Abstract
Formål
Til tross for intens forskningsinnsats, forblir bukspyttkjertel ductal adenokarsinom en av de mest dødelige kreftformer i verden. Vi og andre har tidligere identifisert en undergruppe av kreft i bukspyttkjertelen stamceller i svulsten som en kritisk terapeutisk mål og i tillegg vist at svulsten stroma representerer ikke bare en restriktiv barriere for vellykket levering av legemidler, men også fungerer som en parakrint nisje for kreft stamceller . Derfor begynte vi på en storstilt undersøkelse på effekten av å kombinere kjemoterapi, pinnsvin sti hemming, og mTOR-hemming i en preklinisk musemodell for kreft i bukspyttkjertelen.
Experimental Design
Prospective og randomisert testing i et sett av nesten 200 subkutane og ortotopiske implantert hel-vev primære humane tumorxenotransplantater.
Resultater
Den kombinerte målretting av svært kjemoresistent kreftstamceller så vel som sine mer differensierte progenies, sammen med opphør av svulsten mikromiljøet ved å målrette den stroma og styrke vev penetrasjon av kjemoterapeutiske middel oversatt til betydelig forlenget overlevelse i prekliniske modeller for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen. De fleste uttalte terapeutiske effekter ble observert i gemcitabin-resistente pasient avledet svulster. Forbløffende nok kan den foreslåtte trippelterapi tilnærming bli ytterligere forbedret ved hjelp av et pegylert og formulering av gemcitabin, som i betydelig grad økt sin biotilgjengelighet og vev penetrasjon, noe som resulterer i en ytterligere forbedret samlede resultatet.
Konklusjoner
Dette multimodale terapeutisk strategi bør videre undersøkt i klinisk setting som sin suksess etter hvert kan forbedre dårlig prognose for pasienter med bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom
Citation. Hermann PC, Trabulo SM, Sainz B Jr, Balic A, Garcia E , Hahn SA, et al. (2013) Multimodal Treatment Fjerner kreftstamceller og fører til langsiktig overlevelse i Primær Menneskelig bukspyttkjertelkreft Tissue xenografter. PLoS ONE 8 (6): e66371. doi: 10,1371 /journal.pone.0066371
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 13 november 2012; Godkjent: 07.05.2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Hermann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet av ubegrenset forskningsstipend fra Siena Biotech, en ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233 460), den Subdirección General de Evaluación y Fomento de la INVESTIGACION, Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (PS09 /02 129, Ministerio de Ciencia e Innovación, Spania ) og Programa Nacional de Internacionalización de la i + D, Subprogramma: FCCI 2009 (Modalidad ACI-PLAN e Células Madre Proyectos PLE2009-0105 og Modalidad ACI-Colobra India, både Ministerio de Ciencia e Innovación). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. To av forfatterne er for tiden (Patrizia Tunici) eller var inntil nylig (Annette Bakker ) ansatt av kommersielle Funder av denne forskningen «Siena Biotech SpA». Patrizia Tunici og Annette Bakker utviklet og validert Sibi-C1, men var ikke involvert i design og dataanalyse av denne studien. Forfatterne bekrefter også at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Ingen andre relevante erklæringer er gjort knyttet til sysselsetting, konsulent, patenter, produkter i utvikling eller markedsført produkter, etc.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (heretter omtalt som «kreft i bukspyttkjertelen» eller PDAC ) er den fjerde hyppigste årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1], [2], [3], og er karakterisert ved en høy grad av metastase og utpreget motstandsdyktighet overfor kjemoterapi og stråling. Til tross for omfattende forskningsinnsats de siste tiårene, har litt store fremskritt er gjort mot bedre kliniske endepunkter [4]. Selv om innføringen av anti-metabolitt gemcitabin i 2007 har forbedret klinisk respons ved å redusere smerte og vekttap [5], har sykdomsprognosen er fortsatt meget dårlig med en 5 års overlevelse på ~3-4% og en median overlevelse periode på fire -6 måneder [1], [6]. Faktisk har flere studier vist at gående gemcitabin behandlings meste mål differensierte kreftceller som resulterer i en relativ anrikning av kreft stamceller [7], [8], [9]. For pasienter med metastatisk sykdom, men god ytelse status, den siste kombinasjonsbehandling FOLFIRINOX (oksaliplatin, irinotecan, fluorouracil og folinsyre) viste en signifikant overlevelsesfordel, men med økte giftige bivirkninger [10]. Alternativt regimet av NAB-paclitaxel pluss gemcitabin viste betydelig anti-tumor aktivitet med mer utholdelig skadevirkninger i en fase I /II studien, warranting fase III evaluering [11]. Men i alle disse forsøkene flertallet av pasientene til slutt bukket fra sykdomsprogresjon. Dermed gjenstår utvikling av nye anti-kreftbehandling og /eller nye behandlingsmetoder høy helsetjenester prioritet.
Med økende bevis som støtter eksistensen av kreft stamceller, er en ny horisont nye i utviklingen av terapeutiske strategier mot bukspyttkjertelkreft. Cancer stamceller representerer en subpopulasjon av celler som kan skjelnes fra hoveddelen av tumor basert på deres eksklusive evnen til å kjøre tumorgenese og metastasering. Disse cellene spiller også en avgjørende rolle i og drivende sykdom tilbakefall [12], [13], [14], [15], [16]; derfor klarlegging av mekanismene bak bukspyttkjertelen tumorigenesis og særlig kreft i bukspyttkjertelen stamceller er av avgjørende betydning for utviklingen av mer effektive klinisk tilgjengelige behandlinger. Faktisk har vi nylig utviklet roman tilnærminger som begge mål kreftstamceller og overvinne sine mekanismer cellegift-motstand [9], [17], [18]. For eksempel har vi vist at selvfornyelse kapasitet for kreft i bukspyttkjertelen stamceller er avhengig av både
Hedgehog Hotell og
mTOR
signalering, og samtidig målretting av disse to banene, i kombinasjon med gemcitabin representerer en ny behandlingsstrategi for epiteliale kreftformer som kreft i bukspyttkjertel [9]. Bygge på disse studiene, vi her undersøke anvendbar, sikkerhet, og potensialet for videre optimalisering av denne kombinasjonsterapi tilnærming i et stort sett av primære pasient avledet svulster.
Resultater
Triple Therapy Markert reduserer tumorstørrelse og øker overlevelse
Vi har vist tidligere at sfære kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler berike for kreft stamceller [8], [9], [17], og som kombinert målretting av Sonic Hedgehog (SHH ) og mTOR trasé kan tilby et nytt behandlingsalternativ. Her bekrefter vi i fire forskjellige primære bukspyttkjertelkreft cellelinjer avledet fra pasient svulster som kreft stamcelle-beriket sfære kulturer faktisk showet merket overekspresjon av SHH og the Hedgehog målgener GLI-1 og GLI-2 (Fig. 1A), samt øket mTOR sti-aktivitet (fig. 1B). Den påfølgende
in vivo
evaluering av kombinasjonsbehandling ble utført i klinisk mest relevante modeller for pasient avledet bukspyttkjertelen kreft hel-vev xenografter (se Fig. 1C for studiedesign). Stykker av kort,
in vivo
ekspanderte primære humane pankreatiske tumorer inneholdende heterogene populasjoner av kreftceller, inkludert kreft stamceller [9], så vel som stromale celler [7], pankreatiske stellate cells, inflammatoriske celler og ekstracellulær matriks ble implantert subkutant og orthotopically inn immunkompromitterte mus. Tumor ta Hastigheten ble bekreftet av tumorvekst i løpet av to på hverandre følgende størrelsesmålinger, og tumor-bærende mus ble randomisert til behandling. Deretter ble tumorene målt en gang i uken, enten ved målepunktet (subkutane tumorer) eller med et lite dyr ultralydavbildningssystem (ortotopiske tumorer). Som Gemcitabin (Gem) representerer dagens standard behandling for kreft i bukspyttkjertelen, brukte vi Gem-behandlede mus som referansegruppen.
(A) Brett øke mRNA uttrykk nivåer av SHH, GLI-en, og GLI-2 av kule-avledet vs. heftende celler. (B) Western blot-analyse av mTOR pathway aktivitet til ved vurdering av S6-kinase-ekspresjon (øvre panel) og fosforylering (nedre panel) i adherente primære celler versus stamcelle-anrikede sfæren-avledede celler. (C) Illustrasjon av eksperimentelle oppsettet. Varighet av trippelterapi er markert med en mørk grå boksen (dag 21-48), Gem monoterapi med en lys grå boks (dag 48-81).
Et sett med representative svulster ble valgt basert på deres ulike svar på Gem behandling [7]. PDAC-265 og 185 var meget motstandsdyktig mot Gem behandling, som viser hurtig tumorvekst, slik at den første mus måtte bli fjernet fra undersøkelsen i løpet av 3 uker etter starten av behandlingen (fig. 2A-E) på grunn av overdreven tumorvekst. I kontrast i tumorer PDAC-JH051, 247, og Pax22, Gem behandling resulterte i initial behandlingsrespons og stabilisering sykdom; imidlertid, etter fjerning av kjemoterapi, svulstene reproduserbart begynte å re-vekst (fig. 2C-E). Av alle de undersøkte tumorer, bare PDAC-354, som ikke bærer
Kras
mutasjoner [19], viste signifikant respons på Gem behandlingen til slutten av observasjonsperioden (fig. 2F) og nært etterlignet behandlingen responsen observert i den aktuelle pasient (data ikke vist).
(A-F) Tumor vekstkurver for primær hel dels xenotransplantater PDAC-265, PDAC-185, JH051, 247, Pax22, og 354 implantert subkutant og orthotopically. Sammenhengende linje viser Gem + kjøretøy, stiplede linjen viser Gem + Sibi, viser stiplet linje Gem + Sibi + Rapa (n≥6 per gruppe). (G) Kaplan-Meier kurve viser kumulativ overlevelse av alle mus sammenslåtte etter behandlingsgruppe.
Viktigere, vi var i stand til å forbedre behandlingen respons ved å kombinere kjemoterapi med romanen pinnsvinet pathway inhibitor Sibi-C1 ( Sibi, Siena Biotech) [20]. Sibi hemmer sterkt genuttrykk fra SHH og nedstrøms målgener som GLI2 i grunnskolen kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro plakater (fig. S1 A i File S1). Sibi ble administrert i bare 3 uker for å redusere potensielt skadelige virkninger. Gem ble gitt for en total tidsperiode på 60 dager, i samsvar med vanlig klinisk praksis (Fig. 1C). På grunn av den sterke reaksjon på kjemoterapi alene, hadde samtidig behandling av mus med PDAC-354 xenografter med enten Sibi ikke vise en ekstra effekt på nivået av tumorstørrelse (Fig. 2F) eller overlevelse (data ikke vist). For alle de andre tumorer, men dobbel behandling med Gem + Sibi førte til en markert reduksjon i tumorstørrelse (stiplet linje, Figur 1 . 2), betydelig forsinkelse i tumorvekst, og dermed vesentlig forlenget overlevelse sammenlignet med mus som mottok enten ingen behandling eller Gem + Vehicle (fig. 2G). Viktigere er imidlertid tumorer etter hvert tilbakefall begrensende overlevelse hos mus som fikk denne dobbelte behandling. Disse dataene er i tråd med forbedret levering av gemcitabin følgende utarming av beskyttende stromal vev [21]. Som tidligere vist, hemming av pinnsvin signale alene ikke fullstendig oppheve kreftstamcellepopulasjonen (figur 3A . 2). Dette oversettes til en betydelig forbedret kumulativ overlevelse i forhold til alle andre behandlingsgruppene (Fig. 2E).
kombinasjonsbehandling utarmer Cancer Stem Cell Innhold og Endrer Tumor Sammensetning
For å kunne vurdere
in vivo
effekten av kombinasjonsbehandling på kreftstamcellepopulasjoner, vi eksplantert og fordøyd representative svulster i hver gruppe etter ferdigstillelse av de 3 ukene av trippelterapi, og analysert av flowcytometri uttrykket av overflatemarkører tidligere koblet til en kreft stamcelle-fenotypen [8], [9], [13]. Prosentandelen av EpCAM
+ CD133
+ CD44
+ celler i Gem-behandlede tumorer var regelmessig 2-3 ganger høyere sammenlignet med ubehandlede tumorer [data ikke vist og [8]]. I motsetning til dette, Gem + Sibi allerede viste en liten reduksjon i kreftstamcelle tall sammenlignet med Gem alene (figur 3A . B).
(A) var kroppsvekten registrert for alle mus i løpet av de første 100 dager etter eksperimentet. (B) Hvite blodlegemer på alle musene ble vurdert på slutten av administrasjonen perioden av trippelkombinasjonen.
Diskusjoner
Her er vi validere konseptet med en multimodal behandling for omfattende rettet mot ulike cellekamre i bukspyttkjertelkreft ved hjelp av et representativt sett av nesten 200 subkutane og ortotopiske hel-vev primære tumorxenotransplantater, noe som gjør dette til en av de største undersøkelsene i kreftstamcellefeltet. Tumorer ble valgt på grunnlag av deres tidligere beskrevne diverse respons på behandling gemcitabin [7]. Kjemoterapi og strålebehandling hovedsakelig være rettet mot differensierte kreftceller, og mens disse terapi induserer apoptose og celledød i tumorceller, er meget motstandsdyktig en populasjon av kreft stamceller [8], [9], [18], [24], overlever standard terapi, og opprettholder evnen til å re-befolke en tumor i all sin heterogenitet. Double behandling som kombinerer perle og den nye glattes inhibitor Sibi konsekvent forlenget overlevelse hos mus transplantert med svulster. Viktigere er imidlertid bare hos mus behandlet med trippel terapi kreft stamceller ble nesten fullstendig avskaffet, og vi observerte en langsiktig sykdom stabilisering eller regresjon, og påfølgende langsiktig overlevelse. I denne kombinasjonsregime, kan behandlingseffekten av konvensjonell Gem bli ytterligere forbedret ved bruk av PEGylert Gem via forbedre dens biotilgjengelighet.
På det histologiske nivå, er kreft i bukspyttkjertelen kjennetegnes ved meget tett stroma og dårlig vaskularisering. Olive et al. viste i et genetisk konstruert musemodell for kreft i bukspyttkjertelen som stroma er sterkt avhengig av pinnsvin signalering, og inhibering av pinnsvin reaksjonsvei med mykgjorte inhibitorer fører til «foretrukket» dreping av stromale celler og økt kar tetthet [21], og dermed gjøre tumorceller mer tilgjengelig for terapeutisk intervensjon. Mens disse observasjoner ble oppnådd i en musemodell av kreft i bukspyttkjertelen, har vi mer nylig vist seg at også i pasient-avledet hel dels xenotransplantater samtidig behandling med en glattet inhibitor øker medikamentavgivelse [17] signifikant og markert reduserer tumorassosiert stroma formasjon . Viktigere, setter vi nå at stroma ikke bare vanskeliggjør levering av legemidler [21], men gir også en støttende nisje for kreftstamceller fremme sin selvfornyelse kapasitet og invasivitet [25]. Dermed eliminering eller opphør av stroma blir betydelig bedre behandlingsregimer med tydelig mekanisme, men er bare i stand til å eliminere kreftstamceller hvis kombinert med perle.
Men til tross for ganske beskjedne responsen av kreft stamceller i Hedgehog pathway hemming som monoterapi, var vi i stand til å vise at glattes hemmere er fortsatt avgjørende for å lykkes eliminere kjemoresistent bukspyttkjertelkreft stamceller hvis det kombineres med andre stamcelle-målsagenter [9], [17]. Konkret har vi tidligere vist for kreft i bukspyttkjertelen at en kombinasjon av kjemoterapi og hemmere av både mTOR og pinnsvin signale eliminerer differensierte celler samt kreftstamceller
in vitro product: [9], og at dette slår ut i lang- begrepet overlevelse
in vivo
. Nylig har Wang et al. gitt et viktig mekanistisk kobling for den kombinerte hemming av pinnsvin og mTOR veien. Spesielt forfatterne vise at mTOR /S6K1 signaliserer resulterer i fosforylering av Gli og påfølgende uttrykk for nedstrøms mål. Inhibering av begge baner i stor grad forbedret pro-apoptose effekt av hemming av enten inhiberingen alene [26]. I denne studien, så har vi nå en nesten komplett eliminering av kreft stamceller for kombinasjonsbehandling i et stort og representativt sett av primære xenografter. Mens flowcytometri ved hjelp av de overflatemarkører CD133, EpCAM, og CD44 allerede antydet at kreften stamcelleinnhold ble sterkt redusert, funksjonelle analyser (f.eks sfære formasjonsprøving) validert at cellene isolert fra eksplanterte tumorene faktisk var i stand til å danne tumor sfærer
in vitro, etter sterkt tyder på at kreftstamcelle befolkningen som roten av sykdommen, hadde blitt effektivt målrettet av trippelkombinasjonen.
Selv om resultatene med Gem-Sibi-Rapa var svært konsistent og oppmuntrende på tvers av et panel av pasient-avledede tumorer, vi observere tumor re-vekst i noen mus (f.eks PDAC-185 xenotransplantater), og senere, en nedgang i overlevelse av de xenograft-bærende dyr. Da dette kan være relatert til den begrensede biotilgjengeligheten av det kjemoterapeutiske middel som en essensiell del av denne kombinasjonsbehandling, vi ytterligere utvidet vår behandlingsstrategien ved å endre kjemoterapi. Nærmere bestemt, Vandana et al. nylig har vist at modifikasjon gemcitabin via PEGylering fører til forbedret biotilgjengelighet i sirkulasjonen sammenlignet med naturlig gemcitabin. Selv om de har også vist bedre
in vitro
respons av etablerte kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp PEGylert gemcitabin i forhold til den vanlige formuleringen [22], observerte vi ingen signifikante forskjeller mellom Gem og PEG-Gem
in vitro
på nivået av kreft stamcelle-innhold eller induksjon av apoptose eller celledød ved hjelp av xenograft-avledede primære celler. Selv om disse dataene ikke er overraskende som narkotika levering og tilgjengelighet er ikke et kritisk problem
in vitro
, resultatene understreker tydelig viktigheten av å utnytte primær kreft vev for videre
in vivo
evaluering av legemidlets effekt .
Ja, vi var da i stand til å validere og utvide dette konseptet til
in vivo
omgivelser ved å vise at PEG-Gem behandling betydelig forsinket tidspunktet for tumorprogresjon etter 72 dager. Denne forbedrede behandlingsrespons er absolutt imponerende som den representerer mer enn halvparten av studieperioden. Som forventet, men tumorene til slutt utviklet seg noe som resulterer i praktisk talt ingen forskjell i gjennomsnittlig overlevelsestid av PEG-perle-behandlede mus sammenlignet med mus behandlet med tradisjonell Gem alene. Selv om disse data bekrefter at PEGylering av Gem virker faktisk forbedre medikament tilgjengelighet og levering, henholdsvis, ved å øke halveringstiden i sirkulasjonen og penetrasjon vev, som forventet, PEG-Gem alene er helt klart ikke er tilstrekkelig til å overvinne den chemoresistance av kreft stamceller. Derfor vi neste undersøkt effekten av å erstatte vanlig perle med PEG-perle i vår multimodal tilnærming for målretting bukspyttkjertelsvulster, som opprinnelig hadde respondert på Gem + Sibi + Rapa behandling, men til slutt fikk tilbakefall under denne spesifikke behandlingsregime. Forbløffende nok med PEG-Gem + Sibi + Rapa kombinasjon vi ikke bare observert nesten komplett tumor regresjon, men viktigst vi fått 100% overlevelse gjennom hele 125d studieperioden i denne svært terapiresistent tumor. Mens denne observasjonen utelukker ikke senere re-vekst sett i PDAC-Pax22, disse dataene er svært lovende og er i samsvar med den oppfatningen at ytterligere forbedre utformingen av den kombinerte medikamenter er obligatorisk for å utvide
in vitro
funn til mye mer kompleks
in vivo
setting.
utnyttes ny glattet inhibitor Sibi-C1 (Siena Biotech, Italia) var også svært effektive
in vivo
, som kan sees av redusert tumorvekst i kombinasjon med perle og dermed vesentlig forbedret overlevelsestid. Videre kan Sibi trygt administreres
in vivo
, som vi så ingen negative effekter på total kroppsvekt eller hvite blodceller. Viktigere, dette er vel i tråd med tidligere observasjoner ved hjelp av andre glattes hemmere [9], [15]. Gem + Sibi + Mana kombinasjonsterapi viste heller ingen signifikant toksisitet sammenlignet med Gem behandling alene i løpet av eksperimentene. PEG-Gem + Sibi + Rapa kombinasjonsbehandling, mens mye mer effektiv
in vivo
, bare litt, men ikke signifikant redusert antall hvite blodceller, og hadde ingen effekt på kroppsvekten til dyrene i forhold til respektive kontroller. Det er viktig å merke seg at de sunne og forholdsvis unge mus anvendt for denne studien er sannsynligvis mer i stand til å kompensere for mulige uønskede effekter på de normale stilk cellekamre under trippelbehandling. Derfor vil det være viktig å ytterligere bekrefte sikkerheten ved denne behandlingsregime i humane pasienter for til slutt å bruke det på de for det meste alderen og døende pasienter som lider av kreft i bukspyttkjertelen.
Som konklusjon, her vi gir overbevisende bevis for effekten av en multimodal terapi rettet mot differensierte celler samt kreftstamceller i kreft i bukspyttkjertelen, noe som resulterer i langsiktig overlevelse hos mus. Således er disse data bekrefter og utvider tidligere funn fra vårt laboratorium i en meget stor kohort av dyr med pasient-avledet kreft i bukspyttkjertelen xenotransplantater [9], [15], [17]. I tillegg tilbyr vi også en ny og roman perspektiv på hvordan å ytterligere forbedre dagens terapeutiske tilnærminger ved å endre den molekylære strukturen av de obligatoriske kjemoterapeutika bruker PEGyleringen. Til sammen skal disse funnene betydelig innvirkning på fremtidig utvikling av ny anti-kreft i bukspyttkjertelen terapi og /eller behandlingsmetoder.
Materialer og metoder
tumorprøver
Etter pasientenes informert samtykke var innhentet, overflødig vev fra resected bukspyttkjertelen karsinom var xenopodet ved Johns Hopkins Medical Institutions (JHMIRB: 05-04-14-02 «en mulighetsstudie for individuell behandling av pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen») og Hospital de Madrid – Centro Integral Oncológico Clara Campal (FHM.06.10 «Etablering av bank for svulster og friskt vev hos pasienter med kreft»), henholdsvis under de angitte Institutional Review Board-godkjente protokoller [7]. korthet skytende tumorvev ikke nødvendig for klinisk diagnose i løpet av rutine Whipple reseksjoner utført av kirurger som ikke var involvert i denne studien ble senere implantert i immunkompromitterte mus. All pasientinformasjon ble anonymisert ved å fjerne all informasjon som identifiserer, eller kan føre til identifisering av pasienten. Ingen av pasientene hadde gjennomgått neoadjuvant stråling eller cellegift før reseksjon av svulsten.
Animal Experiments
Alle dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med institusjonens retningslinjer og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i CNIO (Protocol PA34 /2012- «xenotransplantat modell for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen»). Dyrene ble huset og opprettholdt i laminær strømning skap under spesifikke patogenfrie forhold.
