Abstract
SIRT3 er en viktig NAD
+ – avhengig protein deacetylase i mitokondriene av pattedyrceller, fungerer for å hindre celle aldring og transformasjon via regulering av mitokondrie metabolsk homeostase. Imidlertid er SIRT3 også funnet å uttrykke i noen humane tumorer; dens rolle i disse SIRT3-uttrykkende tumorceller trenger å bli klarlagt. Denne studien viste at ekspresjonen av SIRT3 ble hevet i en gruppe av magekreftceller i forhold til normale gastriske epitelceller. Selv om SIRT3 ekspresjonsnivåer ble øket i mage tumorvev sammenlignet med de tilstøtende ikke-tumorvev, SIRT3 positive cancerceller ble oftere påvist i tarm typen gastriske cancere enn de diffuse typen gastriske cancere, noe som indikerer at SIRT3 er forbundet med undertyper av gastrisk kreft. Overekspresjon av SIRT3 fremmes celleproliferasjon og forbedret ATP generasjon, glukoseopptak, glykogen formasjon, MnSOD aktivitet og laktatproduksjon, som ble inhibert av SIRT3 knockdown, noe som indikerer at SIRT3 spiller en rolle i å omprogrammere bioenergi i gastrisk tumorceller. Videre analyser viste at SIRT3 samhandlet med og deacetylert den laktatdehydrogenase A (LDHA), en viktig protein i å regulere anaerob glykolyse, styrke LDHA aktivitet. I konsistens, ble en klynge av glykolyse-assosierte gener oppregulert i de SIRT3-overuttrykkende gastrisk tumorceller. Derfor, i tillegg til den godt dokumentert SIRT3-mediert mitokondriell homeostase i normale celler, kan SIRT3 forbedre glykolyse og celleproliferasjon i SIRT3-uttrykkende kreftceller
relasjon:. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Forbedrer glykolyse og spredning i SIRT3-Uttrykke Gastric kreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834
Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA
mottatt: 16 april 2015; Godkjent: 13 mai 2015; Publisert: 29 juni 2015
Copyright: © 2015 Cui et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av Natural Science Foundation of China National, Key Program (30930105), National 12-5 Support Plan Prosjekt av departementet for vitenskap and Technology of China (2012BAH30F03), Natural Science Foundation National of China (31070740), den 985 og 211 Prosjekter av Xi’an Jiaotong University (JKL), og National Cancer Institute RO1 tilskuddet CA152313-01-A1 (JJL).
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sirtuins, en familie av NAD
+ – avhengig histone deacetylases (HDACs) i pattedyr -celler, er implisert i en rekke fysiske prosesser, inkludert celleoverlevelse, apoptose, metabolisme, stressreaksjoner, aldring og lang levetid [1,2]. Blant syv Sirtuin elementer (SIRT1-7), er SIRT3 best karakteriserte mitokondrie Sirtuin, fungerer for å regulere mitokondrielle proteiner involvert i oksidativ fosforylering, fettsyre oksidasjon, urea syklus, og antioksidanten responsen [2-9]. Flere studier har fremhevet rolle SIRT3 i metabolisme og homeostase i normale celler og åpenbarte nye mål og substrater for SIRT3 avhengig deacetyleringen [10]. Kim et al rapporterte at SIRT3 er en nøkkel mitochondria protein, og mangel på SIRT3 uttrykk er knyttet til økt mitokondrie DNA-skade og aldring, samt økt potensial til Ras-indusert celletransformasjon og SIRT3-mediert MnSOD aktivering bidrar til den mitokondrielle homeostase [11,12]. Som støtte, humane embryoniske nyre 293-celler (HEK293 celler) oppviser en forbedret SIRT3 uttrykk i henhold til oksidativt stress, som fører til deacetylering og aktivering av MnSOD [13]. SIRT3 antas å fungere som en tumor suppressor gen og spiller en nøkkelrolle i å forbedre celle homeostase mot aldring og kreftutvikling.
Men noen kreftceller vises uttrykk for SIRT3 og potensielle rolle SIRT3 i disse kreftceller , spesielt dens potensial forhold til aggressiv fenotype, har vært kontroversielt [14]. SIRT3 uttrykk er lavere eller ikke påvises i et utvalg av humane kreftformer, inkludert brystkreft, glioblastom, tykktarmskreft, og osteosarkom, prostata og eggstokk-kreft [11,15,16]. SIRT3 induserer vekst og apoptose ved selektiv stanse av Bcl-2 i HCT116 cellene gjennom moduler JNK2 signalveien [17]. Dessuten er SIRT3 rapportert å bidra til økt sensitivitet av humane leukemiceller kjemoterapi eventuelt gjennom induksjon av mitokondriene-mediert apoptose [18]. På den annen side, SIRT3 uttrykket er også funnet økes i munnhulen, lymfeknute positiv brystkreft, kreft i spiserøret, og skjoldbruskkjertelen karsinomer; og den økte SIRT3 er assosiert med høyere malign fenotype og nedregulering av SIRT3 øker tumor følsomhet overfor anti-kreft-behandling [19-23]. Disse resultatene varsle en annen rolle SIRT3 i bestemte svulster som må belyses.
Kreftceller er metabolsk aktiv og forbruker mer cellular drivstoff enn normale celler. Men kreftceller relé på hovedsakelig på ATP syntese av aerob glykolyse, en funksjon som kalles Warburg effekten [24]. En slik aerob glykolyse antas å beskytte kreftceller danner oksidativt stress siden mitokondriell respirasjon er den viktigste kilden til intracellulær ROS [25]. Den laktatdehydrogenase A (LDHA) er et enzym kontrollere interomdannelse mellom pyruvat og L-laktat reversibelt ved det endelige trinnet av anaerob glykolyse [26]. Hemming av LDHA reduserer karsinogent potensial med økt mitokondrieoksygenforbruk og redusert mitokondriemembranpotensiale [26] og generell mobilnettet ATP produksjon og glykolyse [27].
I denne studien undersøkte vi potensielle rolle SIRT3 i mage kreftceller som uttrykker SIRT3. Uttrykk for SIRT3 ble knyttet til aggressiv vekst, som ble formidlet via SIRT3-deacetylert og aktivert LDHA, styrke glykolyse og uttrykk for en gruppe av glykolyse knyttet gener. Dermed SIRT3-LDHA-mediert glykolyse stoffskifte kan være en potensiell terapeutisk mål å behandle kreftceller som uttrykker SIRT3.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
Menneskelig magekreft cellelinjer MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] og AGS [29] og udødeliggjort human gastrisk epitelcellelinje GES-1 [30] ble opprettholdt i RPMI-1640-medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin og dyrket ved 37 ° C under en atmosfære av 5% CO2.
Immunutfelling og western blot
Subkonfluente celler ble lysert, og lysatene ble inkubert med protein A /G agarose perler pluss den anbefalte mengden av antistoffer mot enten SIRT3 (Cell Signaling Technology) eller LDHA (i Santa Cruze) ved 4 ° C over natten. Prøvene ble sentrifugert og separert ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og elektroblottet på nitrocellulosemembraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk i TBST, ble membranene inkubert med primært antistoff ved 4 ° C over natten etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff i 1 time ved RT. Proteiner av interesse ble visualisert ved ECL deteksjon kit (Thermo Fisher).
Immunohistochemistry analysen
Patologisk lysbilder av magekreft med tilstøtende normalt vev ble analysert ved immunhistokjemi analyse ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Den Polymer Detection kit for immunhistokjemi analyse ble kjøpt fra Zhongshan Golden Bridge bioteknologi. Kort sagt ble avvokset parafinsnitt og re-hydratisert i etanol (100%, 90% og 75%). Snittene ble inkubert med 3% H
2o
2 ved RT i 10 minutter, og deretter blokkert med ikke-immun geiteserum ved romtemperatur i 15 minutter. Snittene ble deretter inkubert med primært antistoff til SIRT3 (Cell Signaling Technology) i 2 timer ved RT, etterfulgt av anti-kanin-sekundært antistoff inkubasjon i 15 minutter ved RT. Snittene ble deretter inkubert med DAB deteksjonsreagensen i 2 minutter hver, motfarget med hematoksylin og dehydraded i etanol (90% og 100%). Seksjonene ble montert og farging ble analysert under mikroskopi.
Plasmid konstruksjon og celle transfeksjonsteknologier
SIRT3 hel lengde cDNA ble syntetisert ved hjelp av RT-PCR med total RNA ekstrahert fra GES-1 celler som templat (primere: 5 «CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3» og 5 «CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3»). CDNA ble så klonet inn i pcDNA3.1 + ekspresjonsvektor (Invitrogen). Den pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmid rettet mot human SIRT3 (5 «CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3») og styre shRNA plasmid ble oppnådd fra GenePharma. For å generere stabile transfektanter ble AGS og SGC-7901 celler transfektert hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) og stabile transfektanter ble valgt av 400ug /ml G418 (Gibco).
Cell spredning og clonogenicity assay
proliferasjonsanalyse, ble cellene sådd ut i en 6-brønn plate med 2 x 10
4 celler /brønn. Celleproliferasjon ble beregnet på dagene 2, 4, 6 og 8 etter plating. For clonogenicity analysen ble cellene sådd ut i en 6-brønns plate med varierte celle tall og dyrket i 14 dager og kolonier ble deretter farget med krystallfiolett, og antallet kolonier (mer enn 50 celler /koloni) ble tellet å følge etablerte metoder [31].
Måling av glukose, laktat og glykogen
fenolrødt-fritt medium ble brukt til å dyrke celler i 6-brønners plate i 24 timer, og nivåer av glukoseopptak og laktat generasjon ble målt ved bruk av Glukose Assay Kit og melkesyre Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). De relative verdier ble normalisert til celletallet for hver brønn. Cellular glykogennivåene ble påvist ved hjelp av Glykogen Assay Kit (Biovision). I korthet, en x 10
6-celler ble homogenisert i 200 ul vann på is, og homogenater ble kokt i 5 minutter for å inaktivere enzymene og sentrifugert ved 13000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for å fjerne uoppløselig materiale. Den glykogen produksjon ble målt med OD-verdien ved 570 nm.
Måling av ATP produksjon
Cellular ATP og ROS-nivåene ble målt som beskrevet tidligere [32]. Celler dyrket i en 6-brønns plate etter forskjellige behandlinger, ble lysert og cellulære ATP-nivåer ble målt med ATP Bioluminesens Assay Kit (Sigma). For å måle glykolyse-mediert ATP produksjon ble cellene behandlet med 2 mikrometer rotenon i 24 timer før målingene.
Måling av ROS generasjon
Cellular ROS generasjon ble analysert med 5- (og 6-) karboksy-2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) metode med bruk av mikro spektrometer (Thermo Fisher) ved 488 nm /530 nm bølgelengde.
MnSOD aktivitet
Celler dyrket i en seks-brønns plate ble lysert og MnSOD aktivitet ble bestemt av WST-8 metoder bruker MnSOD analysesett (Beyotime) etter produsentens anvisninger.
tumorigenitet analyser i hårløse mus
SGC7901 celler (7,5 x 10
6) med SIRT3 overekspresjon eller knockdown ble suspendert i 0,1 ml PBS og inokulert i hver flanke av 5 uker gamle BALB /c atymiske nakne mus, og etter 28
th dag etter inokulasjon når den maksimale tumorvolum (~ 1500 mm
3) oppnådd i kontrollgruppen, ble forsøkene ble avsluttet og alle av tumorer fra hver gruppe ble skåret ut og veiet. Den eksperimentelle prosedyre som involverer dyreforsøk ble utført i henhold til de institusjonens retningslinjer; Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) på Xian Jiao Tong University spesielt godkjent denne studien (protokoll # 120181).
Laktat dehydrogenase analysen
laktat dehydrogenase aktivitet ble bestemt etter den etablerte protokoll ved å måle reduksjonen satsen i absorbans ved bølgelengde 340 nm som følge av oksydasjonen av NADH [27]. I korthet ble cellene dyrket i 10 cm skåler og homogenisert i PBS på is. Homogenatene ble lagt inn i buffer inneholdende 6,6 mM NADH, 30 mM natriumpyruvat og 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 og blandet. Inkuber blandingen i 5 minutter for å oppnå temperaturstabilisering og deretter registrere nedgang frekvensen av absorbans ved 340 nm.
SIRT3
in vitro
deacetylering analysen
Menneske SIRT3 rekombinant enzym ( BPS) ble inkubert med L-laktat dehydrogenase fra bovint hjerte (Sigma) i reaksjonsbuffer (50 mM NaCl, 4 mM MgCl
2, 10 mM NAD
+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) med /uten SIRT3 inhibitor nikotinamid (NAM, 10 mm) ved 37 ° C i 1,5 timer, og deretter reaksjonene ble brukt for LDHA aktivitetsanalyse beskrevet som ovenfor.
real-time PCR
totalt RNA ble isolert ved anvendelse av TRIZOL-reagens (Invitrogen), etterfulgt av behandling med fenol /kloroform og utfelling med 2-propanol. Totalt RNA pelleten ble deretter vasket med 75% etanol og resuspendert i vann. RNA ble utsatt for revers transkripsjon med PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) og kvantitativ real-time PCR-analyse av gener av interesse ble utført med SYBR PremixExTaq II kit (Takara) etter produsentens anvisninger. Data ble normalisert til nivået av γ-tubulin.
Immunofluorescence
AGS-celler sådd på dekkglass i en 6-brønns plate ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og blokkert i 1% BSA i 1 time ved RT. Inkuber cellene med primære antistoffer mot SIRT3 og LDHA ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubasjon med fluorescens-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved RT. Kontra ble gjennomført med DAPI hjelp immunfluorescens kit (Beyotime). Celler ble montert og avbildes med laser scanning confocal mikroskop.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SE fra minst tre uavhengige forsøk. Statistisk analyse ble utført med uparet tosidige Student t test med mindre annet er angitt.
P
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
SIRT3 uttrykk i magekreftceller
SIRT3 er godt definert i regulering mitokondrie homeostase i anti-aldring og anti-transformasjon. Nylig er forskjellige resultater rapportert angående til SIRT3-mediert celle-hemming og proliferasjon, som fører til kontrovers av dens rolle i kreft [19,20]. For å finne ut hvilken rolle SIRT3 i magekreft, uttrykk for SIRT3 ble påvist i 4 mage kreft cellelinjer AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 og en gruppe av magekreft tumorvev. Vi fant ut at SIRT3 proteinnivåene ble forhøyet i alle 4 magekreft cellelinjer i forhold til de udødeliggjort mage epiteliale GES-1 celler (AGS, 1,9 ganger; SGC-7901, 1,5 ganger; MGC-803, 2,0-fold, og HGC -27, 1,8 ganger sammenlignet med GES-1-celler) (figur 1A). I henhold ble mRNA-nivåer av SIRT3 i disse cellelinjene også økes (AGS, 2,6 ganger, SGC-7901, 1,7-fold, MGC-803, 2,5 ganger, HGC-27, 2,2-ganger) sammenlignet med GES- 1 celler (figur 1B).
A, SIRT3 proteinnivåer ble bestemt ved western blot i 4 magecancercellelinjer og en immortalisert normal gastrisk epitel cellelinje GES-1 (øvre panel). SIRT3 protein uttrykk testet i tre separate vestlige blotter ble beregnet ved å måle bandet intensiteten ved hjelp av Image-Pro Plus programvare og normalisert med β-aktin (nedre panel). B, SIRT3 mRNA-nivåer ble påvist ved QRT-PCR i 4 gastrisk cancer-cellelinjer. Data ble normalisert til udødelig normale mage epitelceller. I (A, B), blir data presentert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3; *
p
0,05, **,
p
0,01). C, SIRT3 ekspresjon i humane mage tumorvev (n = 29) og tilstøtende ikke-tumorvev (n = 14) ble detektert ved immunohistokjemi farging. SIRT3 uttrykk nivåer ble estimert ved tetthet skanning ved hjelp av Image-Pro Plus programvare og gradert som negativ, svakt positiv og sterk positiv. Scale bar, 50 mikrometer. D, SIRT3 ekspresjon i tumor og tilstøtende ikke-tumorvev ble presentert som prosent av pasientprøver. E, SIRT3 uttrykk i tarm (n = 18) og diffuse (n = 11) typer mage tumorvev ble presentert som prosent av pasientprøver.
Immunohistochemistry analyse i svulsten og tilstøtende ikke-tumor normal vev fra en gruppe av magekreftpasienter viste at SIRT3-positive celler ble oftere påvises i tumorvev enn det som i normale vev. Resultatene viste at 55,1% av tumorcellene (7% av normale vev) oppviste høyt nivå (sterk positiv), 41,4% av tumorvev (28% av de normale vev) viste middels høyt nivå (svak positiv), mens 3,5% av tumor vev og 64% av normalt vev var negativ i SIRT3 uttrykk (fig 1C og 1D, S1A fig). Interessant, SIRT3 ekspresjon i tarmtypen tumorvev (15 tilfeller; 93,3% sterk positiv og 6,6% svak positiv) var betydelig høyere enn den i diffus type tumorvev (14 tilfeller; 14,3% sterk positiv, 78,6% svak positiv og 7.1 % negative) (fig 1C og 1E, S1B fig). Disse resultatene tyder på at SIRT3 uttrykk er økt i enkelte svulster sammenlignet med beslektede normalt vev og SIRT3 uttrykk kan være variere i enkelte svulster, som må undersøkes nærmere.
SIRT3 nivåer er knyttet til celleproliferasjon
Deretter etablerte vi SIRT3 overekspresjon og knockdown cellelinjer ved hjelp av AGS og SGC-7901 celler. Ekspresjonen av SIRT3 i stabile transfektanter ble bekreftet ved western blot. Overekspresjon av SIRT3 økt cellevekst, mens SIRT3 knockdown hemmet cellevekst av både mage kreft cellelinjer (figur 2A). Videre overekspresjon av SIRT3 utløst mer kolonidannelse enn kontroll transfekterte celler som var i kontrast med bare færre kolonier dannet i SIRT3 knockdown-celler (fig 2B).
a, cellevekst av AGS og SGC-7901 celler med SIRT3 overekspresjon eller knockdown ble beregnet på dag 2, 4, 6 og 8 etter celle plating. SIRT3 uttrykk i stabile transfektanter ble bekreftet av western blot. B, clonogenicity av AGS og SGC-7901 celler med SIRT3 overekspresjon eller knockdown ble målt og presentert som brøkdel av kontroll transfektanter (NC eller SCR). C, Overuttrykte SIRT3 fremmet tumorbyrde in vivo. SGC-7901 celler med SIRT3 overekspresjon (venstre panel) eller knockdown (høyre panel) ble subkutant injisert i høyre flanke av den hårløse mus med de relative kontrollcellene (NC eller SCR) inn på venstrekanten. Xenografttumorer ble skåret ut og veiet etter 28
th dag etter inokulering celle. Bilder fra panel til høyre viste xenograft tumorer in vivo ved slutten av forsøket. Bilder av opp til høyre viste dissekerte svulster fra hver gruppe. Områdene og hjelp av tumor vekter i hver gruppe ble presentert i panelet til høyre som gjennomsnitt ± S.E. (N = 5; *
p
0,05, **,
p
0,01). SIRT3, SIRT3 overekspresjon; shSIRT3, SIRT3 knockdown; NC (negativ kontroll, tom pcDNA3.1) og Scr (rykke shRNA; pGPH1 /GFP /Neo-shRNA) fungerer som kontroller for pcDNA3.1-SIRT3 og pGPH1 /GFP /henholdsvis Neo-shSIRT3
for å kunne fastslå hvilken rolle SIRT3 i tumordannelse evne, injisert vi SIRT3 overekspresjon og knockdown SGC-7901 celler i flankene av nakne mus og tumorvekst ble tillatt i 28 dager etter celle inokulasjon (S2 fig). Den gjennomsnittlige vekten av svulstene som stammer fra SIRT3 overekspresjon celler var 0.7079g, betydelig større enn den gjennomsnittlige tumorvekten av kontroll (NC),
p
= 0,015, (Fig 2C, venstre panel). I motsetning til dette, den gjennomsnittlige vekten av tumorer avledet fra SIRT3 knockdown-celler var 0.0588g, betydelig mindre enn den fra krypterings shRNA kontrollceller (SCR) (0.2033g;
p
= 0,009) (figur 2C, høyre panel) . Den gjennomsnittlig volum av tumorer avledet fra SIRT3 overekspresjon celler ble økt enn det fra kontrollceller (NC) (figur 2C, venstre panel opp i høyre hjørne). Tvert imot, det gjennomsnittlige volum av tumorer som vokser fra SIRT3 knockdown-celler var dramatisk liten i forhold til den fra kontrollceller (SCR) (figur 2C, panel rett opp høyre hjørne).
Forbedret glykolyse i SIRT3 uttrykke magekreft celler
Vi ble deretter lurer på hvordan mobil bioenergi kan bli endret i SIRT3-overekspresjon mage kreftceller. SIRT3 overekspresjon dramatisk økt glukoseopptak (1,4 ganger i AGS og 1,9 ganger i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown redusert glukoseopptak (rundt 40% i begge AGS og SGC-7901) (figur 3A og 3B). I samsvar med mønsteret av glukose bruk, hadde SIRT3 overekspresjon celler økte nivåer av laktat sekresjon (1,2 ganger hos AGS og 1,3 ganger i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown cellene hadde redusert nivå av laktat sekresjon (55% i AGS og 45 % i SGC-7901) (figur 3C og 3D). Vi fant også at glykogendannelsen ble betydelig økt med SIRT3 overekspresjon (1,5 ganger i AGS og 1,3 ganger i SGC-7901), en funksjon av rask vekst av tumorceller [33], mens redusert med SIRT3 knockdown (40% i AGS og 70% i SGC-7901) (figur 3E og 3F).
glukoseopptaket, laktatproduksjon og glykogendannelse ble målt i AGS (A, C, E) og SGC-7901 (B, D, F ) celler med SIRT3 overekspresjon eller knockdown. Alle data presenteres som gjennomsnittet ± S.E. (N = 3; *
p
0,05, **,
p
0,01).
SIRT3 har vist seg involvert i deacetylering av globale metabolismeenzymer og vedlikehold av basale ATP nivåer i celler både i normal tilstand og ved sykdommer [1,2]. Total cellulær ATP og glykolyse ATP generasjon ble påvist i AGS og SGC-7901 celler med enten SIRT3 overekspresjon eller SIRT3 knockdown. Den totale cellulære ATP-nivåene ble øket i SIRT3 overekspresjon celler (ca. 1,3 ganger i begge cellelinjer), men ble redusert i SIRT3 knockdown-celler (omkring 75% i begge cellelinjer) i forhold til NC eller Scr kontrollceller (figur 4A og 4B) . Da vi behandlet celler med rotenon for å hemme oksidativ fosforylering, og testet ATP generasjon fra glykolyse. Som vist i figur 4C og 4D, SIRT3 overekspresjon førte til en økning i glykolysen ATP produksjon (1,4-fold i AGS og 1,6 ganger i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown førte til en betydelig reduksjon i glykolysen ATP produksjon (20% i AGS og 40% i SGC-7901) sammenlignet med NC eller Scr kontroll.
A og B, kan de totale cellulære ATP-nivåer ble testet i AGS (A) og SGC-7901 (B) celler med overekspresjon eller SIRT3 slå ned. C og D, AGS (C) og SGC-7901 (D) celler med SIRT3 overekspresjon eller knockdown ble behandlet med rotenon (2 uM, 24 timer) for å hemme oksidativ fosforylering og deretter cytoplasma ATP-nivåer ble målt. Data ble normalisert ved kontroll (NC eller SCR) celler og presentert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3; *
p
0,05, **,
p
0,01)
SIRT3 regulerer homeostase av ROS i mage. kreftceller
en mengde bevis støtter at økt ROS-nivå er en viktig egenskap i kreftceller, som gjør kreftceller mer følsomme for ytterligere ROS-spenning [34]. Her fant vi at overekspresjon av SIRT3 redusert ROS-nivåer til 70% og 80% i AGS og SGC-7901 celler, mens hemming av SIRT3 uttrykk økt ROS-nivåer (1,4 ganger i AGS celler og 1,6 ganger i SGC-7901 celler) henholdsvis (fig 5A og 5B). Etter avtale med litteraturen viser SIRT3 deacetylates og aktiverer MnSOD (11, 12), i magekreftceller, ble MnSOD aktivitet forsterket av SIRT3 overekspresjon (1,4 ganger hos AGS celler og 1,2 ganger hos SGC-7901 celler), men reduseres med SIRT3 knockdown (50% i AGS celler og 65% i SGC-7901-celler) (figur 5C og 5D), noe som tyder på at SIRT3 kan beskytte celler fra oksidativt stress-indusert skade av rebalansering intracellulær ROS gjennom økt MnSOD aktivitet i magekreftceller.
A og B, cellulære ROS-nivåer i AGS (A) og SGC-7901 (B) celler som SIRT3 overekspresjon og knockdown ble påvist ved anvendelse av DCFH2 fargemetode og representert som relativ nivå normalisert med kontroll (NC eller SCR). C og D, MnSOD-aktivitet ble målt i celler som er nevnt i (A og B) og representert som relativ aktivitet normalisert med kontroll (NC eller SCR). Alle data presenteres som gjennomsnittet ± S.E. (N = 3; *
p
0,05, **,
p
0,01).
SIRT3 deacetylates og aktiverer LDHA
LDHA spiller en nøkkelrolle i startfasen, vedlikehold og progresjon. Inhibering av LDHA aktivitet blokker tumorgenisitet og tumorprogresjon [26,27] og LDHA aktivitet kan reguleres ved acetylering /deacetylering modifisering [35]. Vi lurer på om SIRT3 er involvert i reguleringen av LDHA aktivitet. Vi har funnet at, i magekreftceller, ble LDHA aktivitet signifikant økt i SIRT3 overekspresjon celler, mens redusert i SIRT3 knockdown-celler sammenlignet med NC eller Scr kontrollceller separat uten detekterbar endring i LDHA proteinnivået i stabile transfektanter (figur 6A). Farging Resultatene viste at LDHA og SIRT3 var samlokalisert i cytoplasma (figur 6B), og co-IP-analyse med enten LDHA eller SIRT3 antistoff avdekket at SIRT3 er i stand til å samhandle med LDHA (Fig 6C). I tillegg ble nivået av LDHA acetylering redusert i SIRT3 overekspresjon-celler, men økte i SIRT3 knockdown celler (figur 6D). Videre,
in vitro
LDHA aktivitetsanalyse utført ved bruk av kommersielt human rekombinant SIRT3 og bovin hjerte L-laktat dehydrogenase viste at LDHA aktiviteten ble økt med tilstedeværelse av SIRT3 i reaksjonen, som ble reversert ved tilsetning av inhibitor SIRT3 , nikotinamid (fig 6E). For å identifisere potensielle SIRT3 deacetylering nettsted (e) på LDHA, vi søkte database og funnet ut at K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 og K318 er potensielle acetylering områder av LDHA, og tidligere studie rapporterte at K5 acetylering /deacetylering var implisert i reguleringen av LDHA aktivitet [35]. Da gjorde vi LDHA aktivitetsanalyse ved hjelp av lysin 5 og lysin 318 acetylering ligne (K5Q /K318Q) eller deacetylering etterligner (K5R /K318R) mutant LDHA, og fant at verken K5 eller K318 var nødvendig for SIRT3-mediert LDHA aktivering (S3 fig). Ytterligere identifikasjon av SIRT3-mediert LDHA deacetylering er i nød.
A, LDHA aktivitet ble målt i AGS og SGC-7901 celler med SIRT3 overekspresjon eller knockdown og representert som relativ aktivitet normalisert ved kontroll (NC eller Scr). LDHA uttrykk i SIRT3 overekspresjon og knockdown AGS celler ble analysert ved immunoblotting. B, samlokalisering av SIRT3 og LDHA ble oppdaget av farging i AGS celler med anti-SIRT3 (grønn) og anti-LDHA (rød) antistoffer. Kjerner ble conterstained med DAPI (blå). Scale bar, fem mikrometer. C, LDHA ble immunopresipitert (IP), etterfulgt av western blot (WB) av LDHA eller SIRT3, eller omvendt, i AGS magekreftceller. IP med ikke-immun geit IgG tjener som en negativ kontroll, og immunoblotting av totale cellelysater (input) tjener som IP lik belastning kontroll. D, SIRT3 forbedret deacetylering av LDHA i AGS celler ble oppdaget av IP med anti-LDHA fulgt av western blot med anti-LDHA og anti-acetyl-lysin antistoffer. Western blot av totale cellelysater med SIRT3 antistoff for å vise ekspresjon av transfekterte protein. E, LDHA enzymatisk aktivitet ble målt ved hjelp av kommersiell storfe hjerte L-Lactic dehydrogenase og rekombinant humant SIRT3 enzym med /uten SIRT3 inhibitor nikotinamid. F, LDHA enzymatisk aktivitet ble målt ved hjelp av kommersiell rekombinant humant SIRT3 enzym og immunopresipitert LDHA fra AGS celler transfektert med K5Q /R eller K318Q /R mutant LDHA med /uten SIRT3 inhibitor nikotinamid og presentert som relativ enzymaktivitet normalisert ved villtype LDHA uten SIRT3 inhibitor . I A, E og F, blir data presentert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 5; *
p
0,05, **,
p
0,01).
SIRT3 oppregulerer gener involvert i cellenes stoffskifte
for å karakterisere molekylære signatur av SIRT3-LDHA medierte bioenergi i mage kreftceller, målte vi uttrykket av gener assosiert med glukose transport og glykolyse. Dataene i figur 7A og 7B viste at overekspresjon av SIRT3 i AGS eller SGC-7901 indusert uttrykk for HK2 (1,47 ganger hos AGS celler, 1,3 ganger i SGC-7901 celler), MCT4 (2,3 ganger i AGS celler, 1,34 fold i SGC-7901 celler) og Glut1 (1,55 ganger hos AGS celler, 1,38 ganger i SGC-7901 celler) på mRNA nivå testet av real-time PCR. Tvert imot, redusert SIRT3 knockdown ekspresjonen av genet HK2 til 76%, MCT4 til 73% og Glut1 til 62% i AGS-celler, mens HK2 til 80%, MCT4 til 62% og Glut1 til 74% i SGC-7901-celler. I tillegg, når SIRT3 ble overuttrykt, ble MCT1 mRNA-nivå økes i AGS-celler ved 1,6 ganger, men ikke i SGC-7901-celler, og da SIRT3 ble knockdown, ble MCT1 redusert til 59% i AGS og 65% i SGC-7901-celler henholdsvis.
Relative mRNA-nivåer av Glut1, HK2, MCT1 og MCT4 ble målt ved QRT-PCR i AGS (A) og SGC-7901 (B) celler med SIRT3 overekspresjon eller knockdown. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3; *
p
0,05, **,
p
0,01). (C) Skjematisk presentasjon av potensialet mekanismen som SIRT3 utløser cellevekst. SIRT3 deacetylates og aktiverer LDHA forårsaker økt LDHA aktivitet og cellulære bioenergi, som sammen med SIRT3-mediert MnSOD aktivering forbedrer celleproliferasjon.
Diskusjoner
Denne studien gir bevis som indikerer at SIRT3 uttrykt i enkelte kreftceller, for eksempel magekreftceller, kan være knyttet til økt aggressivitet ved SIRT3-mediert bioenergi via deacetylering og aktivering av LADH. Selv akkumulere bevisene indikerer at SIRT3 spiller en sentral rolle i beskyttelse av normale celler mot aldring og ondartet transformasjon, dens funksjon i allerede transformerte celler slik som kreftceller som uttrykker SIRT3 trenger å bli undersøkt [19]. Mangel på SIRT3 i MEFs fører til genomisk ustabilitet og en høy frekvens av celletransformasjon mediert av Ras med en økt forekomst av tumordannelse og aldring, noe som tyder på at SIRT3 er nødvendig i forebygging av cellulær aldring og kreftutvikling [11,15]. I tillegg er manglende eller lavere ekspresjon av SIRT3 detektert i flere humane kreftformer og SIRT3 nivå er assosiert med sensitiviteten av kreftceller til kjemo- og stråleterapi [11,15,16]. Men SIRT3 vises også bli overuttrykt i kreft hos mennesker og i forbindelse med behandling motstand [19,21,36]. Disse resultatene antyder at SIRT3 kan være rettet mot forskjellige proteiner mellom normale celler og kreftceller, og som SIRT3 ekspresjon kan varieres på ulike typer av kreft, slik som de nåværende resultatene indikerer at tarmtypen magekreft uttrykker et høyere nivå av SIRT3 enn den diffuse
