivitet på denne singelen markør var høyere for kreft enn for adenomer.
Som en biomarkør med potensial for diagnosen i ikke-invasive pasientprøver,
KIAA1199
skal nå vurderes for innlemmelse i mRNA (og muligens protein) prøver og undersøkt i større kliniske og screening studier. Av spesiell interesse vil være forholdet mellom
KIAA1199
uttrykk til de ulike genetiske veier av tykktarms onkogenese, for eksempel
Wnt
signalveien, som vanligvis trengt på kolorektal kreft og adenomer.
Colorectal neoplasi viser karakteristiske mønstre av genuttrykk.
KIAA1199
er forskjellig uttrykt i neoplastiske vev og
KIAA1199
transkripsjoner er mer rikelig i plasma hos pasienter med kreft eller adenom sammenlignet med kontroller.
KIAA1199 Hotell og andre validerte biomarkører som er beskrevet her, garanterer videre evaluering som blodbaserte screeningtester for kolorektal neoplasi. En sentral utfordring for videre evaluering vil være å også ta en test relative følsomhet for adenomer og kreft gitt mye høyere forekomst av godartede neoplastiske kolorektale adenomer i forhold til ondartet neoplastisk tykktarmskreft.
Materialer og Metoder
Alle microarray data som brukes i denne studien ble dokumentert i samsvar med MIAME standarder for microarray eksperimenter.
Discovery data
Kolorektal vevsprøver som brukes for biomarkører ble samlet av Genelogic Inc (Gaithersburg, MD, USA) fra pasienter som ga skriftlig samtykke i henhold til etiske standarder satt av en uavhengig gjennomgang styret består av forskere og bioethicists som ikke var ansatt i Gene Logic. Hver institusjon som leverte vevsprøver til GeneLogic innhentet informert samtykke fra hver giver eller eventuelt deres autoriserte representant, og møtte kravene i den aktuelle Institutional Review Board og alle gjeldende lover, genekspresjon profilering data målt i 548 kolorektal vevsprøver ved hjelp av Affymetrix HGU133A HGU133B genet chips (44,928 probesets kombinert) (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og tilhørende kliniske data ble kjøpt fra GeneLogic Inc. eksperimentelle og kliniske beskrivelsene ble gitt for alle chip datafiler i tillegg til digitalt arkivert mikroskopi bilder av histologiske preparater. Før gjennomføring av oppdagelsen forskning ved hjelp av disse dataene, ble streng kvalitetskontroll testing brukes på disse dataene. Totalt 454 mikromatriser møtte kvalitetskontroll krav og ble dømt egnet for denne oppdagelsen forskning. Ytterligere detaljer om kvalitetskontrollen som brukes på disse dataene re gitt i saksdokumenter S1 Quality Control Analysis. Beskrivelse av vev fenotyper for disse funn data er vist i tabell 3 med kreft fenotype sammenbrudd i tabell 4.
fenotype spesifikke uttrykk mønstre
I tillegg til standard differensial uttrykk analyse, introduserte vi en analytisk teknikk utviklet for å filtrere forskjellig uttrykt probeset kandidater til transkripsjoner at vi hypoteser ble kvalitativt «slått på» i en fenotype klasse og kvalitativt «slått av» i en komparator fenotype. For denne metoden, ble identifisering av «off» gener basert på den relativt enkle antagelse at de fleste genene i et gitt vev var
ikke anbefale konstitutivt uttrykt ovenfor en nominell relativt lavt bakgrunnsnivå. Følgelig, en microarray er utformet for å hybridisere til hele human transkriptomet bør derfor ikke oppvise transkript-spesifikk binding for de fleste probesets i et gitt eksperiment. Omvendt bør den fluorescerende intensitet av probesets som hybridiserte til balansen av ikke-uttrykt transkripter gjenspeile «ikke-spesifikk» probeset-transkript hybridisering. Antagelsen om at en stor andel av de probesets for et gitt eksperiment var ikke transkripsjons-spesifikke signaler tilveiebrakt midler for å beregne en teoretisk på /av terskelen for gener i hel-genom eksperimenter som er brukt her for oppdagelse. Det betyr uttrykket nivået for alle 44,928 probesets i 454 oppdagelse mikromatriser ble rangert og probeset verdi tilsvarende 30
th persentil verdien over dataene ble valgt som terskelen for transkripsjonen stillhet. Denne terskelen representerer en konservativ øvre bundet estimat av ikke-spesifikk eller bakgrunn uttrykk
Validering data:. Vevsprøver
For alle validering (dvs. hypotesetesting) eksperimenter, uavhengig innsamlede Dypfryst vevsprøver ble hentet fra en tertiær henvisning sykehus vev bank (Flinders Medical Centre, Adelaide, SA Australia). En beskrivelse av tilfellene brukes til validering testing er vist i tabell 3. Denne studien ble godkjent av Research and Ethics Committee av Hjemsendelse General Hospital og etikkomiteen av Flinders Medical Centre. Skriftlig informert pasienten samtykke ble mottatt for hvert vev studert. Kirurgiske prøver ble samlet inn og behandlet som tidligere beskrevet [23]
Validering Data:. Custom microarray design
For å teste de mange hypotetiske genet biomarkører identifisert ved oppdagelse analyser, en spesialdesignet microarray, den «Adenom Biomarker Gene Chip», ble fabrikkert (Affymetrix). Den Adenom Biomarker Gene Chip rekke tatt med alle HGU133-A /B-probesets identifisert under discovery samt exon-nivå probesets som ikke var tilgjengelig på tidspunktet for den opprinnelige funn øvelsen. Hver HGU133 oppdagelse probeset på Adenom Biomarker Gene Chip ble kommentert til ett eller flere menneskelige genet symboler basert på NCBI merknadsverktøy (NCBI36 /hg18) og disse gen-symbolene ble deretter reversere kartlagt tilbake til ekson-nivå probesets designet av Affymetrix for HuGene ST 1.0 Genechip. Skikken microarray inkludert «perfect-kamp» probesets bare
Validering Data:. RNA Utvinning
En fenotypiske nedbryting av vev som brukes til validering testing er vist i tabell 3. RNA ble ekstrahert fra fryst vev prøver ved hjelp Trizol (Invitrogen, San Diego USA) som anbefalt av produsenten. Kort fortalt ble frosset vev homogenisert i 300 mL av Trizol reagens ved hjelp av en modifisert Dremel drill og sterile engangs pestles. 200 ul av Trizol reagens ble tilsatt til homogenatet, og prøver ble inkubert ved romtemperatur (RT: 25C) i 10 minutter. 100 ul (% v /v) kloroform ble deretter tilsatt, prøvene ble rystet i 15 sekunder, og inkubert ved RT i 3 minutter.
