Abstract
Innledning
Metastase er antatt å være en klonal arrangement hvorved en enkelt celle initierer utviklingen av en ny tumor ved et fjernt område. Men den grad som primære og metastatiske tumorer skiller seg på et molekylært nivå er fortsatt uklar. For å evaluere disse begrepene videre, brukte vi neste generasjons sekvensering (NGS) for å vurdere den molekylære sammensetningen av sammenkoblede primære og metastatisk kolorektal kreft vevsprøver.
Metoder
468 kolorektale tumorprøver fra en stor personlig medisin initiativ ble vurdert av målrettet gensekvensering av 1,321 enkeltgener. Atten pasienter produsert genomiske profiler for 17 paret primær: metastatisk (og to metastatisk: metastatiske). Prøver
Resultater
Et gjennomsnitt på 33,3 mutasjoner /tumor var konkordant (delt) mellom matchet prøvene, inkludert felles kjente gener (APC, KRAS, TP53). Et gjennomsnitt på 2,3 mutasjoner /tumor var disharmonisk (udelt) blant sammenkoblede områder. KRAS mutasjonsstatus var alltid konkordant. Den samlede overensstemmelse for mutasjoner var 93,5%; Men nesten alle (18/19 (94,7%)) sammenkoblede svulster viste minst én mutasjons disharmoni. Mutasjoner ble sett i:
TTN
, den største genet (5 uharmoniske par),
ADAMTS20
,
APC
,
MACF1
,
RASA1
,
TP53
, og
WNT2 plakater (2 uharmoniske par),
SMAD2
,
SMAD3
,
SMAD4
,
FBXW7
, og 66 andre (en disharmonisk par).
Konklusjoner
Mens primære og metastatiske svulster vises litt variasjon samlet, co-evolusjon produsert inkrementelle mutasjoner i begge. Disse resultater antyder at mens biopsi av primærtumor alene er sannsynligvis tilstrekkelig i kjemoterapi-naive pasienter, kan ytterligere biopsier av primær eller metastatisk sykdom være nødvendig å nøyaktig tilpasse behandlingen etter kjemoterapi motstand eller ufølsomhet for å tilstrekkelig høyde for tumorutvikling.
Citation: Kim R, Schell MJ, Teer JK, Greenawalt DM, Yang M, Yeatman TJ (2015) Co-Evolution of soma~~POS=TRUNC Variasjon i grunnskolen og metastatisk kolorektalcancer Kan Utvid Biopsi Indikasjoner i Molecular Era. PLoS ONE 10 (5): e0126670. doi: 10,1371 /journal.pone.0126670
Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 27 oktober 2014; Godkjent: 06.04.2015; Publisert: 14. mai 2015
Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) nih.gov U01CA157960 (TJY). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Merck 80% tumor var til stede i prøven som gjennomgikk sekvensanalyse (noe som åpner for sensitiv mutasjonsdeteksjon). Normalt vev, nekrotisk vev og overdreven stromal vev ble dissekert vekk fra prøven under frosne delen kontroll. DNA ble deretter ekstrahert fra 468 CRC eksemplarer, fulgt av målrettet sekvensering ved hjelp av en spesialdesignet Agilent Jada Velg Capture, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA. 1,321 kreft-assosiert genene ble valgt av et partssammensatt utvalg (Merck Co., Inc Moffitt kreftsenter) for hybrid fangst og sekvensering. Capture prober for 1,321 gener ble basert på Agilent 50MB Sure Velg fangst (se tabell A i S1 fil for listen av gener).
Sequencing og analyse
Variant data.
Et gjennomsnitt på 1,4 GB av målrettet gensekvensering data (1,321 gener som dekker 3,8 MB) ble generert for hver tumorprøve ved hjelp av parvise end 90bp sekvensering-by-syntese teknologi (GAIIx, Illumina, Inc., San Diego, CA) av BGI (Shenzhen, Kina). Den Burrows-Wheeler Aligner (BWA [12]) ble brukt til å justere sekvenser til human henvisning hg19. Den Genome Analysis Toolkit (GATK [13]) ble brukt for innsetting /sletting omstilling, kvalitetspoeng kalibrering, og variant identifikasjon. ANNOVAR [14] ble brukt til å kommentere mutasjoner. Selv matchet normale prøver ikke var tilgjengelige for de 19 tumormetastatisk individer, vi beriket for somatiske mutasjoner ved å fjerne varianter med en global mindre allelfrekvens 1% i 1000 genomer prosjektet datasett. I tillegg, ble data fra 523 normalt vev eller blodprøver fra den TCGA bryst datasettet ned fra dbGAP og analysert ved hjelp av samme BWA /GATK rørledning som våre sekvenserte prøver. Totalt 21,179 ikke-stumme varianter som ble identifisert i de normale vev ble også anvendt for filtrering av forutsagte kimlinje-varianter, ytterligere å anrike for somatiske mutasjoner. Filtrering med uovertruffen normal datasettet også redusert antall analytiske gjenstander (mutasjoner som observeres ofte i en normal datasett analysert med de samme metoder, men ikke i 1000 genomer, vil sannsynligvis være artefakter). Mutasjons tellinger er basert på filtrerte data. Mutasjoner i matchet prøvene ble direkte sammenlignet for å identifisere forskjeller. Potensielle forskjeller ble manuelt gjennomgått med samtools Tview og mpileup [15]. Mutasjoner som syntes å være justerings gjenstander basert på manuell vurdering vurderer tråd ubalanse, mange mutasjoner i samme lese, tilstedeværelse av klipping nær mutasjonen posisjon, ikke-tilfeldig stilling av mutasjon i den leser, lav kartlegging kvalitet, og tegn på lese i normal prøver (og ikke 1000 genomer) ble ekskludert fra analysen. Dette trinnet diskvalifisert 12,3% av potensielle differensial mutasjoner, og 26% av disse var i
Muc4
, et gen mistenkt for å huse gjenstand varianter [16, 17]. Prøvene ble betraktet som forskjellig ved en posisjon dersom mutasjonen var til stede i en prøve (vanligvis 10%, vår empirisk bestemt allel frekvens som er gitt ~ 140x gjennomsnittlig dybde av dekning fra denne og andre prosjekter fra den samme moderdatasettet av ~ 4000 samples) og fraværende eller sjelden sett i den andre. For å unngå falske forskjeller som følge av differensial mutasjon bestemmelser, justeringer på mutasjon stillinger ble manuelt anmeldt: Denne manuell gjennomgang også mulig for oss å identifisere falske-forskjeller; det vil si når allelfrekvenser på en stilling var lik, eller en mutasjon var pålitelig observert i «referanse» sample (til tross for en differensialbestemmelse), omklassifisert vi disse for å være samstemmige mutasjoner.
Resultater
Kliniske data
fra 2008 til 2010, samlet vi 488 CRC prøver knyttet til 468 sekvensert pasienter for å evaluere genomisk profilen til CRC fra primær eller metastatisk vev. Ut av disse prøvene, 18 pasienter hadde tilgjengelige genomiske profiler fra mer enn én vevsprøve (dvs. paret primær: metastatiske prøver). Femten pasienter hadde både primære og metastatisk /lokale regionale lymfeknuteprøver, to hadde egne metastatiske prøver, og en pasient hadde to primærvalg og to eksemplarer metastatisk vev tilgjengelig. Derfor totalt 19 parvise prøver var tilgjengelig. Kliniske kjennetegn er beskrevet i Tabell 1. Paret prøver først presentert med synkrone lesjoner i 16 tilfeller (84%), mens tre par involvert metachronous metastatisk sykdom. Distant metastaser inkludert leveren (N = 8), lymfeknuter (N = 7), lunge (N = 3), og eggstokk (N = 1).
mutasjons profilering og MSI testing
median 16209684 lesninger ble generert for hver prøve, med 15.785.209 samkjøre til referanse humane genom, og 5.390.906 innrettings innenfor 25 bp fra den målregioner. Median dekning på målrettede baser var: 94,3% = 10x; 90,7% = 20x, og 79,6% = 50x. Medianen av gjennomsnittlig dybde på dekning over målrettede baser var 146.7x (se tabell B i S1 fil for detaljer om sample_seq_metrics).
I profilere mutasjonsstatus av pasientene, vi spesielt fokusert på kjente gener slike som
APC
,
KRAS
,
TP53
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
. MSI status ble også evaluert så vel ved genetisk analyse av mikrosatellitter i alle tilfeller. En
APC
mutasjonen ble sett i 16 av 18 pasienter og TP53 mutasjoner ble sett hos 12 pasienter.
KRAS
mutasjoner ble funnet i 9 pasienter og ligger i kodon 12, 13 eller 61.
PIK3CA
mutasjoner ble oppdaget i tre pasienter. Spesielt, ingen av pasientene hadde en
BRAF (V600E)
mutasjon. En pasient var MSI-H, 4 pasienter var MSI-L, men bare i ett av vev, mens de resterende 13 pasientene var MSS.
Concordance av mutasjoner i matchet par av primære karsinomer og avledede metastaser
Vi undersøkte mutasjons samstemmighet av en kohort av 19 par av tumorer (figur 2, Tabell 2, nøyaktige posisjoner, dybder, og allelfrekvenser er beskrevet i tabell C i S1 File). Fra de 38 svulster, ble 1,352 mulige somatiske endringer identifisert blant blant 1,321 gener. Av disse 1.264 endringer skjedde i begge prøvene (gjennomsnittlig = 33,3 /prøve), skjedde 35 bare blant de 17 primærprøver (gjennomsnitt = 2,1), og 53 skjedde bare i de 21 metastatisk prøvene (gjennomsnitt = 2,5). Spesielt tellingene var bemerkelsesverdig lik for primær: lymfeknute og primær: fjernmetastaser par (gjennomsnittlig delte endringer = 36,7 og 31,2). Således var den totale overensstemmelse for de mutasjoner var 93,5%. Men nesten alle (18/19 (94,7%)) sammenkoblede svulster viste minst én mutasjons disharmoni.
De aller fleste mutasjoner er felles. Par A til F representerer regionale lymfeknutemetastaser og par G gjennom R representerer fjernmetastaser.
mutasjons forskjeller observert i prøve parene er oppført i tabell 3.
TP53 (R196X)
endring ble sett i 10 av de andre 450 pasienter som ikke har parede prøver; vi referere til slike mutasjoner som
tilbakevendende
. Andre differensial mutasjoner som var gjennomgående i våre større kohort var
APC (R223X)
hos 7 pasienter,
APC (E1268X)
i 3 pasienter,
TP53 (E294fs) plakater ( merk: andre endringer var E294X) hos 2 pasienter, og
JAK1 (802_803del) Hotell og
HSP90AB1 (549_550del)
skjer i en annen pasient
Syv gener. hadde to eller flere uharmoniske endringer (Tabell 4). De er presentert i synkende rekkefølge av deres uharmoniske mutasjon priser, som er antall mutasjoner per nucleotide basen per vevsprøve. Seks av dem har nøyaktig to uharmoniske forandringer, slik at mutasjonsfrekvensen i mindre gener er høyere. Fem udelte forandringer ble sett i
TTN
; imidlertid gitt sin størrelse, udelt mutasjonsraten var lavest blant de sju gener. Spesiell oppmerksomhet bør gis til
TP53 Hotell og
APC
mutasjoner, som de er kjent for å være sjåfør mutasjoner i tykktarmskreft. I tillegg til
APC
genet, som forekommer i over to tredjedeler av tykktarmskreft,
WNT2 Hotell og
MACF1
også påvirke Wnt veien, mens
RASA1
er i RAS pathway. Gener av spesiell interesse med et enkelt udelt mutasjon har
SMAD2
,
SMAD3
,
SMAD4
, og
FBXW7
; i tillegg, tre PTP (
PTPN13
,
PTPRC
,
PTPRD
) var disharmonisk.
En rekke gener identifisert som disharmonisk ha blitt funnet å være mutert i TCGA CRC datasettet på frekvenser 10% (f.eks
SMAD4
,
ZNF831
,
ZNF217
,
HSP90AB1
,
TP53
,
SYNE1
,
SMAD2
,
TTN
,
MACF1
,
PREX1
,
FBXW7
,
CSMD3
).
Diskusjoner
metastaser er tenkt å være i stor grad en klonal prosess der den opprinnelige cellen for metastatisk lesjon er avledet fra den primære lesjon, sterkt tyder de to skal være nært knyttet [3], men i tvisten er nettopp hvordan ulike primære og metastatiske lesjoner står i forhold til sine mutasjoner, uttrykte gener og proteiner. Også kjent er den relative heterogenitet av den primære tumor. For eksempel, er det tumor i stor grad består av celler med høy metastatisk potensial og bare noen få flukt på grunn av en stokastisk begivenhet som fører til metastase, eller er det slik at bare noen få celler i den primære svulsten har fått metastatisk potensial og oppholde seg i noen ukjent geografisk plassering i primær lesjon? Den tidligere konseptet ville støtte tanken om at biopsi av primær lesjon er tilstrekkelig til å forutsi metastatisk potensial samt potensielle narkotika mål, mens sistnevnte biologi ville resultere i biopsi utvalgsfeil som fører til upassende kliniske konklusjoner. Den tidligere konseptet kan også føre til sporadiske mønster av diffuse og dødelig hagle metastase vs vanlig oligometastatic mønsteret sett. En annen helt annen mulighet er at ingen nye mutasjons hendelser er nødvendig for metastaser, men snarere det er en fysiologisk hendelse utløst av stromale ledetråder. Denne teorien er nedfelt i begrepet epitel til mesenchymale overgang hvor en plastforbigående mesenchymale tilstand er nødvendig for en svulst celle til å invadere og reise til fjerne metastaser der en reversering av prosessen (MET) resulterer i en re-kapitulasjon av primær tumorbiologi. Det er
in vivo Hotell og
in vitro
modeller av metastase viser variabel genuttrykk mellom primære lesjoner og deres beslektede metastaselesjoner uten vesentlige genomisk endringer som støtter denne teorien. For eksempel har klassiske studier vist høy metastatisk potensial kan skaffes via serie «fenotypiske» utvalg eller sortering av celler fra en opprinnelig dårlig metastatisk klone. Hvis dette er tilfelle, kan genetikk av den primære og metastatisk tumor være nesten identisk, tillater biopsi av enten lesjon.
NGS studier har nylig blitt gjennomført for å belyse noen av disse spørsmålene. Nylige studier ved hjelp av NGS fra andre kreftformer slik som bryst- og nyrecellekarsinom har støtter hypotesen om at det er betydelige genetiske forskjeller mellom de primære lesjoner sammenlignet med metastaser som kan tillate en evolusjonær sporing av utvikling [18, 19]. Interessant, en fersk studie i tykktarmskreft viste at bemerkelsesverdig bare halvparten av metastatisk CRC lesjoner testet hadde samme klonal opprinnelse med sin primære svulsten mens resten av tilfellene var genetisk distinkt [6]. Slike studier kan tyde på at enhver metastatisk lesjon må vevsprøve for å fullt ut forstå kompleksiteten av sykdommen. Andre studier, derimot, er noe som tyder på at metastaser kan være mer som sine primære lesjoner enn ikke [20, 21]. Til støtte for denne oppfatningen, er det en fersk kolorektal studie som viser et høyt samsvar med allment muterte gener som
KRAS
,
NRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
, og
TP53
mellom primære og metastaser [22]. Dette er også svært lik den nylig publisert studie i lungekreft hvor 15 paret ikke-småcellet lungekreft ble undersøkt [23].
For å løse disse viktige kontroversielle saker, undersøkte vi et nytt sett med sammenkoblede primær og metastatisk CRC lesjoner ved hjelp av en målrettet genet analyse av et robust sett av 1,321 kreft forbundet gener med en ~ 100X sekvensedyptgående dekning. Våre data foreslo en svært høy samstemmighet over oppdagede mutasjons hendelser mellom primære og metastatiske parene, enten avledet fra lokoregionalt lymfeknuter eller fjerne metastaser. Våre data synes å motsi en fersk CRC studie med hele exome sekvensering viser store forskjeller mellom lesjoner som kan forklares av uavhengige primære hendelser (figur 1B), eller kan også være prøvetaking feil eller støy sekundært til lav dekning hele exome sekvense hvor lavfrekvente hendelser registreres [6]. Våre data i tykktarmskreft viste at flertallet av identifiserte mutasjoner ble delt mellom en primær tumor og dens beslektede paret metastatisk lesjon, inkludert
KRAS
,
APC
, og
PIK3CA
som vanligvis testet mutasjoner i våre pasienter.
tross for den høye samstemmighet vi observerte samlet, nesten alt (18/19 (95%)) sammenkoblede tumorer viste minst en mutasjons uoverensstemmelse. Bekymringen for klinikeren blir da om at disharmoni er klinisk signifikant og verdig en ny biopsi. Er det ansvarlig for metastatisk atferd? Er det en ny terapi mål, eller en mulig ny modus for motstand mot terapi? Eller gjør det bare representere utilstrekkelig sampling av en svulst som er iboende heterogene? Våre syv formere-uharmoniske mutasjoner inkludert to tilfeller hver av
APC Hotell og
TP53
, sannsynlige potensielle drivere av tumorprogresjon og metastatisk potensial. I tillegg tre Wnt veien (
APC
,
MACF1
,
WNT2
) og en Ras pathway (
RASA1
) gener er blant de sju. Disse funnene tyder også dødelige metastatiske celler kan oppstå som følge av ytterligere nye mutasjons varianter. Identifisering av egenskapene til den primære kreft som kan gi opphav til metastatiske dødelige cellekloner er av stor interesse. I vår studie,
TTN Hotell og
TP53
mutasjoner ble funnet i både det primære og metastatisk området, men hver med nye endringer som støtter teorien om gevinsten av funksjon dødelig metastatisk celle klone.
TP53
er en mutasjon som har blitt studert mye i tykktarm kreft [24]. Det har blitt rapportert at en økt forekomst av
TP53
mutasjoner er assosiert med sekundære lesjoner av kolorektal tumorer, noe som tyder på at mutasjoner i dette genet kan spille en viktig rolle i etableringen av kolorektale levermetastaser [25]. For eksempel, p53, proteinproduktet av
TP53
, har blitt rapportert å hemme Warburg effekt og fremme mitokondrie oksidativ metabolisme, en anti-metastase mekanisme, og derfor inaktivering av denne tumor suppressor funksjonen bidrar til prosessen med metastaser [26]. I vår studie, 13/19 (68%) parene hadde
TP53
mutasjoner, en høy hastighet som er lik andre studier [27]. Interessant, i vår studie, en pasient hadde en disharmonisk
TP53
mutasjon i metastatisk stedet, mens en annen hadde en i primærtumor. De uoverensstemmende mutasjoner fra de parede prøver er informativ med hensyn til utviklingen av tumoren. Disse funnene tyder på at
TP53
mutasjoner er ofte en sen kreftfremkallende hendelse, i samsvar med en evolusjonær modell fastsatt av Vogel et al [28].
Andre interessante mutasjoner funnet i metastaser var medlemmer av protein tyrosin fosfatase (PTP) familien. Det var 3 nye mutasjoner sett i metastatiske lesjoner. Disse PTP har blitt beskrevet som enten tumor suppressors eller som kandidat teinene [29]. Endringer i disse genene kan føre til endringer i likevekt av kinase-fosfatase aktivitet som kan ha skadelige effekter som til slutt kan føre til kreft progresjon.
Vår studie spesielt identifisert gevinst av nye mutasjoner i både det primære i forhold til sin beslektet metastatisk paret lesjon samt nye mutasjoner i metastatiske lesjoner i forhold til primærvalg. Denne observasjon kan forklares ved samtidig utvikling av både primære og metastatiske lesjoner over tid (figur 1C). Det er også mulig at disse uharmoniske mutasjoner representerer forskjellige populasjoner av en heterogen primærtumor.
Det er flere begrensninger i vårt studium. Vår lille størrelse kohorten inkluderte en heterogen befolkning, med både synkrone og metachronous svulster. Disse grupper kan være iboende forskjellige genomisk. For eksempel kan de nye mutasjoner sett i metastaser være et resultat av den metastatiske prosess eller på grunn av seleksjon av resistente kloner som induseres av tidligere systemisk behandling som neoadjuvant behandling før leveren reseksjon. Dessverre har vi ikke kliniske kjemoterapi data for de pasientene som utviklet metachronous sykdom. Derfor er det uklart hvilken effekt om noen, ville kjemoterapi eller målrettet terapi har på fremveksten av nye mutasjoner i metastaser. Også intratumoral heterogenitet, mens sannsynligvis ikke så høy i CRC lesjoner som i geografisk adskilte nyrecelle noduler som stammer fra det samme primære svulsten [28] kan være et problemfaktor som kan forklare noen av genetiske avvik i tillegg. Vår studie benyttet kirurgisk resected prøver dermed tillater oss å fange opp en stor del av hver svulst og effektivt vurdere sin heterogenitet ved å observere lavfrekvente, sub-klonale varianter.
Konklusjoner
Vår studie viste en høy graden av overensstemmelse for potensielle somatiske forandringer, noe som tyder på at genomisk profil primære område er meget lik den for den metastatisk området for de fleste av forhørt kreftgener. Således kan biopsi av primærtumor være tilstrekkelig i chemo-naive pasienter. Men vi tror også det er tilfeller der nye biopsier er sannsynlig for å nøyaktig vurdere mutasjons landskapet av en svulst og design egnet behandling, for eksempel i CRC pasienter som progresjon etter viss terapi (dvs. anti EGFR terapi). I denne situasjon er det mulig at en resistent subklon har dukket opp i henhold til selektivt trykket av målrettet terapi. Det finnes også tilfeller hvor svaret vil bare bli sett i primærtumor og ikke i metastatisk nettstedet. I dette scenariet, er det mulig at nye mutasjoner har skjedd i metastatisk området fører til motstand. Disse dataene vil rettferdiggjøre behovet for en ny biopsi av metastatisk området for å bedre forstå ervervet resistens eller nye handlings mutasjoner slik at pasientene kan tilbys personlig behandling. Derfor kan det være viktig at fremtidige studier åpner for nye biopsier av metastaser til bedre å forstå metastaser og ervervet resistens.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. Kombinert fil av Pidestaller
tabell A. Listen over 1321 gener for målrettet sekvensering.; Tabell B. prøve sekvense beregninger; Tabell C. Mutasjonen sekvense beregninger
doi:. 10,1371 /journal.pone.0126670.s001 plakater (docx)
Takk
Totalt Cancer Care er aktivert, delvis, av den generøse støtte fra DeBartolo Family, og vi takke de mange pasientene som så gavmildt gitt data og vev til Total Cancer Care Consortium. Vår studie har også fått verdifull hjelp i Biostatistikk og bioinformatikk kjernefasiliteter på H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, en NCI utpekt Comprehensive Cancer Center, støttes under NIH stipend P30-CA76292.
