Abstract
For terapeutiske formål, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har tradisjonelt vært ansett som en enkelt sykdom. Men siste bevis tyder på at de to store subtyper av NSCLC, adenokarsinom (AC) og plateepitelkarsinom (SqCC) reagerer forskjellig på både molekylære målrettet og nye generasjon chemotherapies. Derfor identifisere de molekylære forskjellene mellom disse tumortyper kan påvirke ny behandlingsstrategi. Vi utførte den første storskala analyse av 261 primær NSCLC tumorer (169 AC og 92 SqCC), integrere genom-wide DNA kopi nummer, metylering og genuttrykk profiler for å identifisere subtype-spesifikke molekylære endringer relevant for ny agent design og valg av terapi . Sammenligning av AC og SqCC genomiske og epigenomic landskaper avdekket 778 endrede gener med tilsvarende uttrykk endringer som er valgt i løpet av svulst utvikling i en undertype-spesifikk måte. Analyse av 200 flere NSCLCs bekreftet at disse genene er ansvarlige for å drive forskjellsutvikling og resulterende fenotyper av AC og SqCC. Viktigere, identifiserte vi sentrale onkogene trasé forstyrret i hver undertype som trolig tjene som grunnlag for deres differensial tumorbiologi og kliniske resultater. Nedregulering av
HNF4α
målgener var den vanligste vei spesifikke for vekselstrøm, mens SqCC viste avbrytelse av tallrike histon modifiserende enzymer, så vel som transkripsjonsfaktor
E2F1. I silico
screening av kandidat terapeutiske forbindelser ved hjelp av subtype-spesifikke pathway komponenter som er identifisert HDAC og PI3K hemmere som potensielle behandlinger tilpasset lunge SqCC. Sammen våre funn tyder på at AC og SqCC utvikle seg gjennom forskjellige patogenetiske veier som har betydelig innblanding i vår tilnærming til den kliniske behandlingen av NSCLC
Citation. Lockwood WW, Wilson IM, Coe BP, Chari R, Pikor LA , to KL, et al. (2012) Divergent Genomisk og Epigenomic Landskap av Lung Cancer Subtyper understreke utvalg av forskjellige Oncogene Pathways under Tumor Development. PLoS ONE 7 (5): e37775. doi: 10,1371 /journal.pone.0037775
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 8 november 2011; Godkjent: 27 april 2012; Publisert 21 mai, 2012 |
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det kanadiske Institutes for Health Research (CIHR) (MOP-86731, MOP-77903, MOP-110949 ), Canadian Cancer Society (CCS20485), NCI Early Detection Research Network, og Department of Defence (CDMRP W81XWH-10-1-0634). W.W.L., I.M.W., B.P.C., R.C., K.L.T. og L.A.P. ble støttet av stipend fra CIHR og NSERC (naturvitenskap og Engineering Research Council), og W.W.L. av en CIHR Jean-Francois Saint Denis Fellowship in Cancer Research, R.C. av en Banting postdoktorstipend, K.L.T. og L.A.P. av Vanier Canada Graduate stipender. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og til tross for nåværende behandlinger, forblir prognosen dårlig, med en fem års overlevelse av 18% [1], [2], [3]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC) er de to viktigste histologiske grupper. SCLC oppstår hovedsakelig i de sentrale luftveier mens NSCLC kan oppstå sentralt eller perifert. Den ulik patologi av de to typene gjenspeiles i deres kliniske behandlingen.
NSCLC er en heterogen sykdom med plateepitelkarsinom (SqCC) og adenokarsinom (AC) er den dominerende histologiske subtyper. Tradisjonelt har disse subtypene blitt behandlet som en enkelt sykdom enhet med behandlingsstrategier bestemmes utelukkende av sykdom scenen. Imidlertid har nyere bevis fra kliniske studier vist at histologiske subtyper av NSCLC reagerer forskjellig på både målrettede medikamenter og nyutviklede chemotherapies, muligens relatert til forskjeller i celle derivasjon og patogenetiske opprinnelse [3], [4], [5], [6] , [7], [8], [9]. Et av de mest slående eksempler er folat antimetabolitt Pemetreksed, som oppviser en overlegen effekt og er begrenset til bruk i pasienter med ikke-SqCC, antagelig på grunn av den høyere ekspresjon av tymidylatsyntase i SqCC tumorer [9]. Likeledes har en rekke studier knyttet en høyere svarprosent ved behandling av AC med EGFR tyrosinkinasehemmere gefitinib og Erlotinib, reflekterer høyere forekomst av
EGFR
mutasjoner i dette subtype [6], [10]. Disse uoverensstemmelsene i tumorbiologi og klinisk respons aktualiserer behovet for å finne ut de underliggende genetiske, epigenetiske og metabolske likheter samt ulikheter mellom de NSCLC subtyper for å definere mer hensiktsmessige veier for terapeutisk intervensjon.
Første genuttrykk profilering studiene var i stand til å skille AC og SqCC svulster i sine respektive histologiske grupperinger basert på multi-genet modeller; kan imidlertid kritiske hendelser i tumorgenesis bli maskert av reaktive forandringer ved undersøkelse ekspresjonsprofiler alene [11], [12], [13]. Omvendt, DNA kopiere nummer eller DNA metylering endringer tilsvarende med genuttrykk endringer blir ofte sett på som bevis for kausalitet. Slike DNA nivå endringer er kritiske deregulerings hendelser kjøre progresjon og andre kreft fenotyper [14], [15], [16]. Siden SqCC og AC antas å utvikle seg fra forskjellige celle linjer i forskjellige deler av lungen, kan omfanget av genetiske endringer som kreves for tumor initiering forekommer i en linje-begrenset måte. For eksempel forsterkning av avstamning overlevelse onkogener
SOX2 Hotell og
TITF1 /NKX2-1
har nylig blitt identifisert som viktige hendelser som er spesifikke for utvikling av lunge SqCC og henholdsvis AC, [17] , [18]. Men disse genene alene er ikke nok til å forklare den fenotypiske mangfoldet av subtyper, noe som tyder på at det store flertallet av gener ansvarlig for deres differensial utvikling er fortsatt ukjent. Selv om genetiske og epigenetiske forskjeller mellom SqCC og AC er blitt beskrevet, har lav genom dekning og /eller små utvalg vært begrensende [19], [20], [21], [22], [23], [24].
i denne studien utførte vi den første storskala analyse av primær NSCLC tumorer (261 totalt -169 AC og 92 SqCC), integrere DNA kopi nummer høy oppløsning, metylering og genuttrykk profiler for å identifisere kritisk subtype-spesifikke molekylære funksjoner. Karakterisering av de genomiske og epigenomic landskap av AC og SqCC avdekket en forbløffende antall forskjeller på DNA-nivå med påfølgende genuttrykk endringene som er valgt for under subtype-spesifikke lungetumorutvikling. Viktigere, identifiserte vi sentrale onkogene trasé forstyrret av disse endringene som sannsynligvis tjene som grunnlag for differensial atferd i tumorbiologi og kliniske resultater. Til slutt, gjennom prognostisk analyse og
i silico
screening av kandidat terapeutiske forbindelser ved hjelp av subtype-spesifikke pathway komponenter, viser vi hvordan disse nye funnene kan påvirke vår tilnærming til den kliniske behandlingen av NSCLC.
Resultater
Vurdering av global genomisk ustabilitet i AC og SqCC
Kreftsvulster av alle typer er kjent for å huse mange DNA-nivå endringer knyttet delvis til karsinogen eksponering [25]. Faktisk har tobakksrøyk vært knyttet til induksjon av ikke bare DNA-mutasjoner, men også bred kromosomal ustabilitet [26]. Basert på de forskjellige eksponering for tobakk karsinogener fra cellene i den sentrale (SqCC) og perifert (AC) i luftveiene, søkte vi først for å bestemme om den globale genomiske ustabilitet var mer utbredt i hver av de to undertyper. Vi generert og sammenlignet hele genomet kopinummer profiler for 261 NSCLC tumorer 169 AC og 92 SqCC – ved å legge oppløsning rekke komparativ genomisk hybridisering (CGH) (prøvesett # 1, Tabell S1) [27], [28], [29] , [30]. Etter hybridisering standard fjerning av systematiske skjevheter, og beregnings segmentering for å identifisere regioner i vinning og tap, antallet oppnådd, tapt, og nøytrale prober ble vurdert for hver tumor. Den relative genomiske ustabilitet observert i AC og SqCC grupper ble så sammenlignet (figur 1a). Gjennomsnittlig antall endrede sonder (per prøve) ble sammenlignet mellom grupper med Mann-Whitney U-test. Ingen signifikante forskjeller mellom de to undertyper ble funnet, i samsvar med tidligere arbeid som viste lignende DNA innhold på tvers av undergrupper [31]. Denne analysen viser at verken subtype har en forkjærlighet for gevinst eller tap av DNA. Derfor observerte forskjeller i endring frekvens ved et gitt locus kan tilbakeføres til undertypespesifikk av genene som er inkludert innenfor endrede områder og ikke til ulike grader av tilfeldig genomisk ustabilitet forbundet med tumorutvikling.
(a) Prosentandel av kloner av hver stat i begge subtyper. Box plott viser prosentandelen av kloner med status -1 (tap /sletting), 0 (nøytral), og en (gevinst /forsterkning) i hvert av de undertyper. Prosenter ble beregnet for hver prøve og for hver status. Disse plottene viser likheten i totale genom endring prosent mellom AC og SqCC svulster og foreslår at recurrently endret regioner i genomet er resultatet av valget i stedet for en høyere frekvens av gevinst eller tap av DNA i enten subtype. (B) endring frekvenser for 169 AC (rød) og SqCC (blå) svulster 92 vises over hele menneskets genom. Solid vertikale svarte linjene representerer kromosom grenser mens de stiplede svarte linjene representerer kromosom arm grenser. Hyppigheten av kopi-antall forsterknings er angitt i toppanelet. Legg merke til den høye frekvensen av 3q gevinst i SqCC undertype, i samsvar med tidligere rapporter. Andre regioner i kopitall forskjell er også klart, slik som de mer vanlige gevinst på kromosom 2p i AC. Det andre panel (i midten) viser frekvensen av kopitallet tap. Vanlige tumorsuppressorgenet loci som kromosom 3p er vanlig mellom AC og SqCC, men store forskjeller i regioner som kromosom 4. kvartal. Betydningen av kopiantall ulikhet (invers p-verdi korrigert for multiple sammenligninger) mellom AC og SqCC undergrupper er avbildet i den tredje (nederst) panel. Hele sorte linjene representerer regioner vurderes statistisk forskjellig (p≤0.01) mens grå linjer ikke er det.
Uensartede genomiske landskap preger lunge SqCC og AC
Selv om NSCLC subtyper viser lignende nivåer av genomiske ustabilitet, hvis spesifikke genetiske veier er involvert i deres differensial utvikling, forskjeller i de genomiske forandringer ble valgt i tumorgenese bør være til stede. For å finne ut om genetiske endringer som er unike for hver NSCLC subtype eksisterer, så vi for gjentatte ikke-tilfeldige områder av aberrasjon i hver gruppe. Prøvene ble gruppert etter subtype og prober ble samlet inn i regioner basert på lignende kopiantall status. Hyppigheten av endring over autosomer ble bestemt og sammenlignet mellom undergrupper ved hjelp av Fishers eksakte test og den resulterende
p
-verdier ble korrigert for multiple sammenligninger med en cut-off av ≤0.01 betraktet som signifikant. I tillegg kreves vi områder som skal endres i 20% av prøver fra en subtype gruppe og en forskjell mellom grupper av 10% skal betraktes som «av interesse». Figur 1b viser de resulterende genomiske landskap av AC og SqCC basert på frekvensen av gevinst og tap på tvers av genomet, og fremhever de tilsvarende delene av forskjellen mellom subtyper som ble identifisert.
Denne analysen avslørte 294 regioner av kopi antall misforhold mellom SqCC og AC, 205 av disse var SqCC spesifikke, mens 89 var AC spesifikke (tabell S2). Selv om noen regioner overlappes, tegnet av endring (dvs. få versus tap) var spesifikk for en enkelt gruppe. Siden endringen status mellom subtypene varierte sterkt, klassifisert vi disse som subtype-spesifikke eksemplar nummer endringer. Til sammen har disse endringene dekket ca 550 MBP av genomet, som varierer i størrelse fra store deler på kromosomarmer (64.8 MBP på 4Q) til diskrete topper bare kilobaser i størrelse (0,05 MBP på flere steder).
Interessant , kopiere antall profilering av 20 preinvasive lungekarsinom
in situ
lesjoner, antatt forløpere til lunge SqCC svulster, viste at de aller fleste (186/204, ~92%) av SqCC-spesifikke endringer er til stede på dette stadium av svulst utvikling, noe som tyder på at disse hendelsene kan starte tidlig i SqCC tumorigenesis (tabell S3). De øvrige endringer som er til stede i SqCC svulster og ikke funnet i carcinoma
in situ
lesjoner kan representere potensielle drivere av SqCC progresjon (tabell S3, med potensielle målgener av disse regionene som er identifisert i tabell S4, omtalt nedenfor ). Sammen utgjør disse funnene støtter vår hypotese om at subtypene utvikle seg gjennom ulike genetiske veier.
Gene forstyrrelser er valgt i en subtype bestemt måte under NSCLC utvikling
Oppdagelsen av DNA kopiantall forskjeller mellom NSCLC subtyper tyder på at gener innenfor disse områder kan være fortrinnsvis velges under tumorgenese og således er ansvarlig for differensial utvikling og patologiske egenskaper ved de subtyper. For å identifisere potensielle målgener av disse endringene, integrerte vi DNA kopiantall og genuttrykk nivåer [32]. Genuttrykk profiler ble generert for en undergruppe av svulster som ble analysert ved matrise CGH (20 SqCC og 29 AC svulster, Prøvesett # 2, Tabell S1). Vi antok at gener målrettet av subtype-spesifikke forandringer vil være forskjellig på DNA-nivå som samsvarer med forskjeller på genekspresjon nivå. Videre har vi også analysert normalt lungevev for å sikre at bare gener som uttrykkes differensielt i tumorvev (i forhold til normal) forble som kandidater, en karakteristikk i samsvar med en rolle i tumorutvikling.
Gener som befinner seg innenfor hver undertype-spesifikk kopiantall endring ble identifisert og uttrykket nivåer sammenlignet mellom SqCC og AC prøver å finne ut de som ble uttrykt forskjellig (p 0,001, etter gjen testing korreksjon). For SqCC, 4669 unike gener kartlagt til subtype-spesifikke eksemplar nummer endringer (~23 gener per region), og 797 (17%) av disse ble uttrykt forskjellig mellom undergrupper i den forventede retningen. I AC, ble 2050 unike gener som ligger i undertype-spesifikke eksemplar nummer endringer (~23 per region) og 171 (8%) ble uttrykt forskjellig mellom undergrupper i den forventede retningen.
Selv om noen gener overlappet, deres avbrudd mønstrene var spesifikke for den enkelte krefttype, tyder på motstridende roller (onkogene vs svulst undertrykkende) avhengig av mobilnettet sammenheng. Dermed disse genene ble også ansett for å være subtype-spesifikke mål. Når kombinert, de SqCC og AC subtype-spesifikke kopiantall regulert kandidater representert 968 unike gener og viste et klart skille i uttrykket nivåer mellom de to undertyper.
I tillegg til å demonstrere en sammenheng mellom uttrykk og kopiere nummer endring, en kandidat subtype-spesifikke genet ble også nødvendig for å bli deregulert i kreftvev i forhold til normalt vev [33]. Vi analyserte uttrykket nivåer av kandidater i et uavhengig panel av 53 SqCC og 58 AC lungesvulster og 67 prøver av ekspandert bronkial celler fra kreftfrie individer (Prøve Stiller # 3 og # 4, Tabell S1). Totalt 655 av 797 SqCC spesifikke og 143 av de 171 AC-spesifikke gener hadde tilsvarende sonder på denne array plattform. Disse genene ble sammenlignet mellom de respektive kreft subtype og de normale bronkiale celler for å bestemme de som var signifikant forskjellig uttrykt (p 0,001) i retning forutsagt av det tilsvarende kopitallet endring i hvilket de var plassert. Denne analyse viste at 447 (68%) av den SqCC-spesifikke og 71 (49%) av AC-spesifikke gener ble deregulert i cancervev (492 unike genet endringer, Tabell S4). Siden disse genene møtte alle tre kriterier for å definere kandidat subtype-spesifikke, kopi nummer endring regulert mål som beskrevet ovenfor, konkluderte vi at de kan representere de kritiske genet endringer som driver utviklingen av hver subtype (figur 2).
Forvandlet absolutte uttrykk data for 492 unike gener som oppviser avbrudd i ekspresjonsnivåene som et resultat av kopitall forskjeller er vist. I tillegg er disse genene er opp eller ned-reguleres i subtypen som de er forstyrret i forhold til normalt lungevev (se resultater). Ekspresjon på høyt nivå er indikert med rødt mens svart indikerer progressivt lavere nivåer av ekspresjon. AC prøvene er merket med en rød utheving på toppen av hver kolonne, mens SqCC prøvene er angitt med blå utheving. Hvert gen er sortert i henhold til sine kromosomale posisjon. Det er et klart skille i uttrykket av disse genene som indikerer deres spesifikke engasjement i undergrupper.
Ulike onkogene trasé er forbundet med utviklingen av AC og SqCC
Cellular trasé og prosesser spesielt forstyrret i enkelte undergrupper kan avsløre viktige onkogene mekanismer som driver differensial utvikling av AC og SqCC. Dermed etter å identifisere gener ansvarlig for forskjellene mellom subtypene, siden ønsket vi å undersøke sine biologiske funksjoner. Å oppdage subtype relaterte nettverk av biologisk beslektede gener vi har utført Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) av 71 AC og 447 SqCC spesifikke målgener (figur 3, tabell S5). SqCCs utstilt forstyrrelser i genet nettverk som fungerer i å regulere DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon, med flere roller i lymfevev struktur og utvikling (tabell S4). Gener som er involvert i den øverste SqCC nettverket ble forbundet med binding og modifisering av histon H4 protein, så vel som regulering av NFkB-komplekset (Figur 3b). I motsetning til de primære nettverk i AC vises funksjoner knyttet til celle-til-celle-signalisering, utvikling, og legemiddelmetabolisme (tabell S5). Hoved AC-spesifikke genet nettverk besto hovedsakelig av gener reguleres av transkripsjonsfaktoren HNF4α (figur 3a), mens AC nettverk 2 inneholdt en rekke gener som kontrolleres av TGFB og TP53. Differensial avbrudd av genet nettverk i AC og SqCC var videre tyde på ulike mekanismer for tumordannelse for subtypene.
Oppfinnsomhet Pathway Analysis ble brukt til å identifisere biologisk knyttet nettverk fra subtype spesifikke gener deregulerte av subtype-spesifikke kopiantall endringer (se Methods). Den øverste resulterende genet nettverk for hver subtype vises. a) AC nettverk # 1 av gener relatert til HNF4 signalering. b) SqCC nettverk # 1 som viser potensielle interaksjoner mellom flere histone regulere gener for både a) og b), heltrukne linjer betegne direkte interaksjon mens stiplede linjene representerer indirekte vekselvirkninger mellom genene. Nettverkskomponenter uthevet i rødt er oppregulert i tilsvarende subtype mens de uthevede grønt er nedregulert. De som ikke er fremhevet brukes av programvaren for å vise forholdet. Ytterligere informasjon om gener og deres interaksjoner kan bli funnet på www.ingenuity.com. eller i diskusjonen. I dette diagram molekyler er representert som sådan; korketrekkere representerer enzymer, y-formet molekylene er transmembrane reseptorer, fingerbøll formede molekyler er transportører, kinaser er trekantede, og sirkulære molekyler omfatte alle andre genprodukter.
Globale subtype variasjoner i DNA-metylering nivåer reflektere forskjeller i celler av opprinnelse
i motsetning til genomet, som er identisk for de fleste normale celler i kroppen, det epigenome varierer mellom vevstyper [34], [35]. Tilsvarende kreft genomer vise global hypometylering i varierende grad avhengig av vev opprinnelsesland [36]. DNA metylering profiler blir også påvirket av mutasjons profiler innenfor ulike krefttyper, som DNA hyper- og hypometylering endringer er også kjent for å være relatert til vev og genetisk bakgrunn [37] samt røykeatferd [38]. Gitt de forskjellige mutasjons-spektrene for de to NSCLC-subtyper og deres sannsynlig forskjellige celler av opprinnelse, undersøkte vi den totale DNA-metylering nivå av 30 AC og 13 SqCC prøver (prøvesett # 4, Tabell S1). For å aktivere sammenligninger av SqCC og AC svulster til egnede matchet normale celler, ble DNA metylering profiler også generert for 30 ikke-maligne lungeparenkym prøver (AC referanse) og 18 histologisk normale ekspandert bronkial epiteliale celleprøver (SqCC referanse) fra pasienter med NSCLC ( Prøvesett # 1, Tabell S1). Analyse av 27,578 CpG dinukleotider sonder i 13000 CpG øyer viser at DNA metylering i bronkial epitel og SqCC svulster var noe lavere enn i normal lunge eller AC tumorer (Figur 4A). Dette blir gjenspeilet og overdrevet i CpG dinukleotider utsiden av CpG øyer, noe som tyder på at cellene i den sentrale luftveier er globalt hypomethylated i forhold til cellene i de perifere luftveier, enten kreft eller ikke (figur 4b). I dette tilfellet de to gruppene er signifikant forskjellig sammenlignet ved hjelp av en Mann-Whitney U-test (
p
0,0001).
Sammenligning av gjennomsnittlig DNA metylering nivåer mellom AC svulst, AC normal ( histologisk normal lungeparenkym), SqCC svulst, og bronkial epitel. a) CpG island probe gjennomsnitt. Gjennomsnittet av hver av profilene ved sonder som befinner seg innenfor CpG-øyer er plottet som en komponent i boksplottet. I dette panelet, SqCC og bronkial epitel prøvene ser ut til å ha litt lavere DNA metylering nivåer enn AC svulsten og AC normale grupper. b) Ikke-CpG island probe gjennomsnitt. Gjennomsnittet av hver av profilene på probene ikke befinner seg innenfor CpG-øyer er plottet som en komponent i boksplottet. I denne figur β-verdi er nivået av metylering, som definert av det metylerte signal /totalsignal for hver sonde. I dette panelet, SqCC og bronkial epitel er betydelig lavere i metylering nivå sammenlignet med AC svulst eller AC normale grupper, noe som indikerer at utsiden av CpG øyer, der mesteparten av genomisk metylering oppstår, de sentrale luftveisprøver er mer hypomethylated. c) Gjennomsnittlig differensial metylering nivåer ved CpG øyer. Den gjennomsnittlige differensial er plottet for de 30 AC prøver og de 13 SqCC prøvene. De to gruppene er svært like i sine differensialprofil innenfor CpG øy prober. d) Gjennomsnittlig differensial metylering nivåer ved CpG områder som ikke ligger innenfor CpG øyer. I denne tomten gjennomsnittlig differensial metylering nivå er plottet for sonder som ikke ligger innenfor CpG øyer. Igjen, de to gruppene er ikke signifikant forskjellig fra en Mann-Whitney U-test.
For å finne ut om disse trendene var tydelig i tumorspesifikke epigenetiske forandringer, (dvs. de som eksisterer innenfor svulsten subtype når sammenlignet med en passende normal celle), sammenlignet vi differensial metylering profiler av AC og SqCC tumorer. Disse profiler ble generert ved å subtrahere den gjennomsnittlige normale DNA-metylering profil for de referanser fra hver av de 30 AC og 13 SqCC tumorer, respektivt. Ligner på global vurdering av kopinummer endringer (gevinst og tap), var det ingen signifikante forskjeller mellom AC differensial profiler og SqCC differensial profiler (figur 4c) i CpG island prober eller ikke-CpG island prober (figur 4d). Basert på dette, vi igjen begrunnet at noen observerte forskjellene i hypermethylation eller hypometylering frekvenser mellom subtypene er sannsynlig å være forårsaket av subtype-spesifikke utvalg av disse endringene.
Ulike epigenetiske forandringer er involvert i utviklingen av AC og SqCC subtyper
Selv ble det ikke observert forskjeller i globale metylering endringer mellom subtyper, kan de to undertyper har differensial endring frekvenser på enkelte loci. For å avgjøre om AC og SqCC svulster har locus spesifikke forskjeller i DNA metylering, undersøkte vi frekvensene av metylering endring på gene-forbundet loci i begge undergrupper. Tumor DNA metylering nivåer ble sammenlignet med gjennomsnittet av tilgjengelige normale henvisning vev profiler. Hyppigheten av sonde hypermethylation og hypometylering (tumor-normal | ≥0.15) i AC og SqCC prøvene ble sammenlignet med Fishers eksakte test. Etter korreksjon for multiple sammenligninger, ble 2708 sonder som tilsvarer 2384 gener funnet å være forskjellig metylert (p≤0.05). Den SqCC gruppen inneholdt vesentlig mer recurrently hyper- og hypomethylated loci enn AC gruppen, i likhet med den forskjellen i antall subtype-spesifikke kopitall-regulert gener observert i analysen av genomiske forandringer. Faktisk ble bare 8% av 2708 betydelige sonder oftere endret på AC, resten blir mer vanlig hyper- eller hypomethylated i SqCC.
For å avgrense listen over differensielt denaturert gener til dem som genekspresjon reflekterer nivåene forventet basert på deres epigenetisk forandring, vurderte vi 2384 gener med differensial metylering for differensiell ekspresjon mellom subtyper, så vel som differensial ekspresjon fra normale vev, ved hjelp av en korrigert p-verdi terskelen
p
0,05. 32 AC kandidat gener og 297 SqCC gener møtte disse strenge kriteriene, og ble videre analysert som subtype-spesifikke epigenetiske regulerte gener (tabell S6).
epigenetiske regulerte gener komplement genetisk regulert gener
For å avgjøre om de 32 AC-spesifikke og 297 SqCC-spesifikke epigenetiske regulerte gener båret ut funksjoner som ligner på de undertypespesifikke gener påvist ved DNA-kopitallet analyse som er beskrevet ovenfor, ble reaksjonsveien avbrudd analyse utført. Dette viste at den mest signifikante epigenetiske regulerte genet nettverk i AC er involvert i cellesyklus, celledød, og cellulær utvikling (tabell S7). Dette er delvis i motsetning til toppen vekselstrømsnettet over kopitall regulerte gener, som på samme måte har funksjoner knyttet til vev utvikling, men også ha cellesignalisering og hematologisk system funksjon til felles (tabell S4). Den totale grad av likhet mellom AC-spesifikke gener som er genetisk eller epigenetiske regulerte er ganske liten, sannsynligvis på grunn av lavt antall AC-spesifikke gener er identifisert (mulige årsaker til dette er omtalt nedenfor). I motsetning til dette SqCC genet nettverkene i begge analysene er svært like. For eksempel er DNA-replikasjon, rekombinasjon og reparasjon svært omtalt funksjoner av gener som er identifisert av begge DNA-kopitall og DNA-metylering analyser av SqCC (tabellene S5 og henholdsvis S7,). I tillegg gener som er involvert i immunologiske sykdommer og lymfoid vev struktur og utvikling var fremtredende. Av spesiell interesse var anriking av abnorme metylerte gener i småcellet lungekreft signalveien (består av gener som er kjent for å deregulert i småcellet lungekreft som kommentert av oppfinnsomhet) (figur 5a). Dette var den mest betydelig anriket kanoniske veien i begge undertype som ble berørt av DNA metylering endringer og det er av interesse fordi begge disse lungekreft (SCLC og SqCC) oppstår i de sentrale luftveier med tilsvarende eksponering for sigarettrøyk kreftfremkallende.
er E2F1
blant hypomethylated og overuttrykt gener er representert i denne veien, og er kjent for å være overuttrykt i SCLC og å drive uttrykk for
EZH2, etter som også er overuttrykt i SCLC [39], [40]. For å utforske denne veien videre, undersøkte vi om
EZH2
ble mer høyt uttrykt i SqCC enn AC svulster (som en konsekvens av differensial
E2F1
uttrykk). Som forventet fant vi at
EZH2
ble uttrykt på et vesentlig høyere nivå i SqCC svulster enn AC svulster, viser den biologiske konsekvensen av
E2F1
avbrudd (figur 5b). Differensial uttrykk for
EZH2
i de to undertyper er betydelig, gitt de mange forskjellene i avvikende DNA metylering observert mellom undergrupper; dette kan reflektere nøkkelrolle EZH2 i polycomb gruppen, et proteinkompleks som er involvert i DNA metylering [41].
a) SCLC signale komponenter endret av DNA metylering i SqCC. I denne skjematisk av SCLC signalveien, blir gener som er hypomethylated og overuttrykt er vist i rødt, og de som er hypermethylated og underexpressed er vist i grønt. Komponenter på alle nivåer i veien er berørt, inkludert transkripsjonsfaktor
E2F1
, som driver uttrykk for onkogene polycomb gruppemedlemmet
EZH2
. b)
EZH2
uttrykk i 58 AC svulster og 53 SqCC svulster.
EZH2
ekspresjon ble undersøkt i en ytre datasettet, og det ble funnet å være høyere, som forutsagt, i SqCC tumorer i forhold til vekselstrøms tumorer ved anvendelse av en Mann-Whitney U-test (p 0,0001). c)
FHIT
differensial metylering nivåer i SqCC og AC svulster.
FHIT
viste seg å bli deregulert av både sletting og hypermethylation på en måte som var spesifikke for SqCC svulster. Vis her er de differensial DNA metylering nivåer for 30 AC svulster og 13 SqCC svulster. De SqCC svulster er hypermethylated til en mye høyere grad enn AC svulster, i samsvar med tidligere publiserte funn.
DNA kopi nummer og DNA metylering data er komplementære fra et gen-bestemt perspektiv også. Dette er markert med sju gener (
ATP2C1
,
PCYT1A
,
ZWILCH
,
CENTB2
,
BAG4
,
PARP11 Hotell og
CSDA
, tabell S8) som er forstyrret av gen-dose i en subtype og DNA metylering i den andre.
PARP11
er et slikt eksempel på differensial aktivering /inaktivering av DNA-kopi nummer og DNA metylering, som er nærmere omtalt nedenfor.
felles genetisk og epigenetisk forstyrrelse av subtype-spesifikke gener
for å bestemme om begge DNA-kopitall og DNA-metylering avvik samtidig forstyrret noen gener, vi kombinerte undertypespesifikke gener listene utledet ved hjelp av de to analytiske fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor (tabell S9).
