Abstract
Tumor invasjon og metastase involverer komplekse ombygging av genekspresjon programmene som styrer epitel homeostase. Mutasjons aktivering av RAS-ERK er en hyppig forekomst i mange kreftformer, og har vist seg å drive overekspresjon av AP-1-familien transkripsjonsfaktor FRA1, en potent regulator av migrering og invasjon i en rekke forskjellige tumorcelletyper. Imidlertid er arten av FRA1 transkripsjonelle mål og de molekylære reaksjonsveier gjennom hvilket de fremmer tumorprogresjon forblir dårlig forstått. Vi fant at FRA1 ble sterkt uttrykt i tumorceller ved invasiv foran menneskelige kolorektal kreft (CRC), og at dens uttømming undertrykte mesenchymale-lignende funksjoner i CRC celler
in vitro
. Genome-wide analyse av FRA1 kromatin belegg og transkripsjonsregulering identifisert epitel-mesenchymale overgang (EMT) -relaterte gener som en stor klasse av direkte FRA1 mål i CRC celler. Ekspresjon av det pro-mesenchymale undergruppe av disse genene forutsagte uheldige utfall i CRC-pasienter, og er involvert FRA-1-avhengig regulering og samarbeid med TGFp signalveien. Våre funn viser en uventet utbredt og direkte rolle for FRA1 i kontroll av epitelial-mesenchymale plastisitet i CRC celler, og foreslår at FRA1 spiller en viktig rolle som formidler krysstale mellom onkogene RAS-ERK og TGFB signalnettverk under tumorprogresjon.
Citation: Diesch J, Sanij E, Gilan O, kjærlighet C, Tran H, Fleming NI, et al. (2014) Utbredt FRA1 avhengig styring av Mesenchymale transdifferensiering programmer i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 9 (3): e88950. doi: 10,1371 /journal.pone.0088950
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 03.11.2013; Godkjent: 16 januar 2014; Publisert: 21 mars 2014
Copyright: © 2014 Diesch et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjekttilskudd 1026228 og 1044168 (til ASD) og Senior Stipend (til RDH, RBP og JMM) fra National Health and Medical Research Council of Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lokale invasjon og metastasering av tykktarms og noen andre carcinoma typer er tenkt å involvere forbigående ombygging av epitelial tumor celle fenotype til en invasiv mesenchymale-lignende tilstand, preget av defekter i tett og adherens krysset dannelse, øke i mellom filament proteiner (f.eks vimentin), og forhøyet ekspresjon av proteaser som medierer degradering av den ekstracellulære matriks. Slike epitel-mesenchymale overganger (EMT) og mesenchymale-epitelial overganger (MET) innebære omfattende og svært koordinerte endringer i genuttrykk, regulert av komplekse signal og transkripsjonsfaktorer nettverk som engasjerer mester EMT transkripsjonsfaktorer som tilhører den grunnleggende helix-loop-helix ( bHLH), sneglen, Twist og ZEB familier [1] – [3]
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en genetisk heterogen sykdom som metastatisk spredning til leveren, lungene, bukhulen og bein utgjør store kliniske problemer. [4]. Mer enn 50% av CRC havnen onkogene mutasjoner i
KRAS
eller
BRAF
gener, som driver vedvarende aktivering av ERK MAPK veien. Disse mutasjonene vanligvis oppstår på et relativt tidlig stadium i løpet av adenom-karsinom progresjon, etter funksjonell tap av tumor suppressor APC, og deres høye forekomsten av samsvar i grunnskolen og metastatisk kreft tyder på at de bidrar til både startfasen og progresjon [5] – [ ,,,0],8]. På senere stadier, noen svulster erverve mutasjoner (
TGFBR2
,
SMAD2
,
SMAD3
eller
SMAD4
) som forstyrrer signalering via TGFfi sti, som gir veksthemmende signaler i normal intestinal epitel.
i CRC, er EMT-lignende hendelser sterkt assosiert med spirende, en patologisk fenomen observert i 20-40% av tilfellene, der kreftceller løsner fra invasive fronten og invadere inn i den omgivende grunnmembranen [9], [10]. Samspillet mellom EMT og MET har også vært foreslått å ligge under den observasjon at basalmembranen uttrykk er ofte tapt på invasiv forsiden av CRC, men gjenvant i metastaser [11]. Flere nylig, har flere studier identifisert EMT-relaterte genekspresjonssignaturer som en vanlig forekomst i primær CRC, som er sterkt assosiert med dårlig prognose og motstand mot målrettet terapi [12] -. [15]
En av de store veier som er involvert i induksjon og vedlikehold av EMT hendelser under utvikling og tumorigenesis er TGFB veien. Selv om aktivering av veien er veksthemmende i normale epitelceller, har onkogene RAS-ERK signal blitt rapportert å indusere en paradoksal bryter i sin rolle fra tumor suppressor til pro-metastatisk faktor, blant annet gjennom aktivering av EMT-relaterte programmer [2] , [16] – [19]. Mekanismene bak pro-ondartet krysstale mellom RAS og TGFB trasé under CRC progresjon er ikke godt forstått. Forstyrrelse av TGFB veien er en hyppig hendelse i CRC. Fullstendig inaktivering av TGFp signalisering gjennom mutasjon av type II TGFp-reseptor (
TGFBR2
) locus er en vanlig forekomst i 15% av CRC viser DNA mikrosatelitt ustabile (MSI), som for sikkerhets skyld er forbundet med gunstige resultater [prognostiske ,,,0],20]. De resterende 85% av mikro stabil (MSS) kreft vise kromosom ustabilitet (CIN), og ofte (~ 50% av tilfellene) havnen mutasjoner i
SMAD4
genet, og sjeldnere
SMAD2
og
SMAD3
gener [21]. Nyere studier har vist at
TGFBR2
genotype er den viktigste faktoren som avgjør en mangel på EMT-lignende reaksjoner på TGFβ1 i MSI-positive tumorer, mens CRC celler med
SMAD4
mutasjoner beholder evnen til å gjennomgå EMT ved TGFβ1 behandling gjennom kopling med ERK-reaksjonsveien [22]. Naturen av ERK pathway effektorer som kreves for disse svarene er foreløpig uklart.
Activator Protein-en kompleks er en viktig regulator av transkripsjons responser som induseres av ulike kreftassosierte signalveier. Den består av homo- eller hetero dimerer av Fos, Jun, ATF og MAF familiemedlemmer, hvis virksomhet er sterkt påvirket av onkogene signal hendelser. Aktiverende mutasjoner i RAS pathway komponenter har vist seg å indusere overekspresjon av Fos familiemedlem FRA1, en meget ustabilt protein som blir uttrykt ved lave nivåer i normale celler [23], [24]. Transkripsjonen induksjon og post-translasjonell stabilisering av FRA1 av onkogent RAS-ERK signale øker den relative overflod av FRA1 inneholdende AP-1-dimerer, som er årsaksmessig koblet forbedret migrering og invasjon av CRC og flere andre karsinom celletyper, inkludert bryst, lunge, blære, hode og nakke, skjoldbruskkjertelen og hjerne [6], [23] – [34]. I tillegg til den RAS-ERK vei, er FRA1 ekspresjon indusert av Wnt /β-catenin banen i CRC-celler [40], [41], som tyder på at den kan spille en rolle i å integrere signalisering gjennom disse banene i løpet av CRC progresjon.
i denne studien, søkte vi et genom-wide tilnærming til bedre forstå innholdet av transkripsjonsprogrammer ligger til grunn for pro-ondartede handlinger FRA1 i CRC. Vi fant at FRA1 binder og regulerer uttrykket av en klinisk relevant kohort av gener assosiert med EMT i invasiv CRC celler, med stabil FRA1 knockdown påkalle en MET-lignende fenotypiske bryter. FRA1 var sterkt anriket i spirende kreftceller ved invasiv foran menneskelige CRC, og uttrykk for sine pro-mesenchymale målene identifisert en undergruppe av primære kreft med dårlig prognose. Mekanistisk, fant vi at aktivering av mesenchymale gener involvert FRA1 avhengig regulering og samarbeid med TGFB signalnettverk. Samlet våre funn tyder på at FRA1 spiller en utbredt og direkte rolle i transkripsjonen kontroll av epitel-mesenchymale programmering under CRC progresjon.
Resultater
FRA1 er beriket i tumorceller ved invasiv foran menneske CRC
Selv om det ble tidligere rapportert at FRA1 er mer høyt uttrykt i CRC enn normal kolorektal epitel [35], er ikke klarlagt sitt forhold til tumor patologi. Ved hjelp av immunhistokjemi, vi har oppdaget FRA1 immunoreaktivitets i 20 av 25 primær vevsprøver. I kontrast til dens svak ekspresjon i sentrum av tumorer, cellene ved det invasive fremre oppviste sterk FRA1 farging (figur 1A-1C), inkludert cytokeratin AE1 /AE3 positive klynger av celler [36] som hadde løsnet fra tumor bulk (figur 1D ). Denne siste funksjonen er en indikasjon på svulst spirende, et fenomen knyttet til oppkjøpet av mesenchymale-lignende funksjoner ved CRC celler, og er en uavhengig prediktor for lymfeknutemetastaser, kar og lymfesystemet invasjon, fjernmetastaser, lokalt tilbakefall og dårlig sykdomsfri overlevelse [9].
(A) Lavt strømforbruk bilde av en representant tykktarmskreft farget med et antistoff påvisning av FRA1. Stjernen indikerer lumen, mens pilene indikerer den dype invasive fronten. Scale bar representerer 1 mm. (B og C) Høyeffekt bilder av tumor sentrum (TC) og invasiv foran (IF) som er vist i (A). Pilspisser viser tumor knopper. Scale bar representerer 10 mikrometer. (D) Forholdet mellom intensiteten av atom FRA1 uttrykk og svulsten spirende markør, cytokeratin AE1 /AE3 i 25 CRC tilfeller.
FRA1 regulerer mesenchymale-lignende funksjoner i CRC celler
tidligere undersøkelser på de pro-invasive handlinger FRA1 i CRC har brukt BE cellelinje modell, som består av svært invasive mesenchymale-lignende celler som havn
KRAS Twitter /
BRAF
mutasjoner kjøre høy endogen FRA1 uttrykket [33], [37]. I samsvar med sin rolle som en viktig bidragsyter til AP-1 aktivitet i disse cellene, stabil knockdown av FRA1 å bruke to distinkte shRNAs konstruerer redusert både basal og c-Jun stimulert AP-en reporter gen aktivering (Figur 2A og 2B). Fenotypisk, FRA1 uttømming påberopt en slående mesenchymale til epitelial-lignende morfologiske bryter, med celler anskaffe en flat utseende, gjenvinne uttrykk for epitelial differensiering markør E-cadherin, og danner tett veikryss flekker positivt for ZO-1 (figur 2A og 2C). I tillegg FRA1-utarmet celler nesten helt mistet sin evne til å migrere og invadere
in vitro
, men deres sprednings prisene uendret (figur 2D-2F). Sammen utgjør disse funnene tyder på et behov for FRA1 for å opprettholde CRC-celler i en mesenchymale-lignende tilstand.
(A) Immunoblot-analyse av FRA1 og E-cadherin nivåer i BE-celler som stabilt transdusert med en ikke-tie kontroll ( shNS) eller FRA1 målretting shRNAs (shFRA1-A og -B). (B) Effekt av FRA1 knockdown på basal og c-Jun-indusert AP-en reporter genaktivitet i BE celler. (C) Fase kontrast (øverste rad) og immunfluorescens farging for DAPI med ZO-1 (midterste rad) eller vimentin (nederste rad) på cellene fra (A). Scale bar representerer 10 mikrometer. (D-F) Analyse av
in vitro
migrasjon, invasjon og spredning i celler fra (A). Feilfelt representerer S.E.M. for 3 uavhengige eksperimenter.
EMT-relaterte gener er en viktig klasse av direkte FRA1 mål i CRC celler
For å identifisere direkte transkripsjons mål og molekylære stier gjennom hvilke FRA1 styrer mesenchymale-lignende funksjoner i kreftceller, utførte vi genome-wide chip Seq og transkriptom analyse for å søke etter gener der FRA1 binding ble beriket, og hvis uttrykket ble regulert av FRA1 i BE celler. Til tross for flere forsøk på å optimalisere chip analyse ved bruk av antistoffer rettet mot endogen FRA1, var vi ikke i stand til å gjenopprette tilstrekkelig kromatin å utføre påfølgende high-throughput sekvensering. Vi ga derfor cellelinjer moderat (~ 5 ganger høyere enn endogen FRA1) overekspresjon en FLAG-FRA1 protein, som ble lokalisert i kjernen (figur 3A, B). I motsetning til en DNA-bindende defekt variant, villtype FLAG-FRA1 demonstrert sterk berikelse på arrangøren av
VIM
, en tidligere identifisert direkte FRA1 mål (figur 3C) [38].
(A) immunoblotanalyse av FRA1 uttrykk i BE-celler som stabilt transduced med en FLAG-FRA1 uttrykk konstruksjon av vektor (PBP) kontroll. (B) Immunofluorescensanalyse av FLAG-FRA1 lokalisering i celler fra (A). (C) ChIP analyse sammenligne binding av villtype og DNA-bindings defekte (DBD) FLAG-FRA1 proteiner til
VIM
promoter i BE celler. (D) Kryss av data fra microarray (FRA1 shRNA) og chip-Seq (FLAG-FRA1) analyse i BE celler. Chip-Seq resultater representerer gener der FRA1 bindingen ble beriket 5 ganger i forhold til inngangskontroll innen 5 kb av transkripsjon start hotellet (TSS). Bare kommenterte gener gjennomgår minst 2 ganger endring i uttrykket på FRA1 lyddemping (p 0,05) ble vurdert, og gener assosiert med flere FLAG-FRA1 toppene ble kun en gang. (E) Ontologisk analyse av gener identifisert etter krysset av microarray og chip-Seq datasett. Gener ble gruppert i store biologiske pathways bruker GeneGo.
Ved hjelp av mikromatriser, fant vi at FRA1 knockdown i BE celler betydelig oppregulert uttrykk for 1392 gener samtidig redusere uttrykket av 832 gener ved minst to ganger (Figur 3D). Spon Seq analyse viste at 72% prosent av den FRA1-regulerte gener inneholdt loci vesentlig anriket for FRA1 binding (mer enn 5 ganger) i løpet av 5 kb av deres transkripsjonsstartsetet (TSS). For å identifisere viktige funksjonelle klasser av FRA1 målgener, krysses vi microarray og chip-Seq data og avhørt overlappende gener for anriking av genet ontologi vilkår (ved hjelp GeneGo). Av de 6 grupper er identifisert ved hjelp av denne tilnærmingen, ble tre betydelig anriket for gener assosiert med EMT-relaterte prosesser, mens ytterligere 3 grupper omtalt vedheft relaterte gener (Figur 3E). Disse funnene indikerer at EMT og heft er to viktige prosesser i direkte FRA1 transkripsjonen kontroll i CRC celler.
Basert på fenotypiske endringer som følge av FRA1 knockdown i BE celler, og sammenhengen mellom svulst spirende og EMT i CRC [ ,,,0],9], valgte vi å fokusere på involvering av FRA1 i å regulere EMT hendelser i CRC. Kollektivt EMT-relaterte gener bundet og regulert av FRA1 (heretter betegnes FRA1
EMT gener) kodet et variert utvalg av proteiner involvert celle adhesjon, signaltransduksjon, transkripsjon, cytoskeletal og ekstracellulære matrise ombygging, samt komponenter av TGFB signalnettverk (Figur 4A og tabell S1 i File S1). Disse genene bredt omfattet en pro-mesenchymale undergruppe som uttrykk ble fremmet av FRA1 og en epitelial undergruppe som ble undertrykt av FRA1. Mange av genene inneholdt flere loci okkupert av FRA1, som først og fremst var plassert innenfor intronic regioner av genet kroppen og i distal oppstrøms områder (Figur 4B og Tabell S2 i File S1). Motiv analyse viste at 58% av de gener som inneholdes i det minste en FRA1 bindingssete vesentlig anriket for en konsensus AP-1-bindingssekvens (p 0,0001, Tabell S3 i File S1). Vi har også lagt merke til betydelig berikelse (p 0,001) for mulige MEF-2 motiver i EMT-relaterte mål identifisert i chip-Seq analyse. Til slutt, vi utførte chip og QRT-PCR-analyse for å bekrefte anriking av FRA1 på flere loci identifisert av Chip-Seq (figur 4C) og FRA1 avhengig regulering av utvalgte mål i BE celler (figur 4D).
( A) Varme kart som viser ulike funksjonelle grupper av EMT-relaterte gener bundet og regulert av FRA1 (FRA1
EMT gener). Data fra RNA-Seq analyse av to kloner av BE shFRA1-A celler (n = 4 for hver cellelinje) ble normalisert i forhold til shControl celler. Regioner vist i rødt representerer gener assosiert med en epitelial tilstand som ble oppregulert ved FRA1 lyddemping (log fold-endring -1, p 0,05), mens grønne områder representerer mesenchymale-type gener trykt av FRA1 lyddemping (log fold-endring 1 , p 0,05). (B) Fordeling av genomisk FLAG-FRA1 bindingssteder identifisert av Chip-Seq i forhold til en tilsvarende genet. Antallet leser identifisert for hver region er uttrykt som en prosentandel. (C) ChIP-qPCR analyse av FLAG-FRA1 binding til genomiske regioner i utvalgte FRA1
EMT gener. Data representerer relative berikelse i forhold til foreldre BE celler. Et område av miRNA-21-genet ikke er bundet av FLAG-FRA1 ble anvendt som negativ kontroll (
CTRL
). (D) QRT-PCR-analyse av utvalgte FRA1
EMT gener i BE-celler som stabilt transduced med en av to uavhengige shRNAs målretting FRA1. Data er representert i forhold til uttrykk nivåer i celler shNS celler. T-test ble brukt for alle sammenligninger (
* p 0,05,
** p 0,01,
*** p 0,001). Feilfelt representerer S.E.M. for 3 uavhengige eksperimenter. (E) FRA1 proteinnivå og (F) uttrykk for epitel og mesenchymale markørgener i et panel av CRC cellelinjer.
Uttrykk for pro-mesenchymale FRA1 mål spår dårlige kliniske utfall
for å vurdere potensialet kliniske relevansen av EMT-relaterte FRA1 mål, undersøkte vi sammenhengen mellom deres uttrykk og CRC prognose etter avhør eksisterende microarray data fra 185 stadium B og C tilfeller [12]. Unsupervised clustering av dataene viste at svulstene kan deles inn i epithelial- og mesenchymale-lignende undergrupper viser genuttrykk forskjeller svært samstemmige med FRA1
EMT signatur (figur 5B og tabell S4 i File S1), med 77% av gener ( 137 probesets) viser retningsendringer i samsvar med de som er identifisert ved FRA1 knockdown i BE celler.
(A) Kaplan-Meier plott av tilbakefall overlevelse i trinn B og C CRC pasienter i henhold til uttrykk av FRA1 genet (
FOSL1
). (B) Unsupervised gruppering av scenen B og stadium C CRC basert på FRA1
EMT gener omfatter samstemmige probesets stiller betydelige uttrykk forskjeller mellom de to hovedgruppene. Clustering deler kreft i grupper med mesenchymale og epiteliale profiler. Prøver som er anordnet langs X-aksen og gener langs Y-aksen. Gener er gruppert i de nedregulert (blå) eller oppregulert (oransje) ved FRA1 knockdown i BE celler i forhold til menings og sample-sentrert skalert uttrykk. (C) Kaplan-Meier plott av tilbakefall overlevelse i trinn B og C CRC pasienter basert på uttrykk for både
FOSL1 plakater (lav vs høy) og mesenchymale (Mes, mørk grønn) eller epithelial (Epi, lys grønn) undergrupper av FRA1
EMT gener. Den log-rank test ble brukt for sammenligninger.
Vi har også funnet at høye nivåer av FRA1 genet (
FOSL1
) uttrykk uavhengig spådd dårlig tilbakefall overlevelse og var assosiert med en høyere T-stadium, en indeks av avansert tumorinvasjon (figur 5A og tabell S5 i File S1). Selv
FOSL1
uttrykk ble påvist i både epithelial- og mesenchymale-lignende svulster, uttrykket var signifikant høyere (p 0,05) i den sistnevnte gruppen. Ekspresjon av pro-mesenchymale FRA1 mål var anriket på 48,6% (90/185) av primære tumorer, noe som har hatt en tidligere diagnose alder (median 64 vs 70 år, p = 0,005) og høyere lymfeknute trinn (N2 76% vs 24% , p = 0,0098) sammenlignet med epitelial-type tumorer (Tabell S6 i File S1).
Integrering data på
FOSL1
uttrykk og FRA1
EMT signatur betydelig forbedret prediksjon av gjentakelsesrisiko , grovt skille pasientene inn i 3 effektbaserte grupper (figur 5C og tabell S7 i File S1): (i) en god prognose gruppe bestående av
FOSL1
lave epitel-type kreft, (ii) en middels prognose gruppen bestående
FOSL1
lav mesenchymale-type kreft og
FOSL1
høy epitel-type kreft, og (iii) en dårlig prognose gruppe
FOSL1
høy mesenchymale-type kreft. Disse funnene tyder på at kombinasjonen av forhøyet
FOSL1 Hotell og pro-mesenchymale FRA1 target genekspresjon i primære svulster gir en robust prediktor for uheldige utfall i CRC-pasienter.
Cross talk mellom FRA1 og TGFB signale styrer mesenchymale genuttrykk
Gitt deres tilknytning til uønskede kliniske utfall (figur 5), vi neste søkt å få en dypere mekanistisk innsikt i FRA1 avhengig styring av mesenchymale uttrykk programmer i CRC celler. Spesielt vi lurte på om i tillegg til direkte binding og regulere deres transkripsjon, kan FRA1 fremme uttrykk for pro-mesenchymale gener ved å modulere aktiviteten av EMT-assosiert signalveier som komponentene vi hadde identifisert som direkte FRA1 mål. Den mest representert av disse var gener som virker i TGFfi signale nettverk, inkludert de koding aktivering (
TGFB2
) og hemmende ligander (
BMP4
,
BMP7
), hvis uttrykk ble forfremmet eller undertrykt av FRA1 henholdsvis (figur 4A, 4C og 4E). Å være den eneste aktivere ligand identifisert som en FRA1 mål, valgte vi å undersøke potensialet bidrag TGFβ2 signale i å regulere uttrykk for et utvalg av FRA1
EMT mål. Forbigående knockdown av
TGFB2
i foreldre BE cellene betydelig redusert uttrykk av flere pro-mesenchymale (
AXL
,
VIM
), men ikke epitelial (
CDH1
CLDN7
) FRA1 målgener (Figur 6A). Lignende effekter ble også observert ved forbigående knockdown av en annen FRA1 bundet mål skuespill i veien, som koder for transkripsjonsfaktor SMAD3 (figur 6B). For direkte å undersøke muligheten for at en FRA1 avhengig autokrin sløyfe TGFβ2 ble opererer i disse cellene, ble de behandlet med type 1 TGFp-reseptorinhibitor SB43152 å blokkere transduksjon av TGFβ2 signaler. I samsvar med effekten av
TGFB2
knockdown, fant vi at uttrykket av flere pro-mesenchymale FRA1 mål (
AXL
,
VIM
,
TGFBI
) ble betydelig redusert etter 3 dager med SB43152 behandling.
(A og B) uttrykk for valgt mesenchymale (
TGFBI
,
AXL
) og epitel (
CDH1
,
CLDN7
) FRA1
EMT gener ved forbigående knockdown av TGFB pathway FRA1 mål
TGFB2 Hotell og
SMAD3
hjelp siRNA bassenger i BE celler. Data er representert i forhold til nivåer av disse genene i celler transfektert med siRNAs rettet mot GFP. (C) Effekter av TGFB reseptoren hemmer SB43152 (10 mm i 72 timer) på uttrykk for en valgt mesenchymale FRA1
EMT (
TGFBI
,
AXL
) gener i BE celler. T-test ble brukt for alle sammenligninger (
* p 0,05,
** p 0,01,
*** p 0,001). Feilfelt representerer S.E.M. for 3 uavhengige eksperimenter.
For ytterligere å undersøke omfanget av krysstale mellom FRA1 og TGFfi sti, vurderte vi uttrykket av flere mesenchymale og epiteliale FRA1 mål i en annen
KRAS
mutant TGFB-responsive CRC cellelinje, SW837. Til tross FRA1 nivåer blir forhøyet i disse cellene (Figur 7a), deres uttrykk for de pro-mesenchymale gener
VIM Hotell og
AXL
var lavt i forhold til BE celler, mens de epiteliale gener
CDH1 Hotell og
CLDN7
ble sterkt uttrykt (figur 7B). Behandling med liganden TGFβ1 robust indusert uttrykk for
VIM
, et svar som ble betydelig svekket etter forhånds FRA1 knockdown (figur 7C). I motsetning uttrykk for de epiteliale FRA1 målene
CDH1 Hotell og
CLDN7
var upåvirket under de samme betingelsene. Disse resultatene tyder på at ekspresjon FRA1 modulerer hvilken grad TGFp signalering kan indusere pro-mesenchymale transkripsjonelle reaksjoner i CRC-celler.
(A) Immunoblot-analyse av endogent FRA1 ekspresjon i BE og SW837 CRC-celler. (B) QRT-PCR-analyse som sammenligner relative uttrykk nivåer av et utvalg av mesenchymale (
AXL
,
VIM
) og epitel (
CDH1
,
CLDN7
) FRA1
EMT gener i BE og SW837 CRC celler. (C) Effekter av forbigående FRA1 knockdown på TGFβ1-indusert (10 ng /ml 48 h) uttrykk for
VIM
,
CDH1 Hotell og
CLDN7
i SW837 celler. T-test ble brukt for alle sammenligninger (
* p 0,05). Feilfelt representerer S.E.M. for 3 uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Den lokale invasjon og metastatisk spredning av kreft innebærer konkrete, svært koordinert og dynamisk ombygging av tumorceller genuttrykk gjennom toveis krysstale mellom alarm og transkripsjonen nettverk. Mye gjenstår å bli forstått om hvordan disse nettverkene er regulert av tumor-assosiert genetiske og epigenetiske lesjoner, og mekanismene der de er koordinert for å indusere spesifikke endringer i genuttrykk under invasjonen.
transkripsjonsfaktor AP-1 har lenge vært implisert som en sentral regulator av tumorcelle-invasjon [39]. FRA1 er en av de mest overuttrykt AP-1 proteiner i faste kreftformer, og dens evne til å fremme trekkende og invasive egenskaper i en rekke forskjellige tumorcelletyper [26] – [32] tyder på at dets handlinger omfatter inngrep av felles mål og trasé. Identiteten til disse banene er i dag uklart, mens bare en håndfull av sine direkte transkripsjons mål i carcinoma celler identifisert hittil. Gjennom analyse av dens genom-wide kromatin belegg og målet genregulering, denne studien identifiserer gener og stier involvert i celle adhesjon og EMT som hovedklasser av direkte FRA1 mål knyttet til CRC progresjon.
EMT-lignende genekspresjon signaturer har blitt rapportert å korrelere med dårlig prognose og motstand mot målrettet terapi i CRC-pasienter, men mekanismene som regulerer deres opprinnelse er dårlig forstått [12] – [15]. Våre funn tyder på at FRA1-regulerte transkripsjonelle arrangementer spiller en viktig rolle i denne prosess, med forhøyede nivåer av pro-mesenchymale FRA1 mål assosiert med uheldige utfall i omtrent halvparten av alle trinn b og trinn c kreftformer, mens høye nivåer av FRA1 gen (
FOSL1
) uttrykk i disse mesenchymale-type identifisere kreft med dårligst prognose.
Patologisk EMT i CRC sterkt knyttet til tumor spirende, en uavhengig prognostisk indikator på høyere lymfeknutemetastase, kar og lymfesystemet invasjon, fjernmetastaser, lokalt tilbakefall og dårlig sykdomsfri overlevelse [9]. Mens FRA1 uttrykk vises relativt homogent i tumorcellelinjer, fant vi ut at det var sterkt anriket ved invasive regioner og i spirende celler, men ikke i sentrum av primære svulster. Mekanismen bak denne begrensede ekspresjon i tumorer er foreløpig uklart, men en lignende lokalisering mønster er blitt rapportert for Wnt veien transkripsjonen effektor, β-catenin [40], [41]. Som β-catenin induserer transkripsjon av FRA1 genet i CRC celler, kan FRA1 /β-catenin cooperativity spille en viktig rolle i å kontrollere lokalisert transkripsjon av pro-invasive gener i kolorektal tumorer, en forestilling som støttes av våre opplever at FRA1 binder direkte og regulerer flere pro-invasive β-catenin mål, inkludert
MMP14
,
LAMC2
,
VIM Hotell og
ZEB1 product: [11], [42] – [ ,,,0],46].
induksjon av EMT innebærer ombygging av flere cellulære prosesser, inkludert heft, signalering, transkripsjon, og ekstracellulære matrise ombygging. Det er økende bevis for at kreftceller viser ofte bare noen av disse endringene, for eksempel uttrykke en undergruppe av mesenchymale markører samtidig beholde epitelceller funksjoner [3]. Evnen av tumorceller til transitt fra et epitelial til mesenchymale lignende tilstand er således sannsynlig å være svært kontekstspesifikk, og krever cooperativity mellom flere signalering og transkripsjonelle nettverk. Evnen til å binde FRA1 og regulere gener som er involvert i forskjellige EMT-assosierte prosesser antyder at den kan spille en viktig rolle i koordinerte EMT arrangementer. Interessant, i BE CRC celler, FRA1 binding var involvert både i å opprettholde uttrykk for pro-mesenchymale gener, mens undertrykke en epitelial undergruppe. Flere mulige mekanismer som kan bidra til disse motstridende virkninger av FRA1, inkludert dets sammenstilling inn i distinkte FRA1 /jun komplekser innen de samme celler, dens kopling med forskjellige signalnettverk, og evne til å fremme ekspresjon av master EMT transkripsjonfaktorer, ZEB1 og /eller SNAI2 . I tillegg FRA1 binding kan føre til lokaliserte endringer i kromatin dynamikk, en rolle nylig tilskrevet AP-en i å regulere induserbarheten av glucorticoid reseptor mål [47]. FRA1 kan således bidra til genereringen av ettergivende kromatin sammenhenger, er nødvendig for både omprogrammering av CRC-celler til en mesenchymale tilstand, og deretter til å opprettholde driften av mesenchymale programmer når tumorceller spre. Interessant, binding de store regionene i AP-en tidligere identifisert nær glukokortikoid reseptor mål og i denne studien forekom oppstrøms målet genet arrangører eller innen introner, impliserer en rolle for FRA1 i transkripsjonen kontroll på en forsterker nivå og /eller nedstrøms transkripsjonsinitieringen (f.eks forlengelse).
Mens stabil FRA1 knockdown påkalt en MET-lignende fenotypiske endring i BE celler, har vi registrert at mange FRA1-overekspresjon CRC cellelinjer beholde epitelceller funksjoner (ASD, upublisert). Dermed FRA1 uttrykk alene er ikke tilstrekkelig til å drive EMT-lignende celleforandringer, men kan gjøre det i samarbeid med andre veier. Ja, vi identifiserte komponenter av flere signalnettverk som direkte FRA1 mål i BE celler, med den mest representert handler i TGFB veien. Vi har funnet at en underliggende funksjon av FRA1 i CRC-celler ble for positivt å regulere TGFfi signalering, som det kan gjøre via flere mekanismer; i mesenchymale lignende BE cellelinje, dets bindings modulert ekspresjon av multiple TGFp spredningsveier komponenter, inkludert å opprettholde drift av en autokrin løkke TGFβ2 som fremmet ekspresjon av mesenchymale gener. Men i epitelceller lignende SW837 CRC cellene der autokrint TGFB signale ikke ble etablert, ble FRA1 nødvendig for TGFB-indusert mesenchymale genuttrykk svar. Kollektivt våre funn tyder på at FRA1 kan spille en viktig rolle i å koble onkogene RAS-ERK signalering med TGFp reaksjonsveien for å styre EMT-lignende reaksjoner i CRC-celler. Vi foreslår at FRA1 kan ha en tilsvarende funksjon i andre kreftformer hvor det er overuttrykt slik som bryst-, hvor FRA1 har nylig blitt vist å spille en viktig rolle i regulering av EMT arrangementer og metastase [25], [48], og hvori TGFp Tabell S2. Tabell S3. Tabell S4.
