Abstract
Naturlige produkter har blitt kilder til utvikling av nye legemidler for behandling av kreft. Å søke kandidat forbindelser som hemmer veksten av leverkreft, komponenter av
Chloranthus serratus
ble testet. Her rapporterer vi at shizukaol D, en dimer sesquiterpene fra
Chloranthus serratus
, hatt en veksthemming effekt på leveren kreftceller i en dose- og tidsavhengig måte. Vi viste at shizukaol D indusert celler til å gjennomgå apoptose. Enda viktigere, shizukaol D dempet Wnt signalering og redusert ekspresjon av endogene wnt målgener, noe som resulterte i redusert ekspresjon av β-catenin. Samlet denne studien viste at shizukaol D hemmet veksten av leveren kreftceller ved å modulere Wnt veien
Citation. Tang L, Zhu H, Yang X, Xie F, Peng J, Jiang D, et al. (2016) Shizukaol D, et dimert sesquiterpene Isolert fra
Chloranthus serratus
, undertrykker vekst av humane lever kreftceller ved Moduler Wnt Signale Pathway. PLoS ONE 11 (3): e0152012. doi: 10,1371 /journal.pone.0152012
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 19 desember 2015; Godkjent: 21 februar 2016; Publisert: 24 mars 2016
Copyright: © 2016 Tang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. (. no 81301855) Dette arbeidet ble støttet av National Key Sci-Tech spesielt prosjekt of China (2013ZX10002010) og Natural Science Foundation National Kina . Finansiører av denne studien hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Leverkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Hos pasienter med leverkreft, kirurgiske behandlinger tilbyr en høy grad av komplett respons og gir et potensial for kur [2]. Imidlertid kan svulst resectability være begrenset av tumorutbredelse, plassering og underliggende leverdysfunksjon ved sene stadier av sykdommen; som sådan, er reseksjon bare mulig i et mindretall av pasientene [3]. Til dags dato, hos pasienter med avansert leverkreft (HCC), bare sorafenib har vist seg å øke samlede tallene for overlevelse effektivt [4]. Selv i USA, har forekomsten av leverkreft tredoblet, mens 5-års overlevelse har ligget under 12% [5]. Dermed blir alternative strategier for å behandle denne aggressive krefttype presserende behov.
I de senere årene har et økende antall etterforskere har blitt interessert i screening naturlige produkter for potensielle kreftlegemidler, inkludert kinesiske medisinske urter (CMH) .
Chloranthus serratus
, som tilhører familien
chloranthaceae
, er en flerårig urt som hovedsakelig fordelt over hele det nordlige Kina, Korea og Japan. På grunn av sitt rykte i å tilrettelegge blodsirkulasjonen og spre blod stasis, har en rekke forbindelser blitt isolert fra
Chloranthus serratus
, inkludert treo-1- (1-metoksy-2-hydroksypropyl) -2-metoksy-4 , 5-metylendioksybenzen og erytro-1- (1-metoksy-2-hydroksypropyl) -2-metoksy-4,5-metylendioksybenzen [6], serralabdanes A-E [7] og serratustones A -B [8]. Lindenane-type sesquiterpenoidene er anerkjent som den karakteristiske taksonomiske symbol på
chloranthaceae
familien. Mange av disse sesquiterpenoidene utviser gunstige antiinflammatoriske bioaktivitet. For eksempel chloramultilide B besitter hemmende aktiviteter mot
Candida albicans Hotell og
Candida parapsilosis
med MIC verdier lik 0,068 mikromol /L [9]. I tillegg til å vurdere sine anti-inflammatorisk virkning, har flere studier fokusert på aktiviteter sesquiterpenoidene på kreftceller. Den dimere sesquiterpenoid cycloshizukaol A har vist seg å markant inhiberer ICAM-1-ekspresjon i HL-60-celler på en doseavhengig måte, [10], og antrocin, en sesquiterpene lakton, induserer celledød ved apoptose av humane blære- kreft 5637 cellelinjer via begge ytre og indre signalveier [11]. Den veksthemmende virkninger av xanthorrhizol, en sesquiterpenoid fra rotstokk på
Curcuma xanthorrhiza
, mot humane tarmkreft HCT116-celler, er relatert til cellesyklus-stans og induksjon av apoptose [12].
Shizukaols er en rekke typiske sesquiterpenoid dimer derivater. Shizukaol A ble først isolert fra
Chloranthus japonicus
i 1990 [13]. Shizukaol D (som vist på figur 1) er blitt isolert fra
Chloranthus serratus product: [14]. Tidligere studier på den biologiske av shizukaol D er svært begrenset, og har først og fremst fokusert på sin anti-inflammatorisk aktivitet [15]. Det har også vist seg å hemme AMPK-avhengig lipidinnholdet i hepatiske celler [16], og for å øke glukoseforbruk i L6-celler [17].
I denne studien ble forskjellige isolasjoner fra
Chloranthus serratus
ble testet for sine virkninger på kreftceller. Fra disse isoleringer ble shizukaol D funnet å indusere veksthemming og dempe Vingeløse-Int (Wnt) pathway signalisering i leveren kreftceller.
Materialer og metoder
Kjemi og plasmider
Shizukaol D (fig 1) ble isolert fra
Chloranthus serratus
ifølge en tidligere publisert metode [14] av Bio Bli Ltd.com. Etter dette, ble forbindelsen fremstilt som en 100 mmol /L lager i dimetylsulfoksyd (DMSO) og lagret ved 4 ° C. Den primære antistoffer som ble brukt i western blotting inkludert antistoffer for PARP (Cell Signal), LRP (Cell Signal), p-LRP (Cell Signal), Dvl2 (Cell Signal), Axin2 (Cell Signal), β-catenin (BD) , GSK-3β (Cell Signalling), p-GSK-3β (Cell Signalling), β-actin (Sigma) og GAPDH (Abmart). En villtype β-catenin plasmid (wt-β-catenin) ble fremstilt ved å sette inn et gen som koder for β-catenin inn i en pcDNA3.0 plasmid, mens en mutant β-catenin plasmid (mut-β-catenin) ble fremstilt ved å sette inn en genet som koder for β-catenin med mutasjoner ved S33A, S37A og T41A inn pcDNA3.0.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Den menneskelige kreftcellelinjer SMMC-7721, SK-HEP1 og HepG2, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Andre cellelinjer, inkludert Focus, HEK-293T, L Wnt-3A og QGY-7703, ble kjøpt fra Institute of Cell Library of China. SMMC-7721, Focus, og HepG2 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM, Invitogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibico), og SK-HEP1 og QGY-7703 celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Invitogen) supplert med 10% FBS. L Wnt-3Awas dyrket i DMEM med G418 for å gi wnt3a kondisjonert medium. Alle cellene ble dyrket ved 37 ° Cin en fuktet inkubator med 5% CO
2.
CCK-8 analysen
Cell svar på shizukaol D ble vurdert ved hjelp av 2- (2 -metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium mononatriumsalt i en modifisert CCK-8 cellulær proliferasjon analysesett (Roche Diagnostics, Indiana). Celler ble platet i 96-brønners plater og deretter utsatt for en rekke shizukaol D-konsentrasjoner i kortere eller lengre tid. Dyrkningsmediet ble fjernet før tilsetning av 90 ul av frisk medium (uten FBS) og 10 ul celletelling leder-8-løsning til hver brønn. Platene ble inkubert i ytterligere 2 timer ved 37 ° C, hvoretter absorbansen ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser (modell 550, Bio-Rad, CA). Den prosentvise inhibering i forhold til en ubehandlet kontroll er illustrert. Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger uavhengig av hverandre.
Evaluering av sub-G1-celler
Fokus-celler ble sådd i 6-brønns plater og inkubert i DMEM med 0, 12,50, 25,00 eller 50,00 umol /L av Shizukaol D i 48 timer. DMEM med 1,00% DMSO ble anvendt som en kontroll. Cellene ble fiksert og farget i fosfat-bufret saltvann (PBS, 140 mmol /l NaCl, 2,7 mmol /L KCI, 10 mmol /l Na
2HPO
4 og 1,8 mmol /l KH
2PO
4, PH = 7,4) som inneholder 50 mikrogram /ml propidiumjodid og 0,03% Triton X-100 før de blir analysert av flowcytometri (FCM, FAC Star Plus, Mod-Fit LT V2.0, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ ).
kolonidannelse assay
celler ble behandlet med 3,13, 6,25, 12,50 eller 25,00 umol /L Shizukaol D i 48 timer før de ble sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 500 celler per brønn og dyrket i normale medier for 7-10 dager inntil kolonier ble dannet som inneholdt mer enn 50 celler. En løsning av 0,1% DMSO ble satt som en kontroll. Etter fiksering med 4% polymethanol i 10 minutter ble kolonier farget med 1,0% krystallfiolett i 30 min.
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i cellelyseringsbuffer (Cell Signaling). Etter sentrifugering ble supernatanter høstet, og totalt protein ble underlagt 10% SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran (GE). Membranen ble blokkert med 5% skummet melk i 1 time, inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer, og deretter inkubert med sekundære antistoffer. Antistoffbinding ble påvist ved hjelp av forbedret chemiluminescence (GE). Membranen ble farget med Ponceau S (Sigma) og undersøkt med β-aktin eller GAPDH antistoff for å bekrefte tilsvarende lasting og protein overføring.
immunfluorescens farging
Celler i kultur ble fiksert i 4% paraformaldehyde i 10 minutter. Etter dette ble cellene behandlet med 0,2% Triton X-100 i PBS i 20 minutter. Cellene ble så inkubert over natten ved 4 ° C med antistoffer som er spesifikke for p-catenin (BD) og vasket med PBS tre ganger før inkubert i 2 timer ved romtemperatur med sekundære antistoffer. Etter vask med PBS, ble dekk (som inneholdt celler) så montert i DAPI holdig montering media (Beyotime, CN) og avbildes på en Zeiss konfokalmikroskop.
Luciferase reporter analysen
HEK -293T ble cellene dyrket i medium inneholdende 20 mmol /L av LiCl før transfektert med wnt signale reportere TOPflash eller FOPflash som tidligere beskrevet [18]. Etter dette ble cellene behandlet med 6,25 eller 12,50 umol /L shizukaol D i 24 timer. Renilla plasmid ble inkludert i alle relaterte trans. Dataene er representert som normaliserte topp /FOP Flash verdier.
Kvantitativ sann timePCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) og DNA ble fjernet av DNase (Promega) . Revers transkripsjon ble utført ved hjelp SuperscriptII revers transkriptase (Takara). Kvantitativ real-time PCR (QPCR) ble utført ved anvendelse av SYBR grønn I farging (Takara) på et iCycleri QTM-system (Bio-Rad) ifølge produsentens protokoller. Genuttrykk nivåer ble normalisert til den interne GAPDH nivåer. Betingelsene var som følger: a. 38 sykluser av tre-trinns PCR (95 ° C i 40 s, 60 ° C i 50s, og 72 ° C i 30 s) etter initiell denaturering (95 ° C i 5 minutter)
statistikker
data~~POS=TRUNC som gjennomsnitt ± standardavvik var minst tre sett av uavhengige forsøk. T-test-analyse ble brukt for å bestemme betydningen av statistiske forskjeller. Forskjeller ble beregnet ved SPSS og ansett signifikant ved P . 0,05
Resultater
Vekst hemming av humane leverkreft celler ved shizukaol D
Denne studien ble igangsatt for å teste cytotoksisitet av naturlige produkter isolert fra
Chloranthus serratus
i ulike typer kreftceller. Shizukaol D (figur 1) var den mest effektive forbindelse blant de som har blitt rapportert. Væskefase-kromatografi-analyse (S1 figur), MHz assay (S2 figur) og HPLC (S3 figur) bekreftet strukturen av shizukaol D og dens renhet. En CCK-8-analysen ble senere brukt til å kontrollere veksthemming effekten av shizukaol D på leveren kreftceller, inkludert Focus, HepG2, QGY-7703, SMMC-7721 og SK-HEP1 cellelinjer, ved forskjellige konsentrasjoner (0-200 mikromol /L). Cellene viste forskjellig følsomhet overfor shizukaol D (tabell 1). Som en positiv kontroll, IC
50 av doksorubicin (Dox) på Fokus-celler ble målt til å være 0.23μmol /L, og IC
50 av 5-FU (5-fluoruracil), som var en vanlig brukt agent for ondartede fordøyelseskanalen svulster [19], ble målt til å være mer enn 20 mikromol /L.
på grunn av deres relative høyere følsomhet for shizukaol D, Fokus celler og SMMC-7721 ble brukt i følgende eksperimenter. Vi har oppdaget at de veksthemmende virkninger av shizukaol D med økende konsentrasjoner. Spredning av begge cellene ble i stor grad påvirket av behandling av shizukaol D ved lave konsentrasjoner, og denne effekten var mer opplagt etter doseøkning (Fig 2A). Veksten av Focus celler med shizukaol D behandling også redusert i en tidsavhengig måte. Den celleproliferasjon viste en gradvis reduksjon i løpet av en periode på 96 timer etter behandling med shizukaol D med konsentrasjoner på 12,50 umol /l og 25,00 umol /l, med DMSO som en negativ kontroll (figur 2C). Den samme trenden ble også observert i SMMC-7721 celler (figur 2D). Med den økte konsentrasjonen av shizukaol D, Fokus celler ble runde, fløt og selv døde i lyse felt (figur 2E). Videre kolonidannelse analysen indikerte at kolonidannelse i SMMC-7721 celler ble redusert med eksponering for økende konsentrasjoner av shizukaol D (Fig 2F og 2G). Kolonier av SMMC-7721 celle var knapt synlig når konsentrasjonen av shizukaol D nådde 12,50 umol /l, noe som antydet en svekket evne til proliferasjon av celler med shizukaol D behandling (Fig 2F og 2G). Interessant, effekten av shizukaol D på SMMC-7721-celler var mer enn det av 5-FU (5-fluoruracil), særlig når konsentrasjonen av større enn 6,25 ^ mol /l ble anvendt (figur 2B). Oppsummert disse resultatene indikerte at shizukaol D hemmet veksten av leverkreftceller.
(A-D). Cellene ble frø i en 96-brønners plate og behandlet med en serie konsentrasjon av shizukaol D. Celleproliferasjon ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse. (A) Levedyktigheten av Focusand SMMC-7721cells ble redusert når cellene ble behandlet med økende konsentrasjon av shizukaol D i 48 timer. (B) Levedyktigheten ble redusert hurtigere når de ble behandlet med shizukaol D enn behandlet med samme konsentrasjon av 5-FU i SMMC- 7721-celler i 48 timer. Den celleviabilitet redusert i fokus (C) og SMMC-7721 (D) celler behandlet med shizukaol D i en dose- og tidsavhengig måte. (E) Den transparente versjonen av Focus celler behandlet med 0,00, 12,50, 25,00 og 50,00 mikromol /l shizukaol D i 48 timer. (F) kolonidannelse analyse av SMMC-7721-celler. Cellene ble behandlet med 0,00, 3,13, 6,25, 12,50 og 25,00 umol /L av shizukaol D i 48 timer og celler for hver konsentrasjon ble oppsamlet henholdsvis, og sådd ut i 6-brønns plater som 500 /brønn. Cellene ble dyrket i vanlig medium for 10 til 15 d da. (G) Statistisk av kloningseffektiviteten i figur 2F. **: P 0,01. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD
Shizukaol D indusert apoptose i leverkreftceller
Bright-feltet bilder av celler viste at shizukaol D induserte økt celledød med konsentrasjons gradienter, noe som fikk oss at shizukaol D vil kunne føre til celle-apoptose. Vi testet flere apoptose markører i leveren kreftceller som ble behandlet med shizukaol D ved konsentrasjoner på 0-50 mikromol /L shizukaol D. Resultatene indikerte at sub-G1 forholdet mellom Focus celler som ble inkubert med shizukaol D økte fra 7,49 ± 0,59 til 21,38 ± 1,80 (figur 3A). Sub-G1 er et toppparti før G1 topp i FCM, som innebærer dannelse av apoptotiske legeme. Western blotting bekreftet at spaltet PARP ble observert når konsentrasjonen av shizukaol D oppnådd og over 12.50μmol /liter, mens mengden av pro-PARP redusert (figur 3B). Dermed ble veksten hemmende funksjon shizukaol D formidlet via indusere apoptose.
(A) Statistikken på sub-G1 forholdet mellom Focus til FCM. Celler ble inkubert med shizukaol D i 48 timer før den ble samlet opp og fortynnet i PBS med 50 ug /ml PI og 0,03% TritonX-100. **: P 0,01. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. (B) Western blot analyse av ekspresjonen av PARP. Fokus celler ble behandlet med shizukaol D for 48 hbefore oppsamlet og deretter det totale protein ble utsatt for 10% SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembranen. β-actin antistoff ble brukt til å bekrefte tilsvarende belastning.
Shizukaol D dempes Wnt veien
For å utforske mekanismen bak den apoptose, flere signalveier ble vurdert ved hjelp av luciferase reporter analyser. Oppmuntrende, β-catenin /Tcf4 rapportøraktivitet, som ble målt med rapportørgener husing Tcf4-bindingsseter, i stor grad redusert i respons til shizukaol D-behandling (fig 4A). I 20-40% av HCC pasienter, viser β-catenin sitt atom akkumulering og potensial oppregulert aktivitet [20]. β-catenin er et av kjennetegnene på Wnt /β-catenin sti aktivering og den mest likefrem metode for inhibering av Wnt veien er å målrette β-catenin av siRNA [21]. Interessant, i vår studie, viste western blot analyse β-catenin nivåer ble redusert i en dose- og tidsavhengig måte i både Focus (figur 4B) og SMMC-7721 (fig 4C) celler. Denne reduksjon i proteinnivåer ble ytterligere bekreftet ved immunofluorescens (figur 4D). Videre har vi oppdaget flere viktige formidlere av Wnt signalveien og fant konsekvent nedregulering av Dishevelled 2 (Dvl2) og Axin2 (Fig 4E). I tillegg fosforyleringen av ko-reseptor LRP6 viste en reduksjon i proteinnivåer. Men GSK-3β, en negativ regulator som bidrar til p-catenin degradering, ikke endret. Til slutt undersøkte vi Wnt signal pathway målgener ved real-time PCR (QRT-PCR). C-myc, Cyclin D, Tcf-en, LEF1, wnt3a og FGF18 ble betydelig undertrykt av shizukaol D, selv på tidligere tidspunkt (Fig 4F), bekrefter hindret β-catenin aktivitet. Til sammen resultatene ovenfor viste shizukaol D begrenser celleoverlevelse gjennom undertrykke Wnt /β-catenin pathway aktivitet.
(A) Shizukaol D redusert TOPflash aktivitet og svekket TOPflash aktivitet i HEK-293T celler dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 50 mmol /L av LiCl. Renilla plasmid ble inkludert i alle transfeksjoner som kontroll. (BC) Western blot analyse av ekspresjonen av β-catenin ekspresjon i fokus (B) og SMMC-7721 (C) celler behandlet med shizukaol D. (D) Immunofluorescensanalyse av β-catenin i leverkreftceller med 10μmol /L shizukaol D behandling i 24 timer. Red: farging for aktive β-catenin blå: nukleær farging av DAPI. Øvre: Fokus celler; lavere: SMMC-7721 celler. (E) Western blot analyse av ekspresjonen av endogene wnt målgener. SMMC-7721 celler ble behandlet med 20μmol /L shizukaol D i 24 timer før collectedand GAPDH ble satt som kontroll. (F) mRNA uttrykk nivå av endogene Wnt målgener, c-myc, cyclin D, Tcf-en, LEF1, wnt3a og FGF18, ved QPCR. Total RNA fra SMMC-7721-celler ble isolert etter behandling av 20μmol /L shizukaol D til 6 eller 12 timer, og deretter ble transcripted omvendt til cDNA. GAPDH ble angitt som kontroll. **: P 0,01. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD
Wnt veien aktivering kompensert for leverkreft celleviabilitet
Det er mange måter å aktivere Wnt veien, for eksempel legge wnt3a protein til cellekultur media eller øke ekspresjonen av β-catenin. Levedyktigheten til SMMC-7721 celler opp igjen når de ble dyrket med wnt3a kondisjonerte media, uavhengig av om de ble samtidig blir inkubert med 6,25 eller 12,50 mikromol /L av shizukaol D, selv om cellen levedyktighet ikke nå nivået av kontroll ( figur 5A). En alternativ fremgangsmåte for aktivering av Wnt reaksjonsveien er via transfeksjon med plasmid som uttrykker β-catenin. Etter inkubasjon i 12,5 umol /L av shizukaol D i 48 timer, levedyktigheten av SMMC-7721-celler som hadde blitt transfektert med plasmider som uttrykker enten wt-β-catenin eller mut-β-catenin økte signifikant sammenlignet med celler transfektert med tom bære (plasmid pcDNA3.0). Western blot viste wt-β-catenin eller mut-β-catenin transfeksjon produsert økte β-catenin proteiner enn kontroll i SMMC-7721-celler (figur 5B). Videre er de celler som ble transfektert med den mut-β-catenin plasmid oppviste noe høyere levedyktighet enn de som er transfektert med vill-type β-catenin. Disse resultatene tyder på at Wnt bane aktivering kompenserer for levedyktigheten av leverkreftceller som ble behandlet ved shizukaol D.
Actviation av Wnt pathway reddet inhiberende virkning av shizukaol D på leverkreftceller. (A) Et cellelevedyktighet SMMC-7721-celler behandlet med shizukaol D øker når inkubert med wnt3a kondisjonert medium. (B) Et cellelevedyktighet SMMC-7721-celler behandlet med shizukaol D øker når transfektert med vill-type β-catenin eller mut-β-catenin. Ekspresjonen av β-catenin protein av tilsvarende prøve ble analysert ved hjelp av western blot og illustrert nedenfor. β-aktin monoklonalt antistoff ble brukt til å bekrefte tilsvarende belastning.
Diskusjoner
Naturlige produkter ofte blir kilder til nye legemidler [22]. Fra 1940-tallet til i dag, totalt 85, eller 48,6% av de terapeutiske midler som har blitt godkjent av FDA og lignende organisasjoner for behandling av kreft var enten naturlige produkter eller derivater av naturprodukter [23]. Her viste vi at shizukaol D, en dimer sesquiterpene isolert fra
Chloranthus serratus
, indusert veksthemming i leveren kreftceller. Bare en enkelt tidligere rapport har diskutert cytotoksisiteten av shizukaol D, i hvilken cytotoksisitet av ekstrakter isolert fra
Chloranthus japonicus
ble evaluert, og IC
50 verdi av shizukaol D mot SMMC-7721 ble funnet å være 13,71 ± 1,68 umol /L [24]. I denne studien ble IC
50 Verdien av shizukaol D mot SMMC-7721 funnet å være 8,82 ± 1.66μmol /L, som var nær til resultatene av den forrige rapporten og beviste påliteligheten av våre metoder.
Videre testet vi en serie av leverkreftceller og funnet at veksthemming som induseres av shizukaol D var både doseavhengig og tidsavhengig (figur 2). Flere leverkreft cellelinjer viste høyere følsomhet for denne forbindelsen, spesielt Fokus celler. Den inhiberende virkning av shizukaol D på leverkreftceller var i overensstemmelse med resultatene av kolonidannelse effektivitet (figur 2F og 2G) sikret vekstinhibering som ble forårsaket av shizukaol D ble signifikant sammenlignet med den forårsaket av 5-FU, spesielt når konsentrasjonen oversteg 6,25 umol /L (figur 2B). 5-FU er et pyrimidin analog som har blitt brukt til å behandle kreftpasienter; det har blitt administrert systemisk for behandling av anal, bryst, hud, øsofagus, mage, bukspyttkjertel og kolorektal kreft. Selv om den cytotoksisitet som induseres av shizukaol D var ikke er robust ved 24 timer etter behandling, er det likevel overskredet som induseres av 5-FU, og derfor optimering av shizukaol D kan tjene som et lovende retning for å utvikle nye anti-tumormidler.
for å avdekke mekanismen bak den observerte veksthemming, ble en luciferase reporter system brukes til å vurdere variasjon i ulike cellesignalveier som er involvert i celledeling. Resultatene indikerte at shizukaol D dempes Wnt pathway signalering (figur 4A) på en måte som ligner på XAV939, som har blitt vist å være en potent inhibitor av Wnt /β-catenin signalering [25]. Wnt veien er en nøkkel utviklingsmessig bane som også er involvert i patogenesen av mange typer av kreft [26], og den presenterer en potensiell målrettet vei for terapeutisk intervensjon hos pasienter med HCC [27]. Neste generasjon sekvensering (NGS) har avdekket at Wnt signalveien er en nøkkel onkogen driver i HCC pasienter [28]. Wnt signalveien er også involvert i apoptose i cytopatiske celler. In vivo hemmer IFN-α2b behandling Wnt /β-catenin /TCF reaksjonsvei og fremmer programmert celledød [29]. To Wnt signalveien komponenter, AXIN2 og FRA1, ble funnet å vise redusert uttrykk under nedsatt stel celle apoptose [30]. I vår studie shizukaol D øket den forholdet mellom sub-G1-celler, som er produkter av apoptose (figur 3A), samt mengden av det 89kD spaltet PARP (figur 3B), som er et substrat for apoptose-relaterte protease kaspase 3 [31]. Uttrykkene av Wnt veien målgener, for eksempel C-myc, cyclin D, Tcf-en, LEF1, wnt3a, FGF18, ble betydelig undertrykt av shizukaol D (Fig 4E). Disse data antydet at celledød og apoptose i leverkreftceller behandlet med shizukaol D var assosiert med dempning av Wnt veien.
Videre western blotting avslørte at ekspresjonen av β-catenin i leverkreftceller ble redusert i begge en tids- og doseavhengig måte (figur 4B og 4C) sikret β-catenin protein, som kodes for av den CTNNB1 genet, spiller en viktig rolle i kanonisk Wnt pathway signalering. I fravær av Wnt signalering, blir cytosolprotein β-catenin målrettet og brytes ned av en multi-proteinkompleks som inkluderer axin1, APC, GSK3b og CK1 [32]. Aktivering av Wnt signalkaskade forstyrrer β-catenin degradering kompleks, deretter β-catenin proteiner akkumuleres i cytoplasma og translocate inn i kjernen. Kjernefysiske β-catenin virker som en transkripsjonsfaktor aktivenedstrøms målgener, for eksempel c-myc, cyclin D1 [33, 34] og suvivin [35]. En reduksjon i β-catenin uttrykk ledsaget leveren kreft celle vekst hemming som ble indusert av shizukaol D behandling, noe som innebar at veksthemming skyldes modulering av Wnt veien.
For å avgjøre om aktivering av Wnt veien før å shizukaol D behandling reddet de observerte effektene, ble to ulike metoder benyttet i denne studien for å aktivere veien: leveren kreft celler ble dyrket i wnt3a kondisjonerte media eller ble alternativt transfektert med plasmider som koder β-catenin. I begge tilfeller øker cellenes levedyktighet etter behandling med shizukaol D (figur 5A og 5B). Celleviabilitet etter transfeksjon med wt-β-catenin ble noe redusert sammenlignet med transfeksjon med mut-β-catenin, som kan være fordi S33A, S37A og T41A er gsk3 regulatoriske kassetter [36] og er sårbare for shizukaol D. Men Wnt veien aktivering ikke oppveie effekten av shizukaol D i leveren kreftceller fullt og derfor ekstra mekanismer for veksthemming kan ta effekter på samme tid. Returen av levedyktighet i leverkreftceller som ble behandlet med shizukaol D etter aktivering av Wnt signalering bekreftet at Wnt veien er et potensielt mål for shizukaol D og undertrykkelse av Wnt bane av forbindelsen fører til reduksjon av proliferasjon og overlevelse av leverkreft celle linjer.
Naturlige forbindelser har vist seg å være nyttig både enkeltvis og i kombinasjon med vanlige behandlinger for å forebygge tumorprogresjon og behandle menneske maligniteter [37]. Basert på våre funn, shizukaol D, en dimer sesquiterpene isolert fra
Chloranthus serratus
, kan tjene som en potensiell kandidat for behandling av leverkreft, selv om identifikasjon av sin direkte målet krever videre undersøkelser.
Konklusjoner
i sammendrag, våre data viste at shizukaol D utøves en hemmende virkning på veksten av leverkreftceller i en dose- og tidsavhengig måte som var delvis som et resultat av dens modulering av Wnt signalveien.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Massen spectrometryof shizukaol D.
doi: 10,1371 /journal.pone.0152012.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. 1H NMR-spektra av shizukaol D.
doi: 10,1371 /journal.pone.0152012.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. HPLC av shizukaol D.
doi: 10,1371 /journal.pone.0152012.s003 plakater (TIF)
Takk
Dette arbeidet ble støttet av National Key Sci-Tech Spesial Prosjekt of China (2013ZX10002010) og Natural Science Foundation National of China (nr. 81301855). Finansiører av denne studien hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
