Abstract
Bakgrunn
Phyllanthus
er en tradisjonell medisinsk plante som har vært brukt i behandling av mange sykdommer som hepatitt og diabetes. Hovedmålet med dette arbeidet var å undersøke de potensielle cytotoksiske effekten av vannholdige og metanoliske ekstrakter av fire
Phyllanthus
arter (
P.amarus, P.niruri, P.urinaria
og
P.watsonii
) mot huden melanom og prostata kreft celler.
metodikk /hovedfunnene
Phyllanthus
anlegget ser ut til å ha cytotoksiske egenskaper med halvmaksimalt hemmende konsentrasjon (IC
50) verdier av 150-300 ug /ml for vandig ekstrakt og 50-150 mikrogram /ml for metanolholdig ekstrakt som ble bestemt ved hjelp av MTS reduksjon analysen. Til sammenligning ble det av planteekstrakter ingen signifikant cytotoksisitet på normal human hud (CCD-1127Sk) og prostata (RWPE-1) celler. Ekstraktene ut til å virke ved å forårsake dannelsen av en klar «ladder» fragmentering av apoptotisk DNA på agarose-gel, som vises TUNEL-positive celler med en høyde av kaspase-3 og -7 aktiviteter. Den laktatdehydrogenase (LDH) nivået var lavere enn 15% i
Phyllanthus
behandlede kreftceller. Dette tyder på at
Phyllanthus
ekstrakter har evnen til å indusere apoptose med minimale nekrotiske effekter. Videre viste cellesyklus analyse som
Phyllanthus
induserte en Go /G1-fasen ble arrestert på PC-3 celler og en S-fase arrest på MeWo celler og disse ble ledsaget av opphopning av celler i Sub-G1 ( apoptose) fase. De cytotoksiske egenskaper kan være på grunn av tilstedeværelsen av polyfenol-forbindelser, så som ellagitanninene, gallotannins, flavonoider og fenoliske syrer finnes både i vann og metanol ekstrakt av plantene.
Konklusjoner /Betydningen
Phyllanthus
plante utøver sin virkning vekstinhibisjon på en selektiv måte mot kreftceller gjennom modulering av cellesyklus og induksjon av apoptose via caspaser aktivering i melanom og prostata kreftceller. Derfor
Phyllanthus
kan være hentet for å utvikle en potent apoptose-induserende antikreftmiddel
Citation. Tang YQ, Jaganath IB, Sekaran SD (2010)
Phyllanthus
spp. Induserer selektiv vekst Hemming av PC-3 og MeWo humane kreftceller gjennom Modulation av Cellesyklus og induksjon av apoptose. PLoS ONE 5 (9): e12644. doi: 10,1371 /journal.pone.0012644
Redaktør: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, India
mottatt: 25 juni 2010; Godkjent: 17 august 2010; Publisert: 08.09.2010
Copyright: © 2010 Tang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av hovedfagsstipend, Universitetet Malaya (UM PS183 /2009b) (www.um.edu.my) og malaysiske Agricultural and Research Development Institute (MARDI) (53-02-03-1002) (www.mardi.gov .min). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er et navn gitt til gruppen av sykdommer som oppstår fra ukontrollert vekst, spredning av en unormal celle og kan resultere i døden. Det er ekstremt vanskelig å behandle på grunn av flere distinkte klasser av tumorer som oppviser forskjellige reaksjoner på behandlingen og ikke alle anticancermidler effektivt å gi en positiv respons i alle tilfeller [1]. Noen har blitt rapportert å oppvise toksisitet overfor normale celler, ledsaget av bivirkninger som oppkast, kvalme og alopesi. Dermed har ineffektive cytostatika resultert i høy dødelighet hos kreftpasienter [2]. Melanom er en type hudkreft som oppstår fra melanocytter, et pigment-produserende tanning celle. Melanom forekomst og dens dødelighet er høy i lyshudet bestander i alle deler av verden, inkludert Australia, USA og Storbritannia [3] – [4]. Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall etter lungekreft i verden [3]. For tiden er det ingen effektive behandlinger for både melanom og prostatakreft, og som sådan intens forskning er nødvendig for å skaffe nye legemidler mot kreft for disse kreftformene.
Den høye dødeligheten hos kreftpasienter har ført mange forskere til kilden for potensiell naturlig-produkt basert terapeutiske forbindelsene [2]. Herbal planter og plantebaserte legemidler er blitt brukt som kilde til potensielle kreftlegemidler i tradisjonelle kulturer over hele verden, og blir stadig mer populært i moderne samfunn [5]. De potensielle naturprodukt-avledede anticancermidler er kjent for å ha forskjellige bioaktive forbindelser slik som roscovitine fra rød reddik og flavopiridol fra
Amoora rohituka
, en tropisk tre som har vist store effekter i behandlingen av kreft [6] – [8].
plante av slekten
Phyllanthus
tilhører familien
Vortemelk Hotell og har blitt rapportert å ha farmakologiske effekter som antiviral aktivitet mot hepatitt B og relatert hepatittvirus [9] – [12], anti-bakteriell aktivitet [13], [14], anti-hepatotoxic eller leverbeskyttende aktivitet [15] – [19] samt anti-tumor og anti-kreftfremkallende egenskaper [16 ], [20]. I tillegg har det også vist hypoglykemi egenskaper [21], [22]. Selv om planteslekten
Phyllanthus
har vist seg å være gunstig for menneskers helse, men effekten mot kreft har ikke fullstendig klarlagt.
En av utfordringene i kreftbehandling er at kreft besitter evne til å unngå apoptose (eller program celledød) som fører til sin ineffektivitet som en cellegift for å drepe kreftceller. Den apoptotiske prosess er en viktig celledød mekanisme som respons på cytotoksisk behandling og dens induksjon er en svært ønskelig modus for et anticancermiddel [23]. Cellesyklus er en prosess som fungerer som en nøkkel for å kontrollere vekst og formering av en celle. Forstyrrelser i cellesyklusen prosessen vil føre til en ubalanse mellom celleproliferasjon og celledød (apoptose), deretter fører til kreftutvikling. Således kunne cellesyklus tjene som mål for anticancer-middel for å stanse ukontrollert formering av kreftceller og for å igangsette dem til å gjennomgå apoptose [24]. Den cytotoksiske effekten av
Phyllanthus
ekstrakter (vandig og metanol) på veksthemming mot huden melanom og prostata kreft celler i sin cellesyklus kan delvis forklare deres modus av aktivitet. Målet med denne studien var å fastslå den cytotoksiske effekten av
Phyllanthus
trekker på spredning av hud og prostata kreft celler og også å undersøke forholdet mellom disse antiproliferative effekter med sannsynlig apoptose og cellesyklus modulasjon.
Resultater
cytotoksisk aktivitet i vandige og metanoliske ekstrakter av
Phyllanthus
arter
i denne studien undersøkte vi de cytotoksiske effektene av ubehandlet vandig og metanoliske ekstrakter av fire forskjellige
Phyllanthus
arter,
P.amarus, P.niruri, P, urinaria, etter og
P.watsonii
, på to menneskelige kreft (MeWo og PC-3) samt normale (CCD-1127Sk og RWPE-1) cellelinjer. De cytotoksiske egenskapene til
Phyllanthus
ekstraktene ble bestemt ved bruk av MTS [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl] -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H -tetrazoliuminner salt) reduksjon analysen. Prinsippet bak denne analyse er basert på reduksjon evnen av et oppløselig tetrazoliumsalt, av mitokondriell dehydrogenase enzym av levedyktige celler, til et farget formazanprodukt oppløselig som kan måles spektrofotometrisk. Den halvmaksimalt hemmende konsentrasjon (IC
50) verdien ble bestemt fra den konstruerte dose-responskurve og satt som et parameter for cytotoksisitet.
Tabell 1 viser sammenligningen av IC
50 verdier for både råolje og vandige metanoliske ekstrakter av de fire
Phyllanthus
arter på både human kreft (MeWo og PC-3) og normale (CCD-1127Sk og RWPE-1) cellelinjer. Resultat avslører tilstedeværelsen av cytotoksiske effektene av
Phyllanthus
arter på både hud melanom og prostata kreft celler, hvor de respektive IC
50 verdier av
Phyllanthus
ekstrakter ble bestemt. Til sammenligning fikk anlegget ikke viser noen signifikant cytotoksiske effekter på normale menneskelige celler, mens de vanlige kreftmedisiner (5’Fluorouracil og Doxorubicin) viste sterkere cytotoksisk effekt enn de
Phyllanthus
ekstrakter, men viser giftighet på normal -celler (tabell 1). Blant de fire
Phyllanthus
plantearter,
P.urinaria
viste sterkest cytotoksiske effekt, etterfulgt av
P.watsonii, P.niruri Hotell og
P.amarus
. I tillegg IC
50 Verdiene av metanol ekstrakter av
Phyllanthus
arter var merkbart lavere enn de vandige ekstraktene på begge kreftceller indikerer at metanol ekstrakt er mer cytotoksisk enn vandige ekstrakt.
Identifikasjon av polyfenoler i
Phyllanthus
arter
Metanol og vannløselige ekstrakter hentet fra ulike arter av
Phyllanthus
ble utsatt for analyse ved HPLC (High Performance Liquid Chromatography) koplet med fotodiode array (PDA) og MS-MS deteksjon muliggjør identifikasjon av polyfenol-forbindelser (tabell 2). Tolv hoved forbindelser ble identifisert på grunnlag av deres retensjonstider, UV-spektrum, og overordnede massespektra og sekundære fragmentering mønstre. Forbindelsene oppdaget var gallisk syre, galloylglucopyronside, digalloylglucopyronside, trigalloylglucopyronside, tetragalloylglucopyronoside, corilagen, geraniin, rutin, quercetin glucoside, quercetin diglucoside, quercetin rhamnoside, og caffeolquinic syre.
DNA-fragmentering
en av de biokjemiske kjennetegn i den apoptotiske prosess er dannelsen av nukleært DNA-fragmentering, noe som viser tilstedeværelsen av typiske stige DNA-fragmenter på 180 – 200 basepar og multipler derav på en agarosegel. I motsetning til dette, vil tilfeldig spalting av DNA i nekrotiske celler produserer en diffus flekk ved elektroforese av DNA. Derfor, ble DNA-gelelektroforese metode anvendt for å bestemme den mulige måte celledød forårsaket av
Phyllanthus
ekstrakter. Figur 1A viser tilstedeværelse av DNA-fragmenter fremstilt ved behandling av celler med MeWo
Phyllanthus
ekstrakter og et lignende mønster ble sett med standard stoffet (5’Fluorouracil) som positiv kontroll. Ingen stigen dannelse ble observert i ubehandlede celler. Disse fenomener ble også observert i PC-3 cellelinjen for begge ekstrakter som vist i figur 1B. Dermed tyder dette på at begge ekstrakter av
Phyllanthus
var i stand til å indusere apoptose eller programmert celledød på MeWo og PC-3 celler i respons til den cytotoksiske effekten av
Phyllanthus
.
Lane 1 -4: vandig og Lane 6-9: metanol ekstrakter for
P.amarus, P.niruri, P.urinaria Hotell og
P.watsonii
, i den rekkefølgen. Lane 5 og 10: 1 kb DNA-markør, Lane 11: standard narkotika, hvor A) 5’Fluorouracil for MeWo og B) Doxorubicin for PC-3 celler. Lane. 12: ubehandlede celler
TUNEL analyse og apoptotisk indeks
TUNEL (terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking) analysen er en teknikk for å tillate deteksjon av apoptotiske celler ved å merke den frie enden av apoptotisk DNA med en markør som kan bli visualisert under lysmikroskop. Som vist i figur 2, ble apoptotiske celler observert som brun-farget celler i
Phyllanthus
ekstrakter ble behandlet med MeWo (figur 2A, pilhode) og PC-3 (figur 2B, pilspiss) kreftceller, deres utseende var lik til apoptotiske celler som var til stede i de positive kontroller, apoptotisk-induser anticancer stoff (5’Fluorouracil og Doxorubicin), mens levedyktige celler ble farget blå. Dette ytterligere bekrefter at
Phyllanthus
ekstrakter var i stand til å indusere apoptose på huden melanom og prostata kreft celler. Bestander av celledød kan beregnes og uttrykkes i en matematisk metode, kjent som apoptotisk indeks. Fra figur 2C, celledød prosentandel (apoptotiske indeks) av det behandlede-MeWo og PC-3-celler ble markert øket opp til 50% sammenlignet med kontrollgruppen ved 72 timer etter behandling med
Phyllanthus
ekstrakter. I tillegg har andelen av
Phyllanthus
ekstrakter induserte apoptotiske celler var nær kreft narkotika (5’Fluorouracil og Doxorubicin) med bare 8% forskjell.
TUNEL analyse av MeWo og PC-3 kreftceller etter å ha blitt behandlet med
Phyllanthus
trekker på 100 × forstørrelse. TUNEL-positive (apoptotiske) celler opptrådte som brune fargede celler (rød pil) i
Phyllanthus
ekstrakter behandlet A) MeWo og B) PC-3 celler og normale levedyktige celler beis som blå farge. C) Grafen viser prosentandelen av apoptotisk indeks (%) av ubehandlet og behandlet (
Phyllanthus
ekstrakter og kreft narkotika) MeWo og PC-tre kreftceller fra TUNEL analyse.
Phyllanthus
ekstrakter-indusert caspase-3/7 aktive
En aktivering av caspases (aspartate bestemt cystein protease) er en av de biokjemiske forandringer i løpet av apoptose. Nivåene av caspase-3/7 indusert ved
Phyllanthus
behandling ble markert øket (3-4 folder) sammenlignet med den ubehandlede gruppen (figur 3) for begge ekstrakter av
Phyllanthus
. Nivået av caspase-3/7 av standard legemidler, 5’Fluorouracil og Doxorubicin på MeWO og PC-3-celler, henholdsvis, var 6-folds økning sammenlignet med den for kontrollgruppen og 0,5 ganger høyere enn
Phyllanthus
ekstrakter etter 72 timers behandling. Dette indikerer at apoptose indusert av
Phyllanthus
ekstrakter ble formidlet via kaspaser aktivering.
Grafen viser nivåene av caspase-3 og -7 i behandlede og ubehandlede grupper av MeWo og PC-3 celler . Linjer viser gjennomsnitt ± SE
Phyllanthus
ekstrakter-indusert minimal nekrotisk effekt
Nekrose er en annen form for celledød som vil provosere inflammatorisk respons fra omkringliggende cellene gjennom lekkasje av intracellulære innhold. Som vist i figur 4, er prosentandelen av LDH-nivåer produsert som et resultat av behandling med begge ekstrakter av
Phyllanthus
arter var mindre enn 10% for MeWo celler og mindre enn 15% for PC-3-celler, sammenlignet i tillegg til kontrollgruppene etter 72 timers behandling. Den nekrotiske Virkningen av metanolekstrakter var mer uttalt, hvor det ble observert å være 4% høyere enn det vandige ekstrakt av
Phyllanthus
arter. Dette tyder på at
Phyllanthus
arter besitter minimal nekrotiske effekter og huden melanom var mindre utsatt for å vise nekrotisk effekt enn prostatakreftceller. I motsetning til dette nivå LDH indusert av den positive kontroll (5’Fluorouracil og Doxorubicin) var 25% høyere enn de ubehandlede celler og 18% i variasjon med
Phyllanthus
behandlede celler ved 72 timer etter behandling.
grafen viser prosentandelen av LDH nivåer i
Phyllanthus
-extracts behandlet MeWo og PC-3 kreftcellene var høyere enn den ubehandlede gruppen etter 72 timers behandling. Linjer viser gjennomsnittlig prosent ± SE
Phyllanthus
ekstrakter induserer cellesyklus arrest fulgt av apoptose
For å bestemme den fasen av cellesyklusen som er hemmet av
Phyllanthus
planteekstrakter, ble både MeWo og PC-3 celler behandlet på deres respektive IC
50 verdier for 24, 48, 60 og 72 timer og deretter analysert ved flowcytometri. Kinetikken til cellesyklusen fordeling av behandlede og ubehandlede grupper av MeWo og PC-3-celler er vist i figur 5 og 6, respektivt. Endringer i fordelingen av behandlede celler i ulike faser av cellesyklus opptrådte etter 24 timer etter å ha blitt behandlet med
Phyllanthus
ekstrakter for både kreftcellelinjer.
Prosentandelen av
Phyllanthus
ekstrakter-behandlede celler ved A) Sub-G1, B) Gå /G1, C) S og D) G2 /M faser av MeWo celler på ulike tidsintervaller (24, 48, 60 og 72 timer) behandling . Linjer viser gjennomsnittlig prosent ± SE
Prosentandelen av
Phyllanthus
ekstrakter-behandlede celler på A) Sub-G1, B) Gå /G1, C) S og D) G2 /M faser av PC-3 celler på ulike tidsintervaller (24, 48, 60 og 72 timer) av behandlings Barer viser gjennomsnittlig prosent ± SE
Som vist i figur 5,
Phyllanthus
ekstrakter oppviste vekstarrest i S-fase i MeWo celler fra 24 timer og forble tydelig etter 72 timers behandling, og dette ble fulgt av en akkumulering av celler i under G1 (apoptose-celler) fase for både vandige og metanoliske ekstrakter. Prosentandelen av apoptotiske celler hadde økt i en tidsavhengig måte fra 1,8% ved 24 timer til 6,1% ved 72 timer sammenlignet med kontrollgrupper (Figur 5A). I mellomtiden ble prosentandelen av celler i S-fasen av behandlede celler MeWo forhøyet til 15% over kontrollene etter 72 timers behandling (figur 5C). Videre er prosentandelen av celler ved Go /G1 og G2 /M-fasene ble redusert med tiden etter behandling med
Phyllanthus
ekstrakter på grunn av det faktum at behandlede celler har blitt arrestert i S-fase, og deretter opparbeidet ved Sub-G1 (apoptose) fase (Figur 5B og 5D). Men til styrken av
Phyllanthus
ekstrakter indusere S-fase arrestasjonen var ikke så sterk som standard narkotika (5’Fluorouracil), med en 22,1% forskjell på 72 timer etter behandling.
for PC-3 celler,
Phyllanthus
utstilt vekst arrest på Go /G1 fase på 72 timer etter behandling med en opphopning av apoptotiske celler i under G1 fase for både vandige og metanoliske ekstrakter. Prosentandelen av apoptotiske celler økt fra 3,4% ved 24 timer opp til 7,4% ved 72 timer i løpet av de ubehandlede grupper (figur 6A). Prosentandelen av behandlede PC-3-celler ved Go /G1-fase var 13,7% ved 24 timer, og dette økte til 18,8% ved 72 timer over de ubehandlede gruppene (figur 6B). Imidlertid er prosentandelen av behandlede PC-3-celler ved S og G2 /M-fasene ble redusert med tidspunktet for behandling (figur 6C og 6D) på grunn av det faktum at behandlede PC-3-celler ble arrestert i Go /G1 fase og deretter opparbeidet på Sub-G1 faser. Mens doxorubicin viste en G2 /M fase arrest på PC-3 celler på 24 timer, og holdt seg tydelig etter 72 timers behandling.
Diskusjoner
Man har brukt planter i stor utstrekning for å behandle ulike typer sykdommer siden antikken [7]. Herbal planter og plantebaserte legemidler er blitt mye brukt i tradisjonelle kulturer over hele verden og har vunnet popularitet i det moderne samfunn som naturlige alternativer til å produsere nye potensielle terapeutiske forbindelser for å bekjempe sykdommer [5]. Seksti prosent av dagens tilgjengelige anticancer legemidler stammer fra naturlige produkter og deres derivater (inkludert antibiotika). Dette har ført til økt tillit til naturlige produkter som viktige kilder for utvikling av effektive cytostatika [7].
I denne studien, både vandige og metanol ekstrakter av fire plantearter
Phyllanthus
vises cytotoksiske virkninger på menneskers hud melanom (MeWo) og prostata (PC-3) cellelinjer. Variasjonene i IC
50 verdier av
Phyllanthus
ekstrakter mot melanom og prostata kreft celler kan være på grunn av de ulike nivåene av bioaktive forbindelser som finnes i hver
Phyllanthus
arter som quercetin, gallisk syre, og caffeolquinic syre som har vist seg å ha anticarcinogenic effekter [16], [25] – [27]. I tillegg er de oppnådde data antyder at den metanoliske ekstrakt av
Phyllanthus
syntes å ha mer uttalt cytotoksisk effekt enn vandige ekstrakt, som indikerer metanol-oppløselige bioaktive forbindelser som inneholdes i
Phyllanthus
sannsynligvis er mer potente enn de vandige oppløselige bioaktive forbindelser i å drepe kreftceller. Blant de fire
Phyllanthus
arter som brukes,
P. urinaria
viste den sterkeste cytotoksiske effekt. Dette kan være knyttet til sin eksklusive innholdet i trigalloylglucopyronoside og tetragalloylglucopyronosid. Interessant,
Phyllanthus
ekstrakter ikke føre til vesentlige endringer på cellelevedyktigheten til både normale menneskelig hud (CCD-1127Sk) og prostata (RWPE-1) cellelinjer. Disse funnene korrelerer med studier utført av Huang et al. der
Phyllanthus
planter vises selektiv drapet mot kreftceller [28]. Denne selektive cytotoksiske virkning er et viktig kriterium fordi de for tiden tilgjengelige medikamenter rettet mot normale celler i tillegg, og fører til bivirkninger.
liv og død av en celle blir styrt av cellesyklusen, som er tett regulert av cyclin , cyklin-avhengige kinaser (CDK), CDK-inhibitorer (CDKI) og andre tumorsuppressorgener. Således vil deregulering av cellesyklus fører til unormal proliferasjon av DNA-skadede celler og evasiveness av apoptose [29].
Phyllanthus
ekstrakter forstyrret cellesyklusen MeWo celler ved S-fase, og dermed antyde at de kan ha forstyrret DNA-syntese, stanse utviklingen av cellesyklus i S-fase og fører til apoptose. S-fasen rest med
Phyllanthus
ekstraherer på MeWo celle kan skyldes: (1) inhibering av cdc25-enzymer [16], [30] – [32], eller (2) inhibering av DNA topoisomerase II noe som fører til aktivering av kaspaser [16], [33]. Dermed ble høye nivåer av caspase-3 og -7 aktiviteter oppdages etter 72 timer etter behandling av
Phyllanthus
ekstrakter. Imidlertid, S-fase rest som oppvises av
Phyllanthus
ekstrakter ble ikke så uttalt som 5’Fluorouracil, som er en S-fasefølsom hud anticancer medikament, noe som indikerer at
Phyllanthus
ekstrakter sannsynligvis drepe melanomaceller på andre måter i tillegg til å ødelegge cellesyklusen, slik som endringer i melanom celle signalveier inkludert FAS pathway [34]. Videre undersøkelser vil ta modus av handlingene til
Phyllanthus
trekker på melanomceller.
Phyllanthus
ekstrakter utøves deres vekst arrestert behandlet-PC-3 celler ved å samle cellene på Go /G1-fasen, noe som tyder på at
Phyllanthus
ekstrakter kan påvirke proteinsyntesen av PC-3 celler og dermed stanse sin progresjon fra G1 til S-fasen under cellesyklus og deretter initiere apoptose. Dette kan være på grunn av de hemmende effekter på MDM2-protein, noe som reduserer celleproliferasjon og induserer apoptose ved heving av P21, Bax og pRb nivåer samt reduksjon av hyperfosforylert Rb og E2F1 [35].
Phyllanthus
indusert apoptose i PC-3 celler kan være assosiert med økning av Bax og Fas reseptor /ligand genuttrykk som foreslått av Huang et al. [25]. De forhøyninger av Bax protein er assosiert med involvering av mitokondriell (indre) sti i apoptose som involverer reduksjonen av mitokondriemembranpotensialet, cytokrom C utslipp og deretter fører til aktivering caspaser [36]. Høye nivåer av caspase-3 og -7 aktiviteter ble oppdaget i celler behandlet med
Phyllanthus
ekstrakter. The Go /G1-fasen ble arrestert på PC-3 av
Phyllanthus
ekstrakter kan være knyttet til sitt høye innhold av polyphenol forbindelser. De 12 polyfenoler som er identifisert i
Phyllanthus
, er klassifisert i fire hovedgrupper, nemlig ellagitanninene, gallotannins, flavonoider og fenoliske syrer med ellagitanninene å være den mest tallrike gruppen av sammensatte. Ellagitanninene er også rikelig funnet i granateple og har blitt studert ganske grundig for sine varierte terapeutiske effekter inkludert dets kreft undertrykke egenskaper [37]. Geraniin, den viktigste ellagitannin funnet i alle P
hyllanthus
art, har vist seg å bidra til vekst arrestert på andre krefttyper, inkludert kreft i tykktarmen [38], [39]. Imidlertid standard stoffet for prostatakreft, Doxorubicin, forstyrret veksten av kreftceller ved å arrestere dem i G2 /M fase og til slutt initiering av apoptose ved en rekke forskjellige mekanismer, slik som inhibering av topoisomerase-enzymer som sett i andre studier [40], [ ,,,0],41]
aktivering av kaspase-3 og -7 aktiviteter i behandlede kreftcellene i løpet av apoptose resulterer i:. (1) inaktivering av enzymet poly (ADP-ribose) polymerase eller PARP, og (2) aktivering av caspase aktivert DNase (DAK), deretter forårsaker DNA-fragmentering, noe som er en av egenskapene av apoptose [42], [43]. Således heving av slike caspaser etter
Phyllanthus
behandlinger tillater forekomsten av apoptotiske DNA-fragmenter på agarosegel som ble ytterligere bekreftet ved tilstedeværelse av TUNEL-positive celler. Derfor den cytotoksiske effekten av
Phyllanthus
trekker på menneskelig hud (MeWo) og prostata (PC-3) kreftcellelinjer ble formidlet via en apoptotisk mekanisme med aktivering av caspase-3 og -7, og dette kan være grunn tilstedeværelsen av gallisk syre funnet i
Phyllanthus
ekstrakter. Gallisk syre har tidligere vist seg å indusere apoptose via caspase-3-aktivering [44].
I naturprodukt baserte medisiner og utvikling, nekrose kan forekomme sammen med apoptose. Dette har blitt vist i mange antikreftmidler så som cladribin, cisplatin, doksorubicin og 5’fluorouracil, som utviser både apoptotiske og nekrotiske virkning [45], [46]. LDH er en gruppe av enzymer som er til stede i kroppen og deres unormalt høyt nivå indikerer helseproblemer. I celler, blir LDH i hovedsak produsert av mitokondrier og spiller en viktig rolle i oksydasjon av laktat og samtidig redusere pyruvat [47]. I nekrotisk celledød, er plasmamembranintegritet tapt, og dette fører til lekkasje av cytoplasmiske innhold inn i det ekstracellulære miljø som forårsaker en inflammatorisk reaksjon [23]. Målinger av LDH-enzym som en indikator på nekrose, viste at
Phyllanthus
foruten å ha apoptotisk aktivitet, også har minimal evne til å indusere nekrotisk celledød på både MeWo og PC-3-celler. Til sammen tyder resultatene på at
Phyllanthus
plante besitter dual-evnen til celledød, kanskje på grunn av den rå natur
Phyllanthus
ekstrakter, hvor alle potensielle bioaktive forbindelser er blandet sammen og kan opptre enkeltvis eller i synergisme, og dermed bidra til denne dual-evnen til celledød «effekter.
Disse bioaktive forbindelser antas å ha cytotoksisitet overfor kreftceller gjennom sin evne til å forstyrre cellevekst av kreft og sette i gang de skal gjennomgå apoptotisk celledød. Selv om de detaljerte eller underliggende mekanismene for selektivitet
Phyllanthus
anlegg mot hud og prostata kreft celler er fortsatt uklart, har våre funn viser at
Phyllanthus
plante utøver sin veksthemming mot kreftceller gjennom modulering av cellesyklus og induksjon av apoptose via caspaser aktivering. Ytterligere rens av
Phyllanthus
ekstrakter og undersøkelser av apoptose veien for å avsløre den eksakte virknings av
Phyllanthus
anlegg for sin anti-kreft egenskaper.
Materialer og metoder
planteekstrakter og Standard Drugs
Vandig og metanoliske ekstrakter av fire
Phyllanthus
arter (
P.amarus, P.niruri, P.urinaria, og p .watsonii
) ble gitt av Dr. Indu Bala, Bioteknologisenteret, MARDI. Nyhøstet planteprøvene ble vasket, tørket i romtemperatur og deretter frysetørket. For det vandige ekstrakt, ble tørket planteprøve fuktet med ultrarent vann, mens absolutt metanol ble anvendt for den metanoliske ekstrakt fremstillingen. Prøvene ble deretter homogenisert med ekstraksjonsbuffer, og supernatanten ble samlet opp etter tre runder med utvinning. Doksorubicin og 5’Fluorouracil var de vanlige stoffer som brukes som positive kontroller i denne studien. Begge testet prøver; planteekstrakter og standard legemidler ble lagret ved -20 ° C.
Høy ytelse væskekromatografi kombinert med electronspray ionisering (ESI) og massespektrometri (LC-MS-MS) -analyse
For vann ekstraheres prøvene ble 2 ml av supernatanten ble tørket i en vakuum-konsentrator (Concentrator 5301 eppendorf, Tyskland) og re-oppløst i 20 mg /ml med 30% metanol før den ble utsatt for LC-MS-MS-analyse. For de prøver ekstrahert med metanol, ble samlet supernatant fordampes ved hjelp av rotasjonsfordamper (Rotavapor RII, BUCHI, Sveits) og re-oppløst på nytt med 20% metanol. Prøvene ble deretter separert med fastfase-ekstraksjon (SPE) kolonne (LiChrolut RP-18 1000 mg /ml 6, Merck Tyskland) med mobil fase av 60% metanol og 70% metanol. Alle eluerer ble konsentrert til 0,5 ml, og deretter fortynnet 8 ganger med 40% metanol, før de ble utsatt for LC-MS-MS-analyse.
Prøver ble separert ved hjelp av HPLC-system bestående av en HPLC-binær pumpe, en autosampler injektor kammer og dioderekkedetektor (DAD) (1200 series, Agilent Technologies, Tyskland). Separasjonene ble utført ved anvendelse av en reversfase-C-18, 150 mm x 4,6 mm i.d., 5 um partikkelstørrelse Thermo Hypersil GOLD kolonne (Thermo Scientific, UK). Separasjon ble utviklet ved bruk av en mobil fase av 0,1% maursyre i vann (løsningsmiddel A) og 0,1% maursyre i acetonitril (løsningsmiddel B) med en gradient innstilling av løsningsmiddel B: 5% (5 min), 5-90% (60 min), 5% (4 min) ved en strømningshastighet på 1 ml /min. Injeksjonsvolumet ble innstilt på 20 ul, og påvisning ble begge ved 280 nm og 360 nm. For massespektrometrianalyse, 3200 QTrap LC /MS /MS-system (Appiled Bioscience – MDS Sciex) ble anvendt med den jernkilde og spenningen ble holdt ved 500 ° C og -4,5 kV for negativ ionisering, respektivt. Nitrogengenerator ble satt til å bli operert ved 60 psi gardin gasstrømmen, 90 psi kilde gass-strømmen og 60 psi eksos. To typer skannemodi ble valgt: forbedre massespektrometer (EMS) og forbedre ion produkt (EPI) for en full scan massespektra alt fra
m /z
100-1200
Cell kultur.
Skin melanom MeWo (HTB-65) celle, prostatakreft PC-3 (CRL-1435) celler, normal menneskelig hud CCD-1127Sk (CRL-2565) og prostata RWPE-en (CRL-11609) celle linjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). De fire cellelinjer ble dyrket med ulike medier, EMEM (Eagle minimum essensielt medium) for MeWo celler, RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) for PC-3 celler, og keratinocyte vekstmedium, CC-4455 (Lonza, USA) for RWPE-1-celler og DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium) for CCD-1127Sk celler. Dyrkningsmediet ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, Gibco). Celler ble opprettholdt i fuktet luft med 5% CO
2 ved 37 ° C. Cellene ble høstet ved bruk av 0,25% trypsin (Hyclone) når de når 70-80% konfluens i kulturflasker.
