Abstract
Kreft side befolkningen (SP) celler, som ofte omtales som kreft stamceller, er antatt å være ansvarlig for lungekreft kjemoterapi motstand, og for tiden ingen stoffet kan spesifikt mot disse cellene. Vi hypotese lav-molekylvekt heparin (LMWH) kan påvirke de biologiske egenskapene til SP-celler, og kan brukes til å klinisk målrette disse cellene. For å teste dette, ble SP celler isolert fra cisplatin (DDP) -resistente lunge adenokarsinom A549 /DDP celler ved flowcytometrisk sortering. Sammenlignet med ikke-SP celler, dannet SP celler økt antall kolonier
in vitro
, og hadde en 1000-dobling i tumorigenicity
in vivo
. Spredning og apoptose analyser viste LMWH hadde ingen signifikant effekt på lunge SP celleproliferasjon eller apoptose. Imidlertid LMWH redusert lunge SP-celle kolonidannelse evne og protein ekspresjon av flermedisin transportøren, ABCG2, ved FACS og western blot analyser uten å påvirke dets mRNA-nivåer ved RT-PCR. Konsekvent, immunhistokjemi stainings av ABCG2 i LMWH-behandlet tumorvev ble betydelig redusert sammenlignet med de i kontrollene. Videre fant vi proteasomal inhibitor MG132, men ikke lysosomal hemmere leupeptin og pepstatin A, kunne gjenopprette ABCG2 proteinnivået i LMWH behandlet SP celler. Disse tyder LMWH ablates lunge SP celle chemoresistance av proteasome-mediert reduksjon av ABCG2 protein nivåer uten å påvirke sine mRNA nivåer. Vi har også bestemt LMWH kombinert med cisplatin kunne overvinne cisplatin-motstand og induserte lunge SP celler apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo
. Denne studien gir et eksperimentelt grunnlag for å bruke en kombinasjon av LMWH, som retter seg mot lunge SP celler, med cellegift for å forbedre lungekreft overlevelse
Citation. Niu Q, Wang W, Li Y, Ruden DM, Wang F, Li Y et al. (2012) lavmolekylært heparin ablates Lung Cancer Cisplatin-Resistance ved å fremkalle Proteasome-mediert ABCG2 protein degradering. PLoS ONE syv (7): e41035. doi: 10,1371 /journal.pone.0041035
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 12 mars 2012; Godkjent: 17 juni 2012; Publisert: 23.07.2012
Copyright: © 2012 Niu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Scientific Research Foundation for den returnerte Overseas Chinese Scholars, China State Kunnskapsdepartementet (nr 2007-1108) til QN og National Institutes of Health gi ES012933 til DMR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdød på verdensbasis. Foreløpig lungekreft overlevelse er dårlig, med en 5-års overlevelse på 15% [1].
kreft stamcelle (CSC) Teorien sier at svulster er organisert i en hierarkisk måte som ligner på normalt vev , med en sub-populasjon av tumorigene stilk-liknende celler som er kjemoresistent og generere de differensierte tumorcellene [2]. Side befolkningen (SP) celler med CSC-lignende egenskaper ble først identifisert i leukemi og senere isolert fra solide tumorer, inkludert bryst, hjerne, lunge, lever, prostata, tykktarm, bukspyttkjertel, og hode og nakke kreft [3] – [9] . SP-celler uttrykker høye nivåer av ATP-bindende kassett (ABC) multimedikamenttransportørproteiner som antas å være grunnlaget for kjemoterapi motstand og behandlingssvikt. Brystkreft motstand protein (BRCP /ABCG2), et medlem av ABC proteiner familie, er en stor narkotika transporter som anses å spille en nøkkelrolle i å beskytte SP celler fra cytotoksiske midler, for eksempel cisplatin, og er involvert i multiresistens [10 ] – [12]
til tross for mange midler som er målrettet mot CSC-celler er identifisert, disse potensielle midler er langt fra anvendelse i klinikken.. Kandidat CSC cellemålsøkende molekyler påvirker Wnt, EpCAM, Hedgehog, og Delta /Notch signalering, mens andre tilnærminger inkludert anti-Delta-lignende 4 ligand (DLL4) antistoff, salinomycin, metformin, TGFB, sulforaphane, og andre har blitt testet for å endre CSC resistens egenskaper [13] – [17]. Selv om mange av disse midlene synes lovende, spesielt
in vitro
, det store problemet for spesifikk målretting for å cscs celler og unngåelse av
in vivo
toksisitet gjenstår.
Lav molekylvekt heparin (LMWH) ble godkjent av FDA i 1998 for antikoagulasjonsbehandling og har blitt administrert trygt i over 13 år [18]. Undersøkelser viste at molekylvekt heparin behandling lav redusert kreftdødelighet hos pasienter med dyp venetrombose i ulike kreftformer, som ikke er knyttet til forskjellene i dødelighet av tromboembolisme [19] – [21]. Selv om flere kliniske studier har vist at LMWH redusert dødelighet og forlenget overlevelse hos pasienter med avansert solid malignitet, forblir mekanisme som LMWH utøver en anticancer effekt udefinert [22] – [25].
Vi hypotese LMWH kan være i stand til å endre de biologiske egenskapene til lunge SP celler med CSC-lignende egenskaper. Derfor er denne studien undersøker om LMWH påvirker lunge SP-celle proliferasjon, apoptose, og chemoresistance samt tumorvekst
in vivo
og mekanismen som LMWH tar effekter. Våre studier tyder LMWH kan være en trygg lunge SP celle rettet mot stoff som kan brukes umiddelbart i klinikken for å overvinne kjemoterapi motstand og forbedre lungekreft overlevelse.
Resultater
Side Befolkning Sortering
Strømningscytometri-analyse med Hoechst33342 farging viste at en SP på 10% -17% celler eksisterte i A549 /DDP-celler. Som en positiv kontroll ble antallet av SP-celler redusert i nærvær av Verapamil, et stoff som er kjent for å hemme den ABC trasporter pumpe som er ansvarlig for side populasjonen fenotype. Renheten av SP-celler var mer enn 95% (gjennomsnitt 97%) og renhet av ikke-SP-celler var 95%. SP og ikke-SP A549 /DDP-celler ble sortert separat og anvendt for videre eksperimenter (figur 1).
(A) A549 /DDP-celler inkubert med Hoechst 33342, uten verapamil, og den eske region angir SP på FACS. (B) A549 /DDP-celler inkubert med Hoechst 33342 i nærvær av verapamil, til en styre identifisere SP-regionen på FACS. Representative mikrofotografier av A549 /DDP kolonier dannet etter 10 dager mellom (C) SP-celler (d) ikke-SP-celler dyrket i serumfritt medium, og (E) SP-celler (F) ikke-SP-celler behandlet med LMWH, målestokken = 50 um. (G) Logg kolonidannende effektivitet (CFE) av SP og ikke-SP celler dyrket i serumfritt medium,
p
0,05. (H) Svulster dannet etter inokulering av forskjellige antall A549 /DDP side befolknings (SP) og ikke-SP celler i NOD /SCID mus etter 14 dager.
LMWH Reduserer SP Cell Colony Forming Evne
evnen til SP og ikke-SP celler til å danne kolonier ble testet
in vitro
. Kolonier av begge celletyper var synlig etter 10 dager; imidlertid antall kolonier var signifikant økt i SP-celler sammenlignet med ikke-SP-celler. Den Log10 kolonidannende effektivitet (CFE) fra SP celler var betydelig høyere enn ikke-SP celler (1,544 ± 0,150 vs 0,301 ± 0,082,
p
0,05, figur 1). LMWH betydelig redusert CFE i SP celler (1,544 ± 0,150 g 0,812 ± 0,082,
p
0,05) sammenlignet med ikke-SP celler (0,301 ± 0,082 vs 0,295 ± 0,053, p 0,05).
SP Cells har økt
in vivo
tumorigenitet
in vivo
tumorigent analysen indikerte at 5 × 10
3 SP celler var tilstrekkelig for tumordannelse
in vivo
, mens mer enn 5 x 10
6 ikke-SP-celler var nødvendig for å initiere tumorer (figur 1). Tumorer ble funnet i alle seks mus injisert med 5 x 10
5 og 5 x 10
4 SP-celler, men ingen tumor ble funnet i mus injisert med det samme antall ikke-SP-celler. Ingen svulster ble observert når 1 × 10
6 ikke-SP celler ble vaksinert. Vi konkluderer med at det var en større enn 1000 ganger forskjell i tumorigenicity mellom SP og ikke-SP celler.
LMWH påvirker ikke SP Cell Proliferation
Effekten av LMWH på SP celleproliferasjon var bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. LMWH hadde ingen signifikant effekt på SP celleproliferasjon sammenlignet med kontrollgruppen SP celler (inhiberingshastigheten av LMWH behandlet SP celler var 3,11% ± 0,20%,
p
0,05, figur 2).
Annexin V farving i (A) kontroll SP-celler (B) SP-celler behandlet med LMWH (C) SP-celler behandlet med cisplatin og (D) SP-celler behandlet med LMWH og cisplatin. (E) Kvantifisering av apoptose priser A549 /DDP SP celler indusert av LMWH og DDP. Ingen signifikant forskjell ble observert i kontroll og LMWH-behandlede SP-celler. Apoptose indusert av LMWH pluss DDP var betydelig høyere enn DDP alene (
p
0,05). (F) Hemmingsraten av LMWH-behandlede A549 /DDP SP-celler i MTT-analyse. Ingen signifikant forskjell ble observert i hemming hastighet av kontroll og LMWH-behandlet SP celler.
LMWH Øker Cisplatin (DDP) apoptose i SP Cells
Effekten av LMWH på apoptose i SP-celler ble analysert ved FACS. Det var ingen signifikant forskjell i forekomsten av apoptose i LMWH behandlet SP celler og kontroll SP celler (7,21% ± 0,81% vs. 8,01% ± 0,91%,
p
0,05); Men hastigheten av apoptose i LMWH pluss DDP behandlede SP-celler (65,89% ± 5,98%) var betydelig høyere enn SP-celler behandlet med DDP alene (45,74% ± 4,12%,
p
0,05) og kontroll SP celler (8,01% ± 0,91%,
p
0,05, figur 2).
LMWH Reduserer uttrykk for SP celle overflaten markør ABCG2
A549 /DDP SP celler uttrykker ABCG2, CD243 (p-gp) og CD24 på høye nivåer. Etter inkubasjon med LMWH i 36 timer, ble ABCG2 protein ekspresjon betydelig redusert i SP-celler: ABCG2 uttrykkende celler ble redusert fra 42,25% ± 4,11% til 9,92% ± 4,08% (
p
0,05, figur 3) . Ingen vesentlig endring ble observert i uttrykket av p-gp og oktober-4 etter inkubasjon med LMWH (figur 3).
(A) Uttrykk for ABCG2 (CD338) i kontroll SP celler og (B) indusert av LMWH i A549 /DDP SP celler. (C) Ekspresjon av ABCG2 (CD338) i kontroller tumorceller, og (D) indusert av LMWH i A549 /DDP SP xenograft tumorceller. (E) Kvantifisering av uttrykk for CSC markør uttrykk indusert av LMWH i SP celler og xenograft tumorceller. LMWH betydelig nedregulert uttrykk for ABCG2 ved FACS (
p
0,05).
FACS Analyse av ABCG2 Expression i tumorceller
Celler hentet fra xenograft tumor vev uttrykt ABCG2, CD243 (p-gp) og CD24. Proteinet ekspresjon av ABCG2 i tumorvev av LMWH-behandlede mus var signifikant lavere enn de i kontrollmusene (30,38% ± 2,13% mot 20,22% ± 2,01%,
p
0,05, figur 3). Ingen vesentlig endring ble observert i uttrykket av p-gp og oktober-4 etter inkubasjon med LMWH (figur 3).
LMWH påvirker ikke ABCG2 mRNA uttrykk i SP celler og kreftceller, med RT-PCR
for å finne ut om LMWH affets ABCG2 uttrykk på mRNA-nivå, utførte vi QRT-PCR analyse av SP celler behandlet med LMWH i 16 timer og kreftceller fra LMWH behandlet og kontroll mus. Ingen signifikant forandring ble funnet i ABCG2 mRNA nivå følgende LMWH behandling (figur 4). Dermed LMWH usannsynlig påvirker ABCG2 uttrykk på sitt mRNA nivå.
(A) ABCG2 mRNA uttrykk endringer i LMWH behandlet tumorceller og LMWH behandlet SP celler. Kvantitativ real time RT-PCR viser at uttrykket av ABCG2 mRNA ikke ble vesentlig endret i LMWH behandlet tumorceller eller LMWH behandlet SP celler sammenlignet med de i kontrollene (
p
0,05). β-aktin ble benyttet som intern referanse. (B) Western blot-analyse av ABCG2 uttrykk i SP-celler behandlet med LMWH, LMWH + MG123, lavmolekylært heparin + pepstatin A + Leupeptin, og kontroll. SP-celler ble først behandlet med lavmolekylært eller kontroll i 10 timer, og deretter MG132 (10 uM), Pepstain A + Leupeptin (hver 100 ug /ml) eller kontroll ble tilsatt tilsvarende og inkubert i 6 timer. Deretter ble cellene høstet for western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Tetthetene til de ABCG2 proteinbånd i western blot, ble kvantifisert med den Mengde One-4.6.2 program. (C) ABCG2 uttrykk i LMWH behandlede og kontroll tumorvev (IHC, SP x 200). Den gjennomsnittlige SI score på ABCG2 uttrykk i LMWH behandlet tumorvev ble 3,63 sammenlignet med gjennomsnittet SI score på 9,13 i kontroll tumorvev (3,63 ± 1,69 vs 9,13 ± 2,03,
p
0,05).
ABCG2 Protein Expression kan gjenopprettes ved Proteasomal Inhibitor MG132 i LMWH behandlet SP Cells
Siden vi ikke fant en betydelig endring av ABCG2 mRNA nivåer i SP og kreftceller, vi testet om LMWH indusert ABCG2 reduksjon forårsakes av ubiquitin-formidlet protolysis eller ved lysosomet. For å teste dette, ble SP celler behandlet med LMWH, LMWH + MG132, og LMWH + pepstatin A + Leupeptin. Som vist i fig. 4, ABCG2 protein uttrykk i LMWH behandlet SP celler ble betydelig redusert sammenlignet med kontroll etter 16 timers behandling. Reduksjonen kan gjenopprettes ved proteasomal inhibitor MG132 behandling mens lysosomale hemmere pepstatin Et pluss leupeptin hadde ingen effekt. Dette tyder på at LMWH indusert ABCG2 protein degradering gjennom proteasome veien.
LMWH Behandling Reduserer ABCG2 Protein Expression i svulstvev ved Immunohistochemistry
ABCG2 uttrykk ble til stede i forskjellige intensiteter og ulike celle distribusjoner av immunhistokjemi flekker . Betydelig lavt nivå av ekspresjon av ABCG2 ble observert i LMWH behandlede tumorvev sammenlignet med kontroller. Etter staging kriteriene for flekken intensitet (SI), gjennomsnittlig SI score på ABCG2 uttrykk i LMWH behandlet tumorvev ble 3,63 sammenlignet med gjennomsnittet SI score på 9,13 i kontroll tumorvev (3,63 ± 1,69 vs 9,13 ± 2,03,
p
. 0,05, figur 4)
Cisplatin Xenotransplantat vekstforsinkelse økes med LMWH
Administrasjon av LWMH pluss DDP til A549 /DDP tumorbærende mus resulterte i betydelig redusert tumorvekst sammenlignet med DDP alene (0,17 ± 0,05 cm
3 vs 0,29 ± 0,06 cm
3
p
0,05) eller kontroll mus (0,44 ± 0,09 cm
3
p
0,05) etter 30 dager. I A549 /DDP tumorbærende nakne mus, forskjellene i LMWH kombinert med cisplatin og cisplatin-behandlede svulster var betydelig etter 25 dager (0,17 ± 0,03 cm
3 vs 0,24 ± 0,08 cm
3
p
0,05) og innen 23 dager i kontrolldyrene (0,16 ± 0,09 cm
3 vs 0,27 ± 0,09 cm
3
p
0,05, figur 5). Ingen signifikant forskjell i tumorvolum av de LMWH og DDP grupper ble funnet fra dag 8-30 (figur 5).
A549 /DDP SP-celler ble inokulert i BALB /c nakne mus, og tumorvolumene ble registrert som begynner dag 1 av behandling med fysiologisk saltvann kontroll, LMWH, DDP og DPP pluss LWMH. Forskjellene i kreft størrelser i LMWH kombinert med cisplatin og cisplatin-behandlede svulster var betydelig etter 25 dager (0,17 ± 0,03 cm
3 vs 0,24 ± 0,08 cm
3
p
0,05) og innen 23 dager i kontrolldyrene (0,16 ± 0,09 cm
3 vs 0,27 ± 0,09 cm
3
p
0,05). Ingen signifikant forskjell i tumorvolum av LMWH og DDP grupper ble funnet fra dag 8-30.
Diskusjoner
Isolering av lunge SP celler med CSC-lignende egenskaper og identifikasjon av eksisterende legemidler som modifiserer lunge SP celler og overvinne sin chemoresistance kan tilby innovative strategier for å forbedre klinisk utfall i lungekreft. Vi viste at SP celler fra A549 /DDP cisplatin-resistente human lunge adenokarcinomceller er beriket i CSC-lignende egenskaper som de har betydelig økt kolonidannelse
in vitro Hotell og tumorigenicity
in vivo
, noe som indikerer at A549 /DPP SP celler gir en god modell for å studere lunge SP celler og et nytt system for å studere chemoresistance.
Vår studie viser at LMWH ikke direkte drepe lunge SP celler eller indusere SP celle apoptose
i vitro
. Men sensitizes LMWH cisplatin-resistente SP celler til cisplatin-indusert apoptose
in vitro
.
In vivo
eksperimenter viser at LMWH kombinert med cisplatin signifikant hemmer cisplatin bestandig svulst xenograft vekst. Videre studier viser at LMWH reduserer ABCG2 protein uttrykk, ved FACS og western blot analyser. Yoh fant at uttrykk for ABCG2, men ikke av Pgp, MRP1, MRP2, og MRP3, var en prediktiv faktor for dårlig klinisk utfall i avansert NSCLC pasienter selv om rollen som ABCG2 som transportør av platina konjugater er fortsatt kontroversiell [12]. Våre resultater er konsistente med sine funn og alle disse tyder klart ABCG2 er et stoff transporter som spiller en viktig rolle i cisplatin motstand i SP celler. Immunhistokjemi analyser konsekvent viste at LMWH reduserer ABCG2 protein uttrykk i LMWH-behandlede tumor vev sammenlignet med kontroller. Alle disse tyder på at LMWH kan hindre chemoresistance av SP celler ved å redusere ABCG2 protein uttrykk uten at det påvirker dets mRNA nivåer.
Videre studier viser at ABCG2 proteinet reduksjon i SP celler skyldes indusert nedbrytning av LMWH gjennom ubiquitin- proteasome veien fordi proteasomal inhibitor-MG132, men ikke lysosomal inhibitors- leupeptin og pepstatin A, gjenoppretter ABCG2 protein uttrykk i LMWH behandlet SP celler. Vi spekulerer i at LMWH binde til ABCG2 i SP cellemembraner og forårsake ubiquitinization og degradering, noe som reduserer chemoresistance av lunge SP-celler.
LMWH er en trygg antikoagulerende middel som brukes i koagulerende og ikke-koagulerende betingelser, som har vært brukes i kreftbehandling i mer enn et tiår [18]. Retrospektiv data tyder på at det kan bedre overlevelse hos noen kreftpasienter, men den eksakte mekanismen er fortsatt uklart [26]. Eksperimentelle modeller antyder LMWH er i stand til å hemme tumorvekst, invasjon, metastase, angiogenese, matrisedannelse og reversere multimedikamentresistens [27] – [31]. Denne studien viser at LMWH alene kan moderat redusere tumorvekst
in vivo
selv om det ikke kan indusere tumorceller apoptose direkte
in vitro
. Grunnen kan være at LMWH utøver sin svulst hemmende effekt gjennom interferens med tumorcelle tilslutning, invasjon, angiogenese, eller microenvironement [32], [33].
Så vidt vi vet, er denne studien den første rapporten som LMWH kan hindre chemoresistance av lunge SP celler ved å redusere ABCG2 protein uttrykk gjennom proteasome avhengig nedbrytning. Evnen til LMWH å bevisst SP celler til kjemoterapi ved å fremkalle ABCG2 nedbrytning gjennom proteasome veien kan gi en forklaring på den ukjente mekanismen som LMWH forbedrer kjemoterapi respons og overlevelse hos kreftpasienter [28], [34].
i konklusjonen, våre studier tyder på at LMWH reduserer kreft chemoresistance lunge via induserende ABCG2 protein degradering gjennom proteasome veien. Kombinasjonen av LMWH med cisplatin kunne målrette både kjemoresistent lunge SP celler og kjemosensitiv ikke-SP kreftceller, noe som gir en effektiv ny strategi for lungekreft behandling. Som LMWH kan brukes uavhengig av hypercoagulant forhold og bivirkningene er godt tolerert, den kliniske anvendelsen av LMWH i lungekreft har stort potensial. Åpenbart er videre kliniske studier av LMWH kombinert med kjemoterapi og strålebehandling i lungekreft som trengs, og det vil være verdt å undersøke om LMWH kan endre SP celler fra andre krefttyper.
Materialer og metoder
Cancer Cell Culture and Reagents
cisplatin-resistente human lunge adenokarsinom-cellelinje A549 /DDP ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og rutinemessig dyrket i RPMI medium supplementert med 10% humant AB serum og to mikromol cisplatin (Qilu Pharmaceutical Co, Ltd, Shandong, Kina). A549 /DDP-celler ble dyrket i komplett RPMI-medium uten cisplatin i 3 dager før anvendelse i forsøkene. Leupeptin pepstatin A, og MG132 ble kjøpt fra Sigma (St Louis, MO, USA).
Side Befolkning Sortering og analyse
A549 /DDP celler ble suspendert på 1 × 10
6 celler /ml i PBS inneholdende 4% FBS, inkubert ved 37 ° C i 60 min med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO, USA), enten alene eller i nærvær av 500 pmol verapamil (Sigma, St Louis, MO, USA). Etter inkubering ble 1 pg /ml propidiumjodid tilsatt, og deretter ble suspensjonen filtrert gjennom en 40-mikrometer celle sil (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Flow cytometery analyse og sortering ble utført ved hjelp av en FACS Vantage SE (BD Biovitenskap). Hoechst 33342 var spent med UV laser på 350 nm og fluorescens utslipp ble målt med 405 /BP30 (Hoechst blå) og 570 /BP20 (Hoechst rød) optiske filtre. Renheten av SP-celler og ikke-SP-celler ble testet på nytt ved hjelp av FACS. Etter FACS sortering, er SP og ikke-SP A549 /DDP-celler blitt holdt i komplett RPMI-medium, og ble brukt for videre eksperimenter i løpet av 2 timer.
Colony Forming Assay
kolonidannelse analysen var utført for å vurdere evnen av klonogene SP og ikke-SP-celler. Etter sortering ble 100 SP 100 eller ikke-SP A549 /DDP-celler sådd ut i RPMI 1640/10% på 6-brønners plater i triplikat. Mediene ble endret to ganger i uken, og etter 10 dager ble antall kolonier i hver brønn bestemt under et mikroskop og representative feltene ble fotografert. Prosent kolonidannende effektivitet (% CFE) ble beregnet som = (Antall kolonier oppnådd /Antall dyrkede celler) × 100 og loggtransformerte verdier ble beregnet [35], [36].
I vivo
tumorigenitet Experiment
Alle dyreforsøk ble gjennomført med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité av 304 PLA Hospital institutt for biologi. Tjuefire fem uker gamle ikke-obese diabetic /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) hannmus ble kjøpt fra den kinesiske Association for Laboratory Animal Science (CALAS, Beijing, Kina) og plassert under bestemte patogen-frie forhold, i en kontrollert temperatur og luftfuktighet med 12 timer lys /mørke sykluser. Mus ble injisert subkutant på den ene side med 5 x 10
5, 1 x 10
5, 5 x 10
4 eller 5 x 10
3 SP-celler eller 1 x 10
7, 5 × 10
6, 5 × 10
5 eller 5 × 10
4 ikke-SP celler i 100 mL suspensjoner og tumorvekst ble overvåket. 0,3 mg /0,20 ml LMWH ble injisert subkutant i LMWH behandlingsgruppe på dag 1. Musene ble ofret på dag 60 eller når tumorer nådde et maksimum volum på 1000 mm
3. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av (bredde
2 x lengde) /2. Fold forskjell i tumordannelse ble beregnet som minimum antall av ikke-SP-celler som trengs for å generere et tumor /minimum antall SP-celler som trengs for å generere en svulst.
MTT-analysen
A549 /DDP SP sortert cellene ble sådd på 96-brønners plater på 7,5 x 10
3 per brønn og behandlet med eller uten 5 IU /ml LMWH (lav-molekylvekt heparin kalsium; Bopuqin, TIANJING Chase Sun Pharmaceutical Co, Ltd, Tianjing, Kina) i tre eksemplarer. Tre brønner inneholdende tumorceller suspendert i fullstendig medium ble anvendt som kontroller for cellelevedyktighet og tre brønner inneholdende bare fullstendig medium ble anvendt som kontroller for ikke-spesifikk reduksjon fargestoff. Etter 48 timer ble MTT-fargeløsning tilsatt til hver brønn, og prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer ble formazanprodukt løst ved tilsetning av 100 ul DMSO til hver brønn og absorbans (A) ble avlest ved 570 nm ved anvendelse av en ELISA Reader (Anthos 2020, Salzbrug, Australia) Hemmingsraten (%) ble beregnet som 100% x (kontroll gruppe A verdier -experimental gruppe A verdi) /kontroll gruppe A verdier.
apoptose-analysen og SP Cell Marker Expression Analysis
A549 /DDP SP celler (1 x 10
6/96 godt plate) var ubehandlet (kontroll), eller behandlet med 5 IU /ml LMWH, LMWH pluss 2,2 mikrogram /ml cisplatin (DDP ), eller DDP alene i 36 timer og farget med Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit (BioVision, Mountain View, CA, USA) og analysert på en FACSCalibur flowcytometer (BD Biovitenskap). For SP celle markør analyse, ble A549 /DDP SP celler inkubert med LMWH i 36 timer, deretter inkubert i 30 min ved 4 ° C med monoklonale antistoffer mot p-gp (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), ABCG2 (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), CD24 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA), og oktober-4 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA) koblet til FITC eller PE (Biolegend, San Diego, CA, USA) ved konsentrasjonen som anbefales av produsenten og analysert ved flowcytometri. Apoptose analysen og SP celle markør uttrykk analyse ble gjentatt 3 ganger.
Kvantitativ Real-time RT-PCR
A549 /DDP SP celler av LMWH behandlet eller ubehandlet og tumorceller samlet fra LMWH behandlet eller ubehandlede mus ble suspendert på 1 x 10
6 celler /ml i 5 ml PBS som prøve hhv. Deretter, isolering av total-RNA ble utført ved anvendelse av TriPure Isolation reagens (Roche Diagnostics GmbH. Tyskland) eller RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
mRNA-nivåene ble analysert ved hjelp av kvantitativ sanntids RT- PCR ved anvendelse av en Bio-Rad iCycler system (Bio-Rad, Hercules, CA). De mRNA ble reverstranskribert inn i cDNA ved å bruke en iScript cDNA syntesesett (Bio-Rad, Hercules, CA). Primersekvensene som brukes i sann tid RT-PCR er: 5′-GGGTAATCCCCAGGCCTCTA-3 «(primer følelse av human ABCG2 genet), 5′-CCAGCTCTGTTCTGGATTCCA-3′ (antisense primer av human ABCG2 genet), 5»-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT- 3 «(primer følelse av human β-aktin-genet), og 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3» (antisense primer av human β-aktin-genet). Reaksjonen ble utført under følgende betingelser: en syklus ved 48 ° C i 45 minutter; 95 ° C i 2 minutter; 40 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 1 min, og 68 ° C i 2 min. Hver RT-PCR-amplifisering ble gjentatt i triplikat. PCR Effektiviteten ble undersøkt ved serielt å fortynne templat cDNA og smeltekurven dataene ble samlet for å kontrollere PCR spesifisitet. Hver cDNA-prøve ble triplicated og den tilsvarende ikke-RT mRNA prøve ble inkludert som en negativ kontroll. Den β-actin primer ble inkludert i hver plate for å unngå eksempel variasjoner. MRNA-nivået for hver prøve ble normalisert til den av β-aktin mRNA. Relativ mRNA nivået ble presentert som to
– [(Ct /ABCG2- Ct /β-aktin) LMWH – (Ct /ABCG2- Ct /β-aktin) kontroll]. Alle data vist var middelverdien ± SD av tre separate forsøk.
tumorvekst Xenotransplantat Study
Seks uker gamle innavlet mannlig Balb /C nakne mus ble hentet fra Institute of China Association for Laboratory Animal Science (CALAS). A549 /DDP lunge adenokarsinom-celler (5 x 10
6) ble inokulert subkutant i øvre venstre flanke på dag 1. Når diameteren tumorene var 5 mm, ble musene delt i kontroll, DDP, og lavmolekylært heparin med DDP grupper (n = 10 hver) og behandlet med ip injeksjon av 8 mg /kg DDP eller et like stort volum av saltoppløsning en gang i uken i 3 uker. LMWH (0,3 mg /0,20 ml) eller saltløsning ble gitt s.c. hver dag fra dag 8 til dag 30. Tumorvolumet ble bestemt tre ganger per uke som tidligere beskrevet og mus ble avlivet på dag 30.
SP Cell Marker Expression i Kreft explants
tumorprøver var skåret ut fra mus, skyllet, mekanisk hakket, og spaltet i 4 timer ved 37 ° C i en risteinkubator med 0,1 Wunsch enheter /ml kollagenase i (Roche Diagnostics) i DMEM. Digestionen ble inndelt ved hjelp av en 18,5-gauge nål, siktet gjennom en 100 um celle sil og forberedt for flowcytometri analyse av SP-cellemarkør ekspresjon som beskrevet tidligere.
Western Blot
SP-celler var innledningsvis behandlet med lavmolekylært eller kontroll i 10 timer, og deretter MG132 (10 uM), Pepstain A + Leupeptin (hver 100 ug /ml) eller kontroll ble tilsatt tilsvarende og inkubert i 6 timer. Deretter ble cellene høstet for western blot-analyse. Primært antistoff inkubasjon ble utført ved 4 ° C i 16 timer med et anti-mus-antistoff (ABCG2 Biolegend, San Diego, CA, USA) fortynnet ved 1:300 i 3% bovint serumalbumin, etterfulgt av inkubasjon med horseradishperoxidase-konjugert heste anti-mus sekundære antistoff, og utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Anti-β-actin antistoff ble brukt som lastekontroll (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).
Immunohistochemistry Farging av ABCG2 i svulstvev
parafininnstøpte vev var kuttet i 4 um lysbilder og bakt ved 60 ° C i 60 min. Seksjonene ble de-paraffinized med xylener og vannes ut. Deretter ble seksjonene senkes inn i EDTA-antigen gjenfinning buffer i en trykkoker i 10 minutter og deretter avkjølt ved romtemperatur i 20 minutter. Snittene ble behandlet med 3% hydrogenperoksyd i metanol for å stanse endogen peroksidase-aktivitet, etterfulgt av inkubasjon med normalt serum for å blokkere ikke-spesifikk binding. Deretter ble platene inkubert med Renset anti-human ABCG2 antistoff (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hongkong, Kina) med en fortynning på 1:20 ved 4 ° C over natten. Den andre antistoff var fra en SP reagenssett (Zhongshan Bioteknologi Company, Beijing, Kina). Etter vasking ble vevssnittene ble behandlet med biotinylert anti-muse-sekundært antistoff, etterfulgt av ytterligere inkubasjon med streptavidin-pepperrot peroksydase kompleks i 20 minutter. Farget med diaminobenzidine (DAB), ble seksjonene kontra med hematoksylin. Den kjente positive vev ble anvendt for positive kontroller. Det primære antistoff var utelatt for negative kontroller. En Olympus (Olympus, Tokyo, Japan) mikroskop ble ansatt for å visualisere farging av målrettede proteiner.
De fargede objektglass ble gjennomgått og scoret uavhengig av to observatører og resultatet ble bestemt ved å kombinere andelen positivt farget svulst celler og intensiteten av fargingen. Tumorcelle andel ble scoret som følger: 0 (ingen positive tumorceller); 1 (≤30% positive tumorceller); 2 (31-50% positive tumorceller); 3 (51-80% positive tumorceller) og 4 (mer enn 80% positive tumorceller). Fargeintensitet ble gradert i henhold til følgende kriterier: 0 (-, ingen farging); 1 (+, svak farging = lys gul); 2 (++, moderat farging = gul brun) og 3 (+++ sterk farging = brun). Farging indeks (SI) ble beregnet som produktet av fargingsintensitet og andelen av positive tumorceller. Ved hjelp av denne metoden for vurdering, evaluert vi ABCG2 uttrykk i tumorvev ved å bestemme SI, med score på 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 eller 12.
Statistical Analysis
data er presentert som gjennomsnitt ± SD
