Abstract
Anvendelse av doksorubicin (Dox) for behandling av kreft er begrenset på grunn av den alvorlige bivirkninger. Vi brukte kombinasjon strategi ved å kombinere doxorubicin (Dox) med withaferin A (WFA) for å minimere de negative effektene av Dox. Behandling av forskjellige ovarialcancer cellelinjer (A2780, A2780 /CP70 og CaOV3) med kombinasjonen av WFA og Dox (WFA /DOX) viste en tids- og doseavhengig synergistisk effekt på inhibering av celleproliferasjon og induksjon av celledød, og dermed redusere dosen kravet om Dox. Kombinasjonsbehandling resulterte i en betydelig forbedring av ROS-produksjon resulterer i enorme DNA-skade, induksjon av autophagy analysert ved transmisjonselektronmikroskop, og økning i ekspresjon av autophagy markør LC3B, og kulminerte i celledød analysert ved spaltede caspase 3. Vi validert kombinasjonsbehandling på tumor vekst ved hjelp av en in vitro 3Dimension (3D) tumormodell og mer klassisk
in vivo
xenograft modell av eggstokkreft. Begge tumormodellene viste en 70 til 80% reduksjon i tumorvekst i forhold til kontroll eller dyr behandlet med WFA eller Dox alene. Immunhistokjemisk analyse av tumor vev fra dyr behandlet med WFA /Dox kombinasjon viste en signifikant reduksjon i celleformering og dannelse av mikrokar ledsaget av økning i LC3B nivå, spaltes caspase 3, og DNA-skade. Tatt sammen, våre data tyder på at kombinere WFA med Dox reduserer dosen kravet om Dox derfor minimaliseres og /eliminerer de alvorlige bivirkninger som er forbundet med høye doser av DOX, noe som tyder på anvendelsen av denne kombinasjonen strategi for behandling av eggstokkreft og andre kreftformer med ingen eller minimale bivirkninger
Citation. Fong MY, Jin S, Rane M, Singh RK, Gupta R, Kakar SS (2012) Withaferin En synergizes den terapeutiske effekten av Doxorubicin gjennom ROS-mediert Autophagy i Eggstokkreft . PLoS ONE syv (7): e42265. doi: 10,1371 /journal.pone.0042265
Redaktør: Yunli Zhou, Harvard Medical School, USA
mottatt: May 22, 2012; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 30.07.2012
Copyright: © Fong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding kom fra National Institutes of Health /National Cancer Institute CA124630. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Raj K Singh er ansatt i Vivo Biosciences Inc. Det er ingen patenter, produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige malignitet av kvinnelige skjede [1]. Grunnet mangel på symptomer på et tidlig stadium av sykdommen, er det fem-års overlevelse bare 27,2% [1]. Mainline behandling av eggstokkreft er cytoreduserende kirurgi etterfulgt av platina-basert kjemoterapi [2]. Til å begynne med reagerer eggstokkreft positivt i 70 til 80% av tilfellene [3]. Men innenfor 18 til 24 måneder etter første behandling, tumor tilbakefall, som (for ca 70% av pasientene) er knyttet til Kreftsvulster har blitt platinum-resistent [3] Denne dårlig overlevelse for kvinner med platina-resistente eggstokkene karsinomer poeng til et presserende behov for en alternativ behandlingsstrategi.
Doksorubicin (Dox) er et bredspektret anthracylin isolert fra
Streptomyces peucetius
som har vært brukt til behandling av flere kreftformer, blant annet eggstokkene, bryst, prostata og [4]. Faktisk anthracylins er de mest brukte FDA-godkjente antikreft-medikament [5]. Dox effektivitet har blitt tilskrevet dets evne til å intercalate mellom DNA-trådene for å virke som en topoisomerase II-inhibitor og /eller bindes kovalent til proteiner involvert i DNA-replikasjon og transkripsjon [5]. Bruken av Dox er begrenset av alvorlige doseavhengige bivirkninger inkludert akutt kvalme og oppkast, stomatitt, nevrologiske forstyrrelser, myokardial toksisitet, alopesi, og beinmargsaplasi [5]. Alternativt er pegylert liposomal doxorubicin (PLD) (Doxil) regnes som en av de standard behandling i tilbakevendende eggstokkreft (ROC) [6]. Til tross for relativt lavere bivirkninger, har Doxil svært lav svarprosent ( 20%) [6]
Mer nylig kombinasjonsbehandling med Dox har fått mer oppmerksomhet.. Ved å kombinere Dox med sildenafil resulterte i en forbedret celledød gjennom nedregulering av Bcl-2 er koplet til økt kaspase 3 til og med forbedring av Dox-indusert produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) mens dempende Dox-indusert hjertedysfunksjon [7]. Dox har også vært kombinert med HO-3867, et syntetisk curcumin analog, for å oppnå økt celledød og nedsatt myokardial toksisitet ved bruk av lavere doser av Dox [8]. Derfor har kombinasjonsterapi vist seg å være en nyttig metode for å redusere bivirkninger forbundet med Dox samtidig beholde sin terapeutiske funksjon.
Withaferin A (WFA) er bioaktive, celle gjennomtrengelig steroide lakton ha withanolide skjelett som sin grunnleggende struktur. WFA er isolert fra anlegget
Withania somniferia
, som har vært en del av indisk ayurvedisk medisin i århundrer og er nå tilgjengelig som en over-the-counter kosttilskudd i USA Det har blitt brukt til å behandle en rekke av tilstander på grunn av sin anti-inflammatoriske og anti-bakterielle egenskaper. Mer nylig er det blitt foreslått som en potensiell anti-kreft-forbindelse som det har blitt vist å hemme tumorvekst, angiogenese, metastase og [9], [10]. Flere biologiske funksjoner har blitt påvirket av WFA inkludert induksjon av apoptose gjennom inaktivering av Akt og NF-kB [11] samt reduksjon av pro-overlevelse protein Bcl-2 [12], [13], induksjon av Par-4 [14 ], hemming av HSP90 og Notch-1 [15], G2 /M cellesyklus-stans [16], FOXO3a og Bim regulering [9], generering av ROS [17], [18] og nedregulering av ekspresjon av HPV E6 og E7 oncoproteiner [19].
en tidligere studie har vist at WFA forsterker den cytotoksiske effekten av Dox i et osteogent sarkom (U2OS) og brystkreftcellelinje (MCF-7) under anvendelse av en celle proliferasjonsanalyse [20] . Imidlertid har den kombinerte effekten av Dox og WFA ikke blitt studert i eggstokkreft, en virkningsmekanisme bestemmes, eller kombinasjonsbehandling testet
in vivo
for undertrykkelse av tumorvekst. Vi foreslo at WFA når den kombineres med Dox vil fremkalle en synergistisk effekt på den suppresjon av ovarial tumor vekst. For å teste vår hypotese, studerte vi den kombinerte effekten av Dox og WFA på cisplatin-sensitive ovarie epitelial cancer cellelinje A2780, cisplatin-resistente ovarie epitelial cellelinje A2780 /CP70, og p53 mutert ovarie epitelcellelinje CAOV3. For første gang viste vi at celledød indusert ved ROS produksjon og DNA-skade, som fører til induksjon av autophagy og kulminerte i celledød i kaspase 3 avhengig måte. Vi viste også at effekten av Dox og WFA
in vitro
bruke 3D svulster generert fra A2780 celler på en human ekstracellulære matrise. Videre undersøkte vi effekten av kombinasjonsbehandlingen
in vivo
på tumorvekst, proliferasjon, angiogenese, autophagy, celledød, og DNA-skade ved hjelp av xenografttumorer produsert ved injisering av A2780-celler i nakne mus.
Materialer og metoder
Etisk erklæringen
Dyr arbeidet rapportert i manuskriptet ble utført etter godkjenning av protokollen ved University of Louisville Animal Care bruk Committee (IACUC).
Cell kultur
Menneskelig epitelovarialcancer tumor cisplatin-sensitive (A2780) cellelinje ble oppnådd som en gave fra Dr. Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA). Cellelinjen ble opprinnelig generert fra human ovarian cancer pasient før behandlingen [21]. Den cisplatin-resistente (A2780 /CP70) cellelinjen ble oppnådd som en gave fra Dr. Christopher States (University of Louisville, Louisville, KY). Denne cellelinjen var avledet fra A2780 cellelinje etter behandling med cisplatin, [22]. CAOV3 cellelinjen ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). A2780 og A2780 /CP70-celler ble dyrket i RPMI medium inneholdende 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin og 0,05% (v /v) insulin (Sigma). CAOV3-celler ble dyrket i DMEM medium inneholdende 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Antistoffer mot fosfor-BAD Ser
136, BCL-XL, kløyvde caspase 3, og GAPDH ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Ki67 antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, CD31 og LC3B fra Abcam. Doxorubicin, withaferin A, N-acetyl-L-cystein, superoksid dismutase, katalase, og DMSO ble kjøpt fra Sigma.
Cell Proliferation (MTT) Analyser
A2780, A2780 /CP70, og CAOV3 celler som vokser i vekstfasen ble trypsinert og utsådd i 96-brønners plater. Etter 24 timer med plating ble cellene behandlet i tre paralleller med forskjellige doser av Dox og WFA både alene eller i kombinasjon WFA /Dox for 24, 48 og 72 timer. Etter å ha bestemt tid, ble 20 ul MTT reagens fra celleproliferasjonsanalyse kit (Promega) tilsatt til hver brønn og inkubert i omtrent 1 time. Fargeutvikling ble bestemt ved en ELISA-avleser ved 492 nm, som beskrevet tidligere [23]. Dox ble oppløst i vann og WFA ble solubilisert i DMSO. DMSO (0,1% v /v) ble anvendt som en bærerkontroll.
isobologram Analyse
A2780 og A2780 /CP70-celler ble behandlet i tre paralleller i 48 timer ved bruk av 7 konsentrasjoner av Dox og WFA begge alene eller i kombinasjon av WFA /Dox ved et konstant forhold, som beskrevet ovenfor. Levedyktige celler ble kvantifisert ved MTT-analyser som beskrevet ovenfor, og fraksjonen påvirkes ble beregnet fra prosent hemning. Fraksjon påvirket ble så brukt i CalcuSyn programvare til å generere en dose-responskurve og isobologram.
Cell apoptose Analyser ved hjelp av flowcytometri for Annexin V
A2780 ble behandlet med Dox og WFA både alene eller kombinasjon av WFA /Dox som beskrevet ovenfor i 24 timer. Celler ble dissosiert med Versene (Invitrogen), vasket med PBS og resuspendert i Annexin V bindingsbuffer til en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml. Annexin V-FITC (2 ul, BD Biosciences) ble inkubert i 15 minutter i mørke med 100 ul av cellesuspensjon. Fire hundre ul av Annexin V bindingsbuffer ble tilsatt til suspensjonen. To ul propedium jodid (PI) ble tilsatt i oppløsning og straks anvendt på en FACSCaliber (BD Biosciences) som beskrevet av Betts et al [24]. Annexin V og PI fargede celler ble analysert ved hjelp av FlowJo programvare.
reaktive oksygen arter (ROS) Analyser
A2780 celle ble sådd på glassbunn 35 mm
2 retter natten etterfulgt av behandling med Dox og WFA som beskrevet ovenfor i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert med 2 uM H
2DCFDA (Invitrogen) i vekstmedium i 30 minutter ved 37 ° C som beskrevet av Das et al [7]. Cellene ble vasket med PBS, betraktes under konfokalmikroskop, og fotografert.
DNA Skade Analyse ved hjelp av TUNEL Analyser
A2780 celler ble sådd på kammers objektglass og behandlet med Dox og WFA som beskrevet ovenfor. Cellene ble så analysert for DNA-skade ved hjelp av blind Fluorometrisk TUNEL assay kit (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Celler ble undersøkt under konfokal mikroskop og fotograferte.
tunel analyser for vevssnitt ble utført ved hjelp av en ApopTag Plus Peroxidase apoptose Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Protein Isolation og Western blot-analyse
A2780 celler ble sådd inn i 6-brønners plater og behandlet med Dox og WFA både alene eller i kombinasjon WFA /Dox som beskrevet ovenfor i 24 timer. Cellelysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [25]. Proteinene ble gjenoppløst på SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (GE Healthcare). Primære antistoffer ble fortynnet som angitt av produsenten, og inkubert over natten ved 4 ° C. Antistoff binding ble avslørt av peroksidase merket sekundære antistoffer visualiseres ved hjelp av forbedret chemioluminescence (GE Healthcare) som beskrevet tidligere [26]. Blottene ble deretter re-probet med GAPDH å normalisere forskjeller i belastning.
tredimensjonal (3D) Tumor Growth Assays
A2780-celler (15 000 /kule) ble blandet med Hubiogel® i et forhold på 1:04 og dispensert i 10 mikroliter kuler og tillatt å polymerisere før de ble suspendert i varm vekstmedium for å danne sfæriske svulster. Hver sfærisk tumor (1 mm
3) ble overført til 96-brønners plate (en tumor /brønn) og behandlet med Dox (0,2, 2 uM), WFA (0,5, 2 uM), eller kombinasjoner av WFA /Dox (0,5 iM /0,2 mikrometer eller 2,0 mikrometer /0,2 mm). Medium ble erstattet (to ganger /uke) med medium som inneholder fersk agent. Tumorvekst ble utført på dag 1, 3 og 7 ved hjelp av MTT-analyser som beskrevet ovenfor. Tumorer etter behandling ble inkubert med calcein AM (Invitrogen) i 30 minutter og undersøkt ved anvendelse av Nikon B-2EIC fluorescens mikroskop ved bruk av FITC filterblokken ved Ex
465-495 nm og Em
515-555 nm) og fotografert.
Xenotransplantat tumordannelse og Behandling med Dox, WFA eller WFA /DOX
A2780 celler ble blandet med Matrigel (BD Biosciences) på en 1:01 ratio. Celler (2 x 10
6) ble bilateralt injisert subkutant i den ventrale flanken av 5-6 uker gamle nu /nu-mus (Charles River) og tumorene ble tillatt å vokse i 20 dager inntil de nådde til 100 mm
3 i størrelse som tidligere beskrevet [27]. Musene ble deretter randomisert inn i 6 grupper og injisert med: 1) PBS, 2) 10% DMSO + 90% glyceryl-trioctanoate (kjøretøy), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, eller 6) Dox 1 mg /kg + WFA 2 mg /kg. Mus ble behandlet annenhver dag i.p. ved anvendelse av 100 ul volum og tumorene ble målt med digital målepunkt før hver behandling. Dox ble oppløst i saltløsning, mens WFA ble solubilisert i DMSO og glyceryl trioctanoate (10:90 v /v). Musene ble avlivet etter 12 dager etter behandlingsstart. Alle behandlinger ble godkjent av IACUC, University of Louisville.
Immunhistokjemisk analyse av tumorvev
xenografttumorer ble fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin for seksjonering. Lysbilder ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en gradert serie av etanol. Antigen gjenfinning ble utført ved inkubering av lysbildene i 10 mM natriumcitrat, pH 6,0 i 20 minutter ved 95 ° C etterfulgt av behandling med 0,3% H
2o
2 i metanol i 20 minutter [28]. Lysbilder ble behandlet ved hjelp Vectastain ABC Elite Anti-Rabbit kit (Vector Labs). Seksjoner ble inkubert med primære antistoffer for Ki67 (fortynnet 1:50, Santa Cruz Biotechnology), CD31 (01:50, Abcam), LC3B (1:500, Abcam), og kløyvde caspase 3 (1:200, Cell Signaling) på 4 ° C over natten. Objektglassene ble vasket med PBS og inkubert med sekundært antistoff i henhold til leverandørens instruksjoner. Color ble utviklet ved hjelp av DAB (Vector Labs) og kontra med hematoksylin QS (Vector Labs) å farge kjerner som beskrevet tidligere [28].
Statistical Analysis
Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. P-verdier ble bestemt ved ANOVA analyse etterfulgt av Student-Newman-Keuls test for multiple sammenligninger.
Resultater
WFA synergizes den antitumor effekt av doxorubicin
Dox brukes vanligvis på 5 uM for å etterligne den konsentrasjon i plasma fra pasienter som gjennomgår behandling Dox [29]. Men ved denne dosen, at pasienten har alvorlige bivirkninger, siden en konsentrasjon på 1 uM er nødvendig for å opprettholde forskjellige mekanismer for virkningene av Dox [29]. For å minimere eller eliminere disse bivirkninger, vi utforsket muligheten for å bruke et Dox /WFA kombinasjonsbehandling. Ovarie cancer cellelinjer A2780 og CAOV3 og en cisplatin-resistente cellelinje A2780 /CP70 ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Dox og WFA både alene og i kombinasjon. Dox /WFA kombinasjon hemmet celleproliferasjon av alle tre cellelinjer i et dose- og tidsavhengig måte. Når Dox og WFA ble anvendt alene, IC
50 Verdiene for A2780-celler etter 48 timers behandling var 0,8 uM og 4,1 uM henholdsvis (fig. 1A-B). Når cellene ble ko-behandlet med en kombinasjon av Dox med 1,5 uM av WFA, IC
50 verdi for Dox ble redusert til 0,16 uM (fig. 1A). På samme måte når 200 nM av Dox ble kombinert med WFA, IC
50 verdi for WFA ble redusert til 1,5 uM (fig. 1B). Celler ved samtidig behandlet med 200 nM av Dox og 2,0 uM av WFA resulterte i 90 til 95% celledød (Fig. 1B), mens behandling av celler med Dox alene (200 nM) og WFA alene (2,0 pM) førte til 9 % og 20% inhibering respektivt. For A2780 /CP70 celler, IC
50 verdier for Dox og WFA var henholdsvis 0,65 mikrometer og 6 mikrometer. Kombinere Dox med 1,5 mikrometer fra WFA redusert IC
50 Verdien av Dox til 0,18 mikrometer, og kombinere WFA med 200 nM av Dox redusert IC
50 verdi til 1,2 mikrometer (Fig. 1C-D). CAOV3 cellene mer følsomme for behandling med Dox og WFA alene eller i kombinasjon Dox /WFA (resultater ikke vist). IC
50-verdier er oppsummert i tabell 1. Disse resultatene tyder på at det Dox /WFA kombinasjonen virker på en synergistisk måte for å mediere antitumoraktivitet. data celleproliferasjon etter 24 timer og 72 timer behandling er vist i fig. S1 og S2.
A2780 og A2780 /CP-celler ble sådd ut i 96-brønners plater. Etter 24 timer med plating ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Dox og WFA, både alene eller i kombinasjon. Etter 48 timers behandling, ble cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT-analyser. Verdier som vises er gjennomsnitt ± SD av fire uavhengige forsøk. * P 0,05 sammenlignet med kontroll, # p 0,05 sammenlignet med Dox eller WFA alene. (E) isobologram analyse av A2780-celler (n = 4) og (F) A2780 /CP70 (n = 4) ved bruk av 7 doser av Dox og WFA opprettholdt ved et konstant forhold og celledød ble analysert ved MTT-analyser. Resultatene ble analysert med CalcuSyn programvare.
For å bekrefte at effekten av kombinasjonen av WFA med Dox var synergistisk, vi utførte isobologram analyse. Både A2780 og A2780 /CP70-celler ble behandlet med 7 konsentrasjoner av Dox og WFA i et konstant forhold i 48 timer og celleproliferasjon ble analysert ved MTT-analyser. CalcuSyn programmet ble brukt til å generere isobologrammer, viser at Dox og WFA handle synergi (Fig. 1E-F) for begge cellelinjene.
For å finne ut om apoptose var årsaken til celledød, utførte vi Annexin V -FITC flowcytometri på A2780 celler behandlet med Dox og WFA både alene eller i kombinasjon. Analyse av Dox, WFA, og Dox med WFA behandlede prøvene viste en ikke-signifikant økning over kontrollen for Annexin V (fig. S3). For å bekrefte vår teknikk, var positive kontrollprøver produsert ved hjelp av UV-eksponering i 30 sekunder og analyse av cellene i 4 timer, 6 timer og 24 timer etter eksponering for å sikre effektiviteten av farging (fig. S4). I tillegg undersøkte vi iboende apoptotiske proteiner fosfor-BAD
136 (pBAD
136) og BCL-XL. Vi fant ingen signifikante endringer i pBAD
136 eller BCL-XL (Fig. S5), noe som indikerer at en alternativ vei til indre apoptose blir brukt til å indusere celledød.
Dox og WFA Produser ROS å indusere celledød
Dox er kjent å frem ROS som en del av dens mekanismer [4], [5]. Det har også vært tallrike rapporter om WFA generer ROS produksjon som en del av dens apoptotiske mekanismer i forskjellige krefttyper [12], [17], [18], [30]. Derfor spurte vi om WFA kan forsterke effekten av lav konsentrasjon av Dox etter 24 timer med behandling, brukte vi H
2DCFDA å bestemme generasjon av ROS. H
2DCFDA er en stabil ikke-polar forbindelse som lett diffunderer inn i cellene. Denne forbindelsen blir deretter hydrolysert ved intracellulære esteraser for å danne DCFH, som igjen oksyderes av hydrogenperoksyd under dannelse av sterkt fluorescerende forbindelse 2’7′-dichlorofluorescein (DCF). Etter 6 timers behandling med WFA 1,5 uM betydelig øket ROS-positive celler fra 2% til 17% sammenlignet med kontrollceller (resultater ikke vist). Etter 24 timers behandling, Dox 200 nM viste et lavt antall ROS-positive celler, 18% (fig. 2A-B). Mens WFA 0,5 pM (23%) var ikke signifikant forskjellig fra Dox, kombinasjon av Dox 200 nM med WFA 0,5 pM resulterte i en signifikant økning til 37%. Denne virkning ble sterkt forbedret med en kombinasjon av Dox 200 nM med WFA 1,5 uM, økende til 90% ROS-positive celler (Fig. 2A-B). Behandling med WFA 2 mikrometer skadet cellene altfor alvorlig til å produsere ROS, noe som indikerer at effekten av WFA på ROS produksjon er doseavhengig og ved kombinasjon med Dox utløser en synergistisk effekt.
For å bekrefte at ROS er ansvarlig for vår observert celledød, vi co-behandlede A2780-celler med ROS-passiveringsmidlet N-acetyl-L-cystein (NAC, 5 mM) eller med enzymatiske antioksidanter superoksid dismutase (SOD) og katalase sammen med Dox og WFA behandlinger av 24 og 48 timers som beskrevet ovenfor. Mens NAC var ineffektiv til å blokkere celledød indusert ved Dox ved 24 timer, er det forutsatt moderat beskyttelse etter 48 timers behandling (Fig. 3A) bestemt ved MTT-analyser. NAC var meget effektiv til å blokkere celledød indusert ved WFA etter 24 timer og fortsatte å gi beskyttelse etter 48 timers inkubering (Fig. 3C). NAC var også effektiv i å blokkere Dox /WFA kombinasjonsbehandling (fig. 3B-D). For å skille mellom den store form av ROS produsert av Dox og WFA behandling, behandlet vi cellene med enzymatiske antioksidanter katalase 500 U /ml eller SOD 100 U /ml. Det har blitt rapportert at katalase er hyppig brukt av celler for å degradere hydrogenperoksyd [31], mens SOD spesifikt katalyserer superoksyd-anioner [32]. Etter 48 timer med behandling SOD vesentlig blokkert celledød indusert av Dox og WFA alene og i kombinasjon (fig. 4). I likhet med SOD, katalase viste beskyttelse av celledød ved Dox og WFA både alene eller i kombinasjon WFA /Dox (resultater ikke vist), noe som indikerer at superoxide anioner er de viktigste ROS-artene produsert av Dox og WFA.
A2780 cellene ble platet inn i glassbunn retter. Etter 24 timer med plating ble cellene behandlet med Dox og WFA, både alene eller i kombinasjon WFA /DOX som beskrevet i figur 1. Etter 24 timers behandling, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende H
2DCFDA og inkuberes i 30 min. Celler ble skylt med PBS og undersøkt under konfokalmikroskop. (A) ROS-positive celler (grønn farge) ble regnet basert på 3 lave kraft felt. Mean ± SD. P-verdier ble bestemt ved ANOVA analyse etterfulgt av Student-Newman-Keuls test for multiple sammenligninger. * P 0,05 fra kontroll, $ P 0,05 sammenlignet med Dox, P 0,05 sammenlignet med WFA. (B) Konfokalmikroskopi analyse av celler som indikerer generasjon av ROS (grønn farge).
A2780 celler ble samtidig behandling med NAC og Dox, WFA eller kombinasjon av WFA /WFA i 48 timer. Celleformering ble bestemt ved å anvende MTT-analyser. Verdier som vises er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. P 0,05 sammenlignet med kontroll, # P 0,05 sammenlignet med ingen NAC og NAC
Celleproliferering ble bestemt ved hjelp av MTT-analyser.. Verdier som vises er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. * P 0,05 sammenlignet med kontroll, # P. 0,05 sammenlignet med ingen SOD og SOD
Som ROS forårsaker DNA-skade, utførte vi TUNEL analyse for å visualisere omfanget av DNA-skade når de behandles med Dox og WFA alene eller i kombinasjon. Etter 24 timers behandling, Dox 200 nM resulterte i DNA-skade i noen celler, mens WFA 1,5 uM alene svakt økt antall skadede celler (Fig. 5). Men behandling med Dox 200 nM og WFA 1,5 mikrometer kombinasjon resulterte i en forbedret effekt å indusere DNA-skade. Nesten hver eneste celle viste DNA-skader (Fig. 5).
A2780 celler ble behandlet med Dox, WFA både alene eller kombinasjon av WFA /Dox. Etter 24 timers behandling, ble DNA-skade analysert ved hjelp av TUNNEL analyser. Bilder ble innhentet ved hjelp konfokalmikroskopi på 20X forstørrelse.
Kombinasjon av Dox og WFA celledød ved autofagi
Forskjellige kreft kjemoterapi inkludert Dox har vist seg å indusere autofagi, som samarbeider med apoptose for å indusere celledød [33] – [38] som et middel for å fjerne ødelagte organeller som kan gi en høy grad av ROS og dermed begrenser kromosomal ustabilitet [39]. Derfor undersøker rollen av kjemoterapi middel Dox kombinert med WFA i autofagi er en allé av interesse. Elektronmikroskopi-analyse av kontrollceller behandlet med DMSO viste tilstedeværelse av mitokondrier og en intakt atom envelop (fig. 6). Mens WFA 0,5 mikrometer alene hadde liten eller ingen effekt, WFA 1,5 og 2 mikrometer viste noen autophagosomes som en indikator på autofagi, men forlot mitokondriene intakt, muligens som en tilpasning mekanisme. -Celler ved behandling med Dox 200 nM alene viste dannelse av autophagosomes innehold cytoplasma og ødeleggelse av mitokondriene. Behandling av celler med Dox /WFA kombinasjon resulterte i en bedret effekt ved en dose-avhengig måte. Dox 200 nM pluss WFA 2 mikrometer viste intense autophagic vakuoler sammen med sammenbruddet av den kjernefysiske innhylle, membran oppløsning, og fravær av mitokondrier (Fig. 6), noe som indikerer intense celleskader ved behandling med Dox /WFA kombinasjon.
A2780-celler ble behandlet med Dox og WFA, både alene eller i kombinasjon WFA /Dox. Etter 24 timers behandling ble cellene renset med PBS, fiksert og prosessert for TEM-analyse. Elektron mikroskopiske bilder på 5,600X forstørrelse er vist.
For å bekrefte induksjon av autophagy ved behandling av celler med Dox /WFA kombinasjon, vi bestemt uttrykk for den kanoniske markør for autophagosome formasjon, microtubule-forbundet protein-en lett kjede 3B (LC3B) [38]. Western blot-analyse av cellene som viste to spesifikke bånd: et øvre bånd (18 kDa) som representerer LC3B-I og et nedre bånd (16 kDa) som svarer til LC3B-II (Fig 7.). Cytosoliske LC3B-I omdannes til LC3B-II gjennom lipidering og tillater LC3B-II for å bli forbundet med autophagic vesikler. Behandling med Dox indusert produksjon av LC3B-II (fig. 7), mens WFA alene stimulerte produksjon av pre-markøren LC3B-I, så vel som LC3B-II (fig. 7). Kombinasjonsbehandling forbedret LC3B-II på en doseavhengig måte med Dox 200 nM med WFA 2 uM med den høyeste ekspresjon (Fig. 7). For å bestemme om autofagi var en tilpasning reaksjon eller en mekanisme av celledød, undersøkte vi spaltet kaspase 3 som en markør for celledød. Western blot analyse viste en beskjeden økning i celle behandlet med Dox 200 nM. I motsetning til dette, WFA 0.5 uM viste ingen tegn på celledød, mens WFA 1,5 og 2 um viste en økning i nivået av spaltede caspase 3. Behandling av celler med Dox /WFA kombinasjon viste en ytterligere forbedring av celledød i et dose avhengig måte (fig. 7), som indikerer at autophagy fremmer celledød i stedet for å indusere en tilpasning mekanisme for å fremme celleoverlevelse med Dox /WFA kombinasjonsbehandling.
Etter 24 timers behandling, ble cellene vasket med PBS og lysert. Western blot analyse ble utført for LC3B, Caspase 3 og GAPDH proteiner.
Effekt av Dox og WFA på 3D Svulster in vitro
I tillegg til å analysere hemming av tumorcellevekst, vi evaluert effekten av Dox og WFA både alene eller WFA /Dox kombinasjon for sin anti-tumor effekt ved hjelp av en 3D mini-tumormodell som emulerer
in vivo
-lignende flercellet tumorvekst og biologi. Levedyktige mini-tumorer (1 mm
3 størrelse) av A2780 eggstokkreft celler ble generert ved hjelp av en 3D-menneske Biogel kultursystem (HuBiogel®, Vivo biovitenskap Inc.). Hubiogel® har vist seg å representere den menneskelige matrisen mer nøyaktig enn Matrigel for å forutsi prekliniske endepunkter [40]. Mini-tumorer ble behandlet med 1) Dox 0,2 uM, 2) Dox 2,0 uM, 3) WFA 0,5 uM, 4) WFA 2,0 uM, 5) Dox 0,2 uM med WFA 0,5 pM, og 6) Dox 0,2 uM med WFA 2 pM . Målinger av tumorvekst ble utført på dag 1, 3 og 7 ved hjelp av MTT-analyser og fluorescens mikroskopi. Medium og DMSO behandlede tumorer fortsatte å vokse gjennom hele behandlingen, mens Dox 0,2 mikrometer hadde sin vekst stoppet på dag 7 (Fig. 8A). Dox 2,0 mikrometer alene og WFA 2,0 mikrometer alene behandlede svulster viste redusert vekst og dette hemmende effekten ble forsterket ved behandling med Dox 0,2 mikrometer pluss WFA 2,0 mikrometer (Fig. 8A). Kombinasjon av Dox 0,2 mikrometer med WFA 0,5 mikrometer oppnådd en drastisk forbedret effekt i forhold til hver komponent alene (Fig 8A.). Mikroskopi-analyse av tumorer etter dag 3 og 7 er vist i fig. 8B og 8C som indikerte synergistisk effekt av Dox og WFA kombinasjonen på undertrykkelse av tumorvekst.
(A) A2780 Celler ble kombinert med Hubiogel® i en 1:04 ratio og vokst fra 10 mL perler. Svulster ble behandlet med Dox og WFA, både alene eller kombinasjon av WFA /Dox. Svulster ble behandlet to ganger /uke ved å erstatte mediet med medium som inneholder fersk agent. Tumorvekst ble målt ved anvendelse av MTT-analyser etter dag 3 eller 7 for behandling. (B-C) Svulster etter behandling ble inkubert med calcein AM i 30 min, og bildene ble tatt ved hjelp av fluorescens mikroskop etter 3 dagers behandling (B) eller 7 dagers behandling (C).
effekt av Dox og WFA på Xenotransplantat tumorvekst
for å studere effekten av Dox og WFA alene eller i kombinasjon på tumorvekst
in vivo
, ble mus tumorxenotransplantater utviklet ved å injisere A2780 celler (2 × 10
6) subkutant bilateralt i ventral flanken av 5-6 uker gamle nu /nu mus. Tumorene fikk vokse inntil de nådde 100 mm
3 i størrelse. På dag 20 post-celleinjeksjon ble musene randomisert inn i 6 grupper på 5 mus hver og behandlet med ulike midler: 1) negativ kontroll (PBS), 2) bærerkontrollen (10% DMSO og 90% glyceryl trioctanoate), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, og 6) Dox 1 mg /kg med WFA 2 mg /kg, som beskrevet i materialer og metoder. Tumorene ble målt hver annen dag og mus ble administrert med 100 mL i.p. volum i 12 dager for en total periode på 32 dager. Mus som fikk Dox 9 mg /kg viste seg å være svært syk med et tap av appetitt som resulterer i vekttap etter første behandling og senere døde etter 4 behandlinger. Mus i de andre gruppene syntes å være sunn uten tap av appetitt eller vekt under hele behandlingsperioden. Tumorvolumet var ikke signifikant forskjellig mellom kjøretøy, Dox 1 mg /kg og WFA 2 mg /kg grupper. Imidlertid mus som mottok Dox 1 mg /kg med WFA 2 mg /kg (gruppe 6) viste en meget signifikant (70 til 80%) reduksjon i tumorvekst (Fig. 9A). Tilsvarende tumorvekt målt ved dag 32 oppsamlet på tidspunktet for å ofre dyrene viste en drastisk reduksjon i den Dox 1 mg /kg med WFA 2 mg /kg-gruppen (fig. 9B) sammenlignet med andre grupper som indikerer at kombinasjonen av WFA med Dox utløser en synergistisk effekt på tumor undertrykkelse av tumorvekst
in vivo
.
(A) svulster vekst ble målt fra dag 20-32 (post-celle injeksjon) og behandlet annenhver dag * P 0,05.
