Abstract
Bakgrunn
Humant papillomavirus (HPV), spesielt HPV16 , er assosiert med utviklingen av både livmorhalskreft og tonsillare og intratype varianter i aminosyresekvensen av HPV16 E6 oncoprotein har vist seg å være assosiert med virale utholdenhet og kreft lesjoner. Av denne grunn av tilstedeværelsen av HPV16 E6 varianter i tonsill- plateepitelkarsinom (TSCC) i livmorhalskreft (CC), samt i livmorhalsprøver (CS), ble utforsket.
Metoder
HPV16 E6 ble sekvensert i 108 TSCC og 52 CC prøver fra pasienter diagnostisert 2000-2008 i fylket i Stockholm, og i 51 CS fra unge kvinner som deltar på en ungdom helsesenter i Stockholm.
Resultater
den sjeldne E6 variant R10G var relativt hyppig (19%) i TSCC, fraværende i CC og sjeldne (4%) i CS, mens den velkjente L83V variant var vanlig i TSCC (40%), CC (31%), og CS (29%). Forskjellen for R10G var signifikant mellom TSCC og CC (p = 0,0003), så vel som mellom TSCC og CS (p = 0,009). Den HPV16 europeiske fylogenetisk avstamning og dets derivater dominerte i alle prøver (mer enn 90%).
Konklusjon
den relativt høye frekvens av R10G varianten i TSCC, i forhold til hva som har blitt funnet i CC både i den foreliggende undersøkelse, så vel som i en rekke andre undersøkelser i forskjellige land, kan indikere en forskjell mellom TSCC og CC med hensyn til tumorfremkallelse og utvikling. Alternativt kan det være forskjeller med hensyn til den muntlige og cervical utbredelsen av denne varianten som må utforskes videre
Citation. Du J, Nordfors C, Näsman A, Sobkowiak M, Romanitan M, Dalianis T, et al. (2012) humant papillomavirus (HPV) 16 E6 Varianter i Tonsillar Kreft i forhold til de i livmorhalskreft i Stockholm, Sverige. PLoS ONE 7 (4): e36239. doi: 10,1371 /journal.pone.0036239
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 10 februar 2012; Godkjent: 29 mars 2012; Publisert: 27 april 2012
Copyright: © 2012 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av det svenske instituttet for Infectious Disease Control, den svenske Cancer Foundation (100 258), Vetenskapsrådet (K2011-56X-15282-07-6), Stockholm Kreftforeningen (101081), Stockholm City Council (2010067) og Karolinska Institutet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Torbjörn Ramqvist er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer ..
Innledning
Infeksjon med høy risiko (HR) menneskelige papillomavirus (HPV) har siden begynnelsen av 1980-tallet vært kjent for å føre til utvikling av livmorhalskreft og nå nylig også orofaryngeal kreft [1], [2]. Blant orofaryngeal kreft hovedsakelig tonsill- og base av tungen kreft er assosiert med HPV. Spesielt, har forekomsten av HPV positive orofaryngeal kreft økt de siste tiårene, både i Europa og i USA [3] – [5]. Ifølge svenske Kreftregisteret, i Sverige, i dag mer enn 400 nye tilfeller av livmorhalskreft og rundt 200 tilfeller av tonsill- kreft er diagnostisert hvert år.
Alle HPV-typer som er kjent for å være assosiert med orofaryngeal kreft er også knyttet til livmorhals kreft og HPV16 dominerer i begge, forårsaker 50-60% av alle HPV-positive livmorhalskreft og omtrent 90% av alle HPV-positive tonsill- kreft. I tillegg, mens HPV-genomet er hovedsakelig integrert i livmorhalskreft, er det ofte episomal i tonsill- kreft [6]. Dette indikerer at, selv om det er mange likheter mellom disse to tumortyper kan det også være forskjeller både med hensyn til potensialet for HPV16 å forårsake tumorutvikling, og i måten forskjellige HPV-typer forårsake tumorer.
Varianter av HPV16 genomet i livmorhalskreft, i forstadier til livmorhalskreft, og i livmorhalsprøver fra ulike geografiske områder har blitt studert og HPV har blitt klassifisert i fylogenetiske linjene som europeisk (E), asiatiske (As), Asia og USA (AA), afrikansk-1 og -2 (Af-en og Af-2), og Nord American1 (NA1) [7] -. [11]
Den store trans proteiner av HPV16, E6 og E7 , rettet mot p53 og Rb respektivt, inhiberer apoptose og fremme spredning og dermed de fleste studier på HPV16-varianter har fokusert på E6 og E7 i tillegg til studier av den ikke-kodende region kontroll (NCCR). Varianter som er vist ofte forskjellig E6 og NCCR, mens den E7 proteinet er ofte mer konservert [12], [13]. I tillegg til de store variant linjene, varianter med enkle nukleotid- endringer er ofte funnet, spesielt i tumorer. Den hyppigste av disse mutasjonene er T til G overgang ved nt 350 i E6, forkortet som e-T350G, forårsaker en aminosyre-endring fra leucin til valanine ved A.A. 83 (L83V). Flere studier på L83V variant har vist en sammenheng med viral utholdenhet og kreft progresjon av livmorhalskreft, selv om noen senere studier har ikke klart å bekrefte denne tilknytningen [14] – [17]. Andre varianter er også blitt knyttet til egenskapene som er viktige for tumorutvikling slik som f.eks de som har evnen til å inhibere p53 transaktivering [18].
Mens mange studier på HPV16 varianter som er utført i livmorhalskreft, har meget få undersøkelser av denne type er gjort i hode-hals-kreft [19], [20 ]. Hensikten med denne studien var å derfor å undersøke om det var noen forskjell i forekomsten og hyppighet av HPV16 E6 varianter mellom tonsill- kreft og kreft i livmorhalsen. Av denne grunn utbredelsen av HPV16 E6 sekvenser ble sammenlignet i livmorhalsen og tonsillære kreftprøver fra pasienter diagnostisert i løpet av samme tidsrom i fylket i Stockholm, Sverige. I tillegg til å sammenligne data fra disse svulstene med frekvensene av HPV16 varianter hos friske personer, ble HPV16 E6 også analysert i livmorhalsprøver fra friske unge kvinner på en ungdom klinikk i Stockholm.
Resultater
HPV16 E6 varianter på aminosyre R10G og L83V
Femti-fem HPV16 positive TSSC, 52 CC og 51 CS ble analysert med hensyn til HPV16 E6 sekvens, Tabell S1. Det mest bemerkelsesverdige forskjellen mellom TSCC og CC ble funnet med hensyn til frekvensene av E-A131G variant forårsaker en endring fra arginin til glysin i A.A. 10 (R10G). Denne mutasjonen var til stede i 22% (12/55) av TSCC, mens fullstendig mangler i CC prøver og kun til stede i 4% (2/51) av livmorhalsprøver. Denne forskjellen var signifikant både mellom TSCC og CC (p = 0,0003) så vel som mellom TSCC og CS (p = 0,009).
E-T350G varianten var den mest vanlige hos alle de tre grupper av prøver . Denne varianten, forårsaker et skifte fra leucin til valin i aa 83 (L83V), var spesielt vanlig i TSCC (45%), etterfulgt av CC (31%) og CS (29%) henholdsvis.
Validering av R10G og L83V frekvenser i ytterligere TSCC prøver
for ytterligere å validere den økte frekvenser av R10G og L83V mutasjoner i TSCC, 53 flere TSCC prøver fra pasienter diagnostisert ved samme sykehus i løpet av samme periode ble evaluert bare for R10G og L83V mutasjoner. Blant disse 53 prøvene 17% (9/53) båret R10G og 34% (18/53) av L83V mutasjon. Når alle de 108 prøvene ble sammenfattet 19% hadde R10G og 40% av L83V mutasjonen. Majoriteten (12/21) av E6 fra TSCC husing R10G også inneholdt L83V. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom opprinnelig valgte 55 TSCC og den utvidede TCCS gruppe med hensyn til disse to mutasjoner.
Frekvens av andre varianter
Mutasjoner på andre områder var mindre vanlig for alle typer prøver, og bare 19/28 av disse påvirkes aminosyresekvensen. Den vanligste var Q14H og H78Y, både til stede i 4% av CC og CS, mens 7% av TSCC hadde Q14H og H78Y. I tillegg er to livmorhalskreft prøvene hadde 27 bp gjentar mellom nt 528 og 554.
Distribusjon av ulike fylogenetiske linjer
Som beskrevet i tabell S1, den HPV16 E6 europeiske prototype ble funnet hos 38% av TSCC, 65% av CC og 59% av CS. Imidlertid, når prøver med den europeisk type inneholdende mindre nukleotid-forskjeller (inkludert R10G og L83V) ble inkludert, disse tallene økt til 93, 94 og 96% henholdsvis. Som også vist i Tabell S1 andre typer, afrikansk-1 og 2, østasiatiske. Asian American og nordamerikanske ble bare funnet i noen prøver.
Korrelasjonen av HPV16 E6 varianter i tonsill- kreft med kliniske parametre
TSCC prøvene ble sammenlignet med hensyn til pasient- og kreftegenskaper basert på tilstedeværelsen av R10G, L83V eller fravær av disse variantene som presenteres i tabell 1. Det var imidlertid ingen signifikante forskjeller for noen av disse parametrene, selv om det var en tendens til at svulster med R10G å ha en lavere T scenen.
tilstedeværelsen av R10G eller L83V varianter i tonsill- kreft ble analysert i sammenheng med 3 års sykdomsfri overlevelse (DSF) av pasientene. Imidlertid, ingen signifikant korrelasjon ble funnet når DSF ble sammenlignet mellom pasienter med tilstedeværelse eller fravær av den R10G variant eller mellom pasienter med tilstedeværelse eller fravær av den L83V varianten (data ikke vist).
diskusjon
i denne studien har vi analysert og sammenlignet hyppigheten av ulike HPV16 E6 varianter i TSCC, CC og CS, alle hentet fra Stockholmsområdet området~~POS=HEADCOMP i løpet av samme periode. Vi fant ut at HPV16 R10G var relativt vanlig i TSCC, fraværende i CC og sjelden i CS. HPV 16 europeiske avstamning regjerte og L83V varianten var svært vanlig i alle tre kategorier av prøvene.
Det faktum at den ellers sjelden HPV16 E6 variant R10G ble observert i TSCC, men ikke i CC hos pasienter diagnostisert på samtidig perioden fra samme sykehus er slående. Denne varianten har til vår kunnskap har alltid vært sjeldne, men observert i CC i noen andre studier [11], [13], [18]. Selv om tiden fra HPV-infeksjon til utvikling av tonsillare kreft er ukjent det er sannsynlig lik mellom livmorhalskreft og tonsillare, ettersom median alder av pasientene er sammenlignbare. Dermed er det rimelig å anta at pasientene i denne studien med livmorhals og tonsill- kreft ble mest sannsynlig smittet med HPV16 under tilnærmet samme periode. Grunnen til den høye frekvensen av R10G variant i TSCC fra Stockholm, sammenlignet med CC fra både Stockholm og andre områder, er ukjent. En mulighet er at dette HPV16 variant eller annen grunn var /er mer vanlig i muntlig i forhold til underlivet. Videre studier på HPV16 innhentet fra muntlige prøver for å utforske denne muligheten. En annen mulighet kan være at denne variant av HPV16 har en større tilbøyelighet til å forårsake TSCC. Spesielt, selv om de fleste pasienter med TSCC var menn, og bare kvinner har CC, var det ingen kjønnsrelaterte forskjeller i de relative frekvensene av R10G i TSCC. De innsamlede data viser at nesten alle pasienter som bærer R10G varianten hadde Sverige som sitt hjemland, men vi har ikke opplysninger om de har flyttet til Stockholm fra andre deler av Sverige.
Det er vel etablert at HPV16 E6 sammen med E6AP (E6-assosiert protein) danner et kompleks som er spesielt rettet mot p53 og p53 medierer degradering, noe som er viktig for tumorigenesis [21], [22]. Flere studier har blitt utført på R10G variant i livmorhalskreft. Den R10G mutasjonen er i den N-terminale ende, viktig for p53-binding og nedbrytning, og det har også vist seg å resultere i et modifisert B /T-celle-epitop [13], [23], [24]. Det er blitt demonstrert at både E6 med R10G og L83V beholder evnen til å oppheve vekstarrest, og sterkt redusere de stabile nivåer av p53 [25]. Men mens E6 med R10G har en redusert binding til E6BP (E6-bindende protein) og redusert evne til å indusere Bax degradering, E6 med L83V E6 har en økt binding til E6BP og beholdt evnen til å indusere Bax degradering i forhold til prototype HPV16 E6 [18 ]. E6 med både R10G og L83 endring, som 9/12 TSCC hadde i denne studien, oppførte seg lik den prototypen [18]. I tillegg har R10G området også blitt rapportert til å være avgjørende for nukleære lokaliseringssignalet [26]. Dermed kan flere ulike funksjoner i R10G nettstedet påvirke kreft progresjon, selv om det er uklart i hvilken grad. I denne studien ble det ikke observert noen signifikant forskjell med hensyn til 3 års sykdomsfri overlevelse hos pasienter med TSCC bære eller ikke bære HPV16 E6 R10G variant. Dette argumenterer mot muligheten for at denne varianten vil føre til mer aggressivt voksende TSCC.
Andre varianter av HPV16 E6, spesielt L83V, varierer geografisk og kan påvirke patologisk risiko [27]. I denne studien L83V var den mest vanlige varianten i alle typer materiale, som er på linje med mange andre observasjoner både i underlivet og hode- og halsområdet [16], [19], [20], [28], [ ,,,0],29]. Her ble det en høyere forekomst av L83V funnet i TSCC forhold til CC og CS, mens utbredelsen i de siste kategoriene var omtrent i samsvar med tidligere rapporter [12], [14], [29] – [31]. Det er imidlertid flere studier som viser en sammenheng mellom L83V og økt virus utholdenhet, og risikoen for livmorhals neoplasi og kreft progresjon [28], [32]. Videre studier på HPV16 E6 varianter og den cellulære immunresponsen indikerer konkrete endringer, som fra en vert-virus immunologi synspunkt kan forklare en modifisert onkogene potensiale [33] – [35]. Verdt å merke seg, fant vi ikke noen signifikant sammenheng mellom tilstedeværelse eller fravær av L83V variant og 3 års sykdomsfri overlevelse av pasientene.
Det er bemerkelsesverdig at den europeiske HPV16 variant tydelig har omtrent samme veldig høy frekvens i CS fra unge kvinner, innhentet 2009-2010, som i CC prøver. Med økningen i reiser i løpet av de siste tiårene økt HPV16 varianter fra andre geografiske områder ville ikke ha vært uventet, men ingen slik økning ble observert.
En begrensning i denne studien er antall analyserte prøvene. Likevel, 108 TSCC analysert utgjør ca 65% av alle pasienter fra Fylkesmannen i Stockholm med HPV16 positiv TSCC diagnostisert i løpet av dette tidsrommet, og der biopsier var tilgjengelige [1], [36]. En annen begrensning er at bare E6 regionen ble analysert. Dermed, hvis det var noen forskjeller i NCCR, E7 eller E5 områdene mellom TSCC og CC prøver, disse ville ha vært savnet.
I denne studien fant vi en signifikant forskjell i fordelingen av HPV16 varianter mellom TSCC og CC prøver fra pasienter innlagt på samme sykehus under bestemt tidsperiode. Mer spesifikt, den sjeldne R10G varianten var betydelig mer vanlig i TSCC enn i CC, og var ofte i kombinasjon med L83V varianten i de tidligere tumorer. Videre studier er nødvendig for å undersøke om R10G variant kan være mer vanlig i muntlig i forhold til livmorhalsprøver. I tillegg var det relativ samsvar mellom tilstedeværelsen av variantene i CC og CS.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av Etisk Komité ved Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige, i henhold til de etiske tillatelsene 2005 /431-31 /4, 2005 /1330-1332, 2008 /870-31 /4, 2008 /813-31 /2 og 2009 /1278-1231 /4. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne i studien.
Tumor og livmorhalsprøver materialet
Forbehandling parafin innebygd tumor biopsier fra pasienter fra Fylkesmannen i Stockholm, diagnostisert 2000-2007, med tonsill- plateepitelkarsinom (TSCC) eller 2003-2008 med kreft i livmorhalsen (CC). Alle tumorprøver hadde tidligere blitt analysert for tilstedeværelse og type HPV [1], [36] – [38]. Blant de 166 TSCC og 90 CC som var HPV16 positive, 55 TSCC og 52 CC ble tilfeldig valgt. I den andre del av studiet, for validering, 53 ytterligere, tilfeldig valgt, var HPV16-positive TSCC fra samme tidsramme inkludert. Et flytskjema for TSCC prøvene er presentert i Figur 1. I tillegg ble 51 HPV16 positive livmorhalsprøver (CS), fra en tidligere studie 2009-2010 på ungdoms helsesenter i Stockholm [39] tilfeldig valgt og analysert. De gjennomsnittlige alderen på kreftpasienter var 59,7 y (median 59 år, range 30-84 y) for TSCC pasienter og 50,3 y (median 45 y, range 25-88 y) for CC pasienter mens gjennomsnittsalderen for kvinner i ungdom klinikk var 19,9 y (median 20 y, range16-22 y).
Sekvense
DNA ble ekstrahert og analysert for forekomst av HPV og HPV-type som er beskrevet i tidligere studier [1], [37], [39]. For analyse av HPV16 E6 fra cancervev to primerpar som dekker hele E6 regionen ble benyttet. 5’CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 «sammen med 5′-TGCTGTTCTAATGTTGTTCC-3» forsterke bp 57-375 og 5’GGAATCCATATGCTGTATGT-3 «sammen med 5’TGCAATGTAGGTGTATCTCC-3′ forsterke bp 273-587. For livmorhalsprøver en primer par som dekker hele E6 ble benyttet; 5»-CCGGTTAGTATAAAAGCAGACAT-3 «og 5′-GTACCCTCTTCCCCATTGGT-3» forsterke bp 57-902. PCR ble utført med glødetemperaturen ved 49 ° C og produktene ble renset ved anvendelse av ExoSAP-IT (USB, VWR) i henhold til protokollen fra produsenten. En PCR for sekvensering ble utført på de rensede produkter med Big Dye ™ terminator (Applied Biosystems) og amplikonene ble analysert i et Applied Biosystems 3130 sequencer. Begge DNA-trådene ble sekvensert og DNA-sekvensen og tilsvarende aminosyresekvens ble sammenlignet med referanse europeiske HPV16 sekvens (referansekode: NC_001526.1) ved hjelp av Sci-Ed programvare (Science and Educational Software, Durham, NC, USA). Tre etterforskere (JD, CC og MS) var involvert i analysen av sekvensene. For tilfeller hvor resultatet oppnådd var uklar, ble sekvensering gjentas.
Statistisk analyse
Forskjeller i frekvenser av varianter for TSCC og CC eller CS ble evaluert av chi-kvadrat og Fischer eksakte test ( tosidige) med on-line statistisk analyse programvare (GraphPad Software). Gjennomsnittlig alder var alder ved første diagnosen.
Sykdomsfri overlevelse (DFS) ble definert som tiden fra dato for diagnose til datoen for den siste kjente anledning at pasienten var sykdomsfri, eller dato for tilbakefall av sykdom (lokalt, regionalt eller fjernmetastaser). Død uten dokumentert tilbakefall ble sensurert på tidspunktet for dødsfallet. Akkumulert overlevelse ble beregnet med Kaplan-Meier metoden og analysert med log-rank test. Analyse av overlevelse ble utført i SPSS (IBM SPSS statistikk, versjon 20).
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Hyppigheten av ulike HPV16E6 varianter i livmorhalskreft (CC), tonsill- plateepitelkarsinom (TSCC) og livmorhalsprøver (CS)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0036239.s001 plakater (DOC)
takk
forfatterne ønsker å takke jordmor, Jenny Kugelberg, Ingrid Madarász, Anne Henriksson Klintberg, Kicki Bergström, Åsa Weitzberg, Kerstin Johanssson på ungdomsklinikken for å få hjelp med å samle inn prøvene .
