Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de direkte årsakene til kreft-relaterte dødsfall. Høyt nivå av chemoresistance er en av de største hindringer for klinisk behandling. I de senere år har kreftstamceller blitt mye identifisert og angitt som opprinnelsen til chemoresistance i multi-typer solide tumorer. Økende bevis tyder på at kreft stamceller ligge i celler i stand til å danne holoclones kontinuerlig. Men i bukspyttkjertelkreft, holoclone-dannende celler har ikke blitt karakterisert ennå. Derfor er målet vårt denne studien var å identifisere de holoclone dannende kreft i bukspyttkjertelen stamceller og utvikle en in vitro kontinuerlig kolonidannelse system, som vil i stor grad forenkle studiet av kreft i bukspyttkjertelen stamceller.
Metodikk /Principal funn
kreft i bukspyttkjertelen cellelinje BxPC3 ble sendt til monoklonalt kultivering for å generere kolonier. Basert på morfologi, ble kolonier klassifisert og analysert for deres kapasiteter på videregående koloni formasjon, langsiktige overlevelse i
n vitro
, tumordannelse
in vivo
, og stoffet motstand. Flowcytometri og kvantitativ RT-PCR ble utført for å påvise ekspresjon nivået av kreft stamceller i forbindelse celleoverflatemarkører, regulatoriske gener og microRNAs i forskjellige typer kolonier. Tre typer av kolonier med distinkte morfologier ble identifisert og betegnet som holo-, mero- og paraclones, hvor bare holoclones genererte kommer kolonier av alle tre typer i ytterligere passasjer. Sammenlignet med mero- og paraclones, holoclones besatt høyere kapasitet for langsiktig overlevelse, startfasen, og chemoresistance. Fortrinns uttrykk for kreft stamceller relatert markør (CXCR4), regulatoriske gener (BMI1, GLI1, og GLI2) og microRNAs (MIR-214, MIR-21, MIR-221, MIR-222 og MIR-155) i holoclones var også uthevet.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater tyder på at bukspyttkjertelen tumor initiere celler med høy chemoresistance ble beriket i holoclones avledet fra BxPC3 cellelinje. Generering av holoclones kan tjene som en roman modell for å studere kreftstamceller, og tillegger utvikling av nye kreftmedisiner
Citation. Tan L, Sui X, Deng H, Ding M (2011) Holoclone forming celler fra kreft i bukspyttkjertelen celler Berik Tumor initiere Cells og representerer et Novel modell for studiet av kreft stamceller. PLoS ONE 6 (8): e23383. doi: 10,1371 /journal.pone.0023383
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 20 mars 2011; Godkjent: 15 juli 2011; Publisert: 03.08.2011
Copyright: © 2011 Tan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Ministry of Education stipend (705001) (https://www.moe.edu.cn/), National Natural Science Foundation of China for Creative Forskningsgrupper grupper~~POS=HEADCOMP (30421004) (https://www.nsfc.gov. cn), og 111 Prosjekt til HD. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er i dag den fjerde største årsaken til kreft relatert dødelighet. Mindre enn 5% av pasientene overleve i 5 år etter diagnose med median overlevelse periode på 4 til 6 måneder [1], [2]. Selv kirurgisk fjerning regnes som den mest effektive metoden for behandling, forblir dens gjennomførbarhet lav på grunn av lokal utvikling og tidlig metastase [3]. I tillegg er kjemoterapi betraktes som et viktig alternativ i klinisk terapi, men det gir vanligvis dårlige effekter [4], [5] .Derfor, er det nødvendig å dechiffrere de mekanismer som ligger til grunn for den høye chemoresistance av kreft i bukspyttkjertelen celler.
i de senere år, kreft stamceller (eller betegnet som tumorceller initiere) har blitt identifisert som en integrert del i flere typer av faste tumorer [6] – [11]. Cancer stamceller ikke bare resultere i startfasen og vekst, men også fungere som opphavet til kreft metastase, tilbakefall og motstand mot kjemoterapi eller strålebehandling [12] – [14]. Derfor er det videre arbeidet med oppdaging og eliminering av kreft i bukspyttkjertelen stamceller fortsatt ønsket å kunne erobre hindringer i klinisk behandling.
Nyere studier på voksne og kreft stamceller har korrelert stamcelleegenskaper med morfologi av koloniene generert fra enkeltceller [15] – [20]. Ifølge kriteriene for kolonistørrelse og border definert av banebrytende verk i keratinocytt cellelinjer, ble koloniene klassifisert og betegnes som holoclones, meroclones og paraclones [21]. I likhet med stamceller i hårsekkene [15], okulær [16], og epidermal [17], kreft stamceller av prostata [19] og gliom [20] ble demonstrert å oppholde seg i holoclones. Holoclones avledet fra prostatakreft cellelinje PC3 initiert tumordannelse i NOD /SCID mus eksklusivt og proliferated in vitro robust [19]. Celler i holoclones avledet fra glioma cellelinje U251 var i stand til å generere tumor kuler i serum fri tilstand og differensiere til linjer av nevroner, astrocytter og oligodendrocytter [20]. Interessant, stamcellerelaterte gener ble sterkt uttrykt i holoclones avledet fra både prostatakreft og glioma cellelinjer [19], [20]. Disse ledetråder antydet at utbredelsen av holoclones fra kreftcellelinjer kan tjene som en alternativ strategi for anriking av kreft stamceller [20]. Men i kreft i bukspyttkjertelen, holoclones har ikke blitt identifisert og dens sammenheng med egenskapene til kreft stamceller er ikke bestemt ennå.
I denne studien, adressert vi heterogenitet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer BxPC3 [22] og PC3 [23] basert på morfologi av koloniene avledet fra enkeltkreftceller og viste at kreftstamcelleegenskaper ble beriket i holoclones eksklusivt. Videre vårt arbeid indikerte holoclone forming celler tilskrive chemoresistance, som indikerte den potensielle verdien å utvikle cellegifter.
Resultater
kreft i bukspyttkjertelen celler vise heterogen kapasitet til å generere ulike koloni morfologi i klonal kultur
det første målet med vår studie var å finne ut om det mangfold av klonal morfologi eksisterer i bukspyttkjertelkreft cellepopulasjon, så monoklonalt dyrking ble utført (fig. 1A) med kreft i bukspyttkjertelen cellelinje BxPC3. Denne cellelinje ble avledet fra primære loci av pankreatisk adenokarsinom og med typisk epitel morfologi. Etter belagt, en del av cellene døde, mens de øvrige ble holdt levedyktige og dannet kolonier innen 3 dager etter utplating og viste et spektrum kan skjelnes fra hverandre morfologi etter 5-7 dager. På grunnlag av forskjeller i morfologi ble kolonier definert som holoclones, meroclones og paraclones (fig. 1B, C, D) [21]. Holoclones var klynger av homogene, små og tettpakkede celler med jevne og glatte koloni grenseland (Fig. 1B). Paraclones besto av spredte og større celler med fragmentert grense (Fig. 1D). Meroclones utstilt mellom morfologi (Fig. 1C). Disse mophologies ble opprettholdt da størrelsen på kolonier økt. Med parallelle analyser utført med PC3 cellelinje, ble tre typer av kolonier identifisert (fig. S1A, B, C) ved hjelp av morfologi som ligner på de som er avledet fra BxPC3 cellelinje. Kolonien sammensetning var lik i disse to cellelinjer: nesten halvparten av koloniene var meroclones, mens holoclones og paraclones utgjorde om lag 20-30% av koloniene dannet (Fig 1E, Fig S1D..). Derfor er disse dataene indikerte mangfoldet av klonal morfologi i bukspyttkjertelkreft cellepopulasjon.
(A) Skjematisk viser prosedyren for å utlede BxPC3 celleklonal kulturer og funksjonelle analyser. Lavere panelene viser representative holoclones (B), meroclones (C) og paraclones (D) fra BxPC3 kulturer. Alle bildene ble tatt 2 uker etter plating (Bar, 100 pm). På dette tidspunkt ble hver type kolonier telles (E). Resultatene fra gjentatte forsøk (n = 4) er presentert som gjennomsnitt ± sem i histogrammet.
Ulike typer kolonier har differensial kapasiteter for selvfornyelse og langsiktig spredning
siden klonal morfologisk mangfold i kreft i bukspyttkjertelen celler hadde vært indikert, bør den sekundære kolonidannelse kapasitet vurderes. For dette formål, ble celler fra alle tre typer av kolonier isoleres og på ny sådd ut med lav densitet (mindre enn 200 celler per brønn av seks-brønners plate) i flere passasjer. Ved første gangs passasje, de holoclones genererte tilsvarende andeler av sekundære holoclones og meroclones (nesten 50% hver), med begrenset antall (mindre enn 10%) av paraclones (Fig. 2A, Fig. S2A). I parallelle analyser, celler isolert fra meroclones produsert et sjeldent rekke sekundære holoclones men en mye høyere prosentandel av paraclones (Fig. 2C, Fig. S2C). Det ble imidlertid sjeldne celler av paraclones holdt levedyktig etter re-plating og genererte bare sekundære paraclones ved lav frekvens (data ikke vist). Å følge utviklings skjebnen til koloniene, ble typiske kolonier av distinkt type som er valgt for langsiktig kultur. Celler i utvalgte kolonier ble passert rutinemessig ved klonal tetthet under felles stand. For kolonier avledet fra BxPC3 cellelinje, alle 12 holoclones var levedyktige og proliferert robust, mens 12 av 18 meroclones og 13 av 15 paraclones gradvis ble avbrutt (fig. 3) under parallellkultur på 140 dager. Tilsvarende, i løpet av 60 dagers passasje av koloniene avledet fra PC3 cellelinje, 8 av 9 holoclones var i sterk ekspansjon, mens fire av åtte meroclones og 6 av 8 paraclones redusert i kort periode (fig. S3). Interessant, bare celler avledet fra holoclones regenerert hele spekteret av oberst morfologiske fenotyper og restaurert proporsjonene av hver type kolonier (Fig. 2B, Fig. S2B) ligner på proporsjonene observert i usorterte foreldrecelle linjer under kultur lav tetthet. Basert på den distinkte utseende utstilt ovenfor, kapasiteten på langsiktige selvfornyelse
in vitro
hovedsakelig bosatt i holoclones, men ikke meroclones eller paraclones.
Celler isolert fra enkeltkolonier ble belagt på lav tetthet under felles stand. (A) I den innledende avsnittet, holoclones (n = 8), hovedsakelig produsert tilsvarende frekvenser av kommer holoclones og meroclones, mens mye lavere prosenter av paraclones ble generert. (B) Etter passasjer av en måned, holoclones (n = 8) genererte hele spekteret av avkoms kolonier på frekvenser som ligner de beholdes i usorterte foreldrecellelinjer. (C) Meroclones (n = 8), hovedsakelig produsert paraclones og meroclones, og få holoclones ble generert.
Holoclones (n = 12, rød linje), meroclones (n = 18, grønn linje) og paraclones (n = 15, blå linje) ble dyrket i vanlig tilstand i 20 uker og liv spenner fra hver koloni ble registrert. De fleste av de meroclones og paraclones ble avbrutt etter hvert, mens alle holoclones forble levedyktig (p 0,01).
Holoclones, men ikke meroclones eller paraclones, initiere tumordannelse og støtte svulst serietransplantasjon i NOD /SCID-mus
for robustheten holoclones hadde blitt vist
in vitro
, var det viktig å evaluere
in vivo
tumorgenecity av tre typer kolonier. For å estimere tumordannelse kapasiteten av hver type av kolonien, ble serietransplantasjons analyser utført. For det første, usorterte BxPC3 celler initieres tumordannelse på en doseavhengig måte. 100% av musene injisert med 10
6 eller 10
5 BxPC3 celler utviklet xenografttumorer etter 14 dager, og mus injisert med 10
4 eller 10
3-celler også utviklet xenografttumorer etter 21 dager med 100% effektivitet (tabell 1). Etter dette ble tre holoclones, tre meroclones, og to paraclones plukket ut for transplantasjon. 10
4 holoclone celler dannet palpable tumorer i 100% av musene (15 av 15 mus) i løpet av 18 dager. Tvert imot, ble ingen synlige svulster dannet av celler fra mero- eller paraclones (0 av 36 mus, 10
4~10
5 celler per mus) innen 2 måneder (tabell 1). I et steg videre, celler i xenografttumorer avledet fra holoclones ble deretter renset og re-transplantert til NOD /SCID mus (10
4 celler per mus). I løpet av 18 dager, alle resipientmus (18 av 18 mus) som er utviklet palpable tumorer (tabell 1). Serielle transplantasjons analyser ble også utført på PC3 cellelinje. Usortert foreldrenes cellelinje, 3 holoclones, 2 meroclones og 2 paraclones ble ansatt. Alle holoclones avledet fra PC3 cellelinje var i stand til å utvikle svulst utelukkende i kort ventetid (tabell S3)
Exnograft svulster avledet fra usortert BxPC3 cellelinje og tilhørende holoclones ble analysert med H . E farging. De histologiske karakteristika xenograft tumor speciments ble visualisert og viste høy grad av likhet mellom tumorprøver fra usortert cellelinje (Fig. S4A, B) og tilsvarende holoclones (fig. S4C, D).
Med den betydelige forskjell av svulstdannelse kapasitet blant distict typer kolonier, ble det foreslått at svulsten-initiering kapasitet
in vivo
ble beriket i holoclones stedet meroclones eller paraclones.
Cancer stamceller relatert overflatemarkører, gener og microRNAs er forskjellig uttrykt i forskjellige typer kolonier
Basert på egenskapene til holoclones
in vitro Hotell og
in vivo
, var det nødvendig å analyse uttrykk for celle flatt underlag materialer markører og regulatorer assosiert med kreft stamceller i tre typer kolonier. Derfor ble flow-cytometri og kvantitativ RT-PCR anvendes på samme tid. Flow-cytometri analyser viste at CD133 var negative (fig. 4A) og CD44 var positive (fig. 4C) i holoclones, meroclones og paraclones. Alle typer kolonier inneholdt både CXCR4
+ og CXCR4
– celler, men de prosentene av CXCR4
+ celler var mye høyere i holoclones enn i meroclones og paraclones (fig 4B.). Den CD24 intensitet (fig. 4D, fig. S5) var betydelig sterkere i paraclones enn i holoclones. Lignende resultater ble oppnådd med kvantitativ RT-PCR.
CD133
var ikke oppdages og
CD44
viste mindre enn 1,3 ganger av oppregulering i holoclones enn i paraclones (fig. 4E). Men uttrykk for
CD24
i holoclones ble nedregulert for over 5 ganger enn i paraclones (Fig. 4F). Expression nivå av
CXCR4
var omtrent tre ganger høyere i holoclones enn i paraclones (Fig. 4G). Videre Uttrykk for
BMI-en
,
GLI1
,
GLI2
,
GLI3
og en liste av kreftrelaterte microRNAs ble også kvantifisert.
BMI-en
,
GLI1 Hotell og
GLI2
var oppregulert i holoclones snarere enn i paraclones, mens uttrykk nivå av
GLI3
var ikke signifikant endret mellom tre typer av kolonier (fig. 5A). MicroRNAs var viste forskjellig uttrykt og gruppert i to grupper: en gruppe var oppregulert i holoclones, inkludert
MIR-214
,
MIR-21
,
MIR-221
MIR-222
, og
MIR-155 plakater (figur 5B.); den andre gruppen ble nedregulert i holoclones, inkludert
La-7a Hotell og
MIR-30c
,
Mir-30b
,
MIR-30a
(fig. 5C). Differensial uttrykk for markører og regulatorer foreslår også tendensen at stamcelleegenskaper ble besatt av holoclones fremfor andre to typer kolonier.
Celler isolert fra holoclones, meroclones og paraclones ble undersøkt med flowcytometri for celleoverflatemarkører av kreft stamceller. CD133 (A) var fullstendig negativ i alle tre typer av kolonier. Den CXCR4
+ celler (B) var synlig i alle typer kolonier men betydelig anriket på holoclones. CD44 (C) var sterkt positiv og med liten forskjell mellom forskjellige typer kolonier, mens CD24 (D) ble uttrykt ved et høyere nivå i paraclones enn i holoclones. mRNA nivå av
CD44 product: (E),
CD24 product: (F) og
CXCR4 product: (G) i holo-, mero- og paraclones ble også kvantifisert med real- time PCR (
GAPDH
som intern referanse) og lignende trender ble vist (*, p 0,05).
BMI1
,
GLI1
og
GLI2
ble oppregulert i holoclones, mens uttrykk for
GLI3
viste ingen signifikant endring mellom forskjellige typer kolonier (A). De microRNAs var gruppert i to grupper, som ble forhøyede (B) og undertrykt (C) i holoclones respektivt. Alle uttrykk verdier i forskjellige typer kolonier ble normalisert mot dem i paraclones (*, p 0,05).
Holoclones utstillings mye høyere chemoresistance enn meroclones og paraclones
Det er vel kjent at chemoresistance er en av de viktigste egenskapene til kreftstamceller, så her vi spurte om holocoloes besitte denne evnen. Derfor cellene isolert fra disse tre typer av kolonier og behandlet med gemcitabin og 5-FU under økende konsentrasjon. Blant hele konsentrasjonsområdet testet, overlevelse av celler avledet fra holoclones var betydelig høyere enn de fra meroclones og paraclones (Fig. 6A, B). IC
50 verdi av 5-FU var 2,59 x 10
3 nM i holoclones, som var mye høyere enn for meroclones (1,24 x 10
2 nM) og paraclones (15,10 nM). For å analysere ekspresjonen av genet endring indusert av medikamentbehandling, ble kvantitativ RT-PCR utført med cellen behandles med medikamenter. Etter behandling med 50 nM av 5-FU i 12 timer, uttrykk for narkotika-inntak transportører (
SLC28A1
,
SLC28A2
,
SLC28A3
,
SLC29A1
,
SLC29A2
,
SLC29A3
) var alle oppregulert i paraclones med ingen effekt i holoclones det meste (bare
SLC28A1
ble nedregulert om to ganger) (fig. 6C) .Med den parallelle behandling av gemcitabin, ble tilsvarende responser av disse genene påvist (fig. 6C). Til sammen
SLC28A1 /A2 Hotell og
SLC29A1 /A3
ble oftest oppregulert mer dramatisk i paraclones enn i holoclones etter behandlinger av gemcitabin eller 5-FU. Denne differensialresponsen kan være, i det minste delvis, invovled i variasjonen av chemoresistance blant tre typer av kolonier
Celler isolert fra holoclones, meroclones og paraclones ble behandlet med kjemoterapeutiske medikamenter med økende konsentrasjon:. 1, 5, 10 , 50, 100 nM av gemcitabin (A), eller 5, 10, 50, 100, 500 nM av 5-FU (B). For hver konsentrasjon verdi, ble tre brønner angitt som gjenta i et enkelt eksperiment og tre ganger med representative eksperimenter ble utført. Uttrykket endringer av chemo-inntak transportører ble kvantifisert i holoclones og paraclones etter henholdsvis behandlet med 50 nM chemo-stoffet i 12 timer. (C) (*, p 0,05).
Diskusjoner
I denne studien, viste vi stamcelleegenskaper av holoclones og indikerte at et panel av stamcelle forbundet gener og microRNAs ble fortrinnsvis uttrykt i holoclones. Videre avdekket vi et høyt nivå chemoresistance i holoclones og foreslo den potensielle verdien av holoclones i studiet av kreft stamceller.
Vi er de første til å vise heterogenitet i clonoal morfologi av kreft i bukspyttkjertelen celler. I likhet med virkemåten av keratinocytt [21] og flere cancercellelinjer [18] – [20], da celler fra BxPC3 og PC3 cellelinje ble platet monoclonally, ble en serie av kolonier med forskjellige morfologier utviklet (figur 1A.). Basert på den morfologiske mangfoldet, holoclones (Fig. 1B, fig. S1 A), meroclones (Fig. 1C, Fig. S1B) og parclones (Fig. 1D, Fig. S1C) lett kan identifiseres.
Dess våre resultater indikerer at stammelignende kreftceller ble beriket i holoclones stedet mero- eller paraclones. Under
in vitro
forplantning, celler i holoclones ga en høy andel av avkoms holoclones ved den første runden av passasje (fig. 2A, fig. S2A). Etter flere passasjer, celler i holoclones generert kolonier med hele spekteret av morfologiske egenskaper lik som stammer fra usorterte foreldrecellelinjer (Fig. 2B, Fig. S2B). Imidlertid meroclones generere en begrenset grad av holoclones og mye høyere prosentandeler av paraclones (Fig. 2C, Fig. S2C). Ved langtids passeringer
in vitro
, holoclones viste mer robusthet og konstant spredning, mens mero- og paraclones falt raskt (Fig. 3, fig. S3). Med forskjellene vist ovenfor, forskjellige typer kolonier besatt differensialkapasitet på selvfornyelse og spredning kapasitet. Enda viktigere, holoclones serielt initiert svulst utvikling
in vivo
mens mero- og paraclones ikke (Tabell 1, Tabell S3), som regnes som den mye brukte gullstandard for identifisering av kreftstamceller. Som en uunnværlig supplement, de xenografttumorer avledet fra BxPC3 holoclones viste lignende histologiske karakteristika med de svulstvev avledet fra usortert BxPC3 cellelinje (Fig. S4). I prostatakreft cellelinjer PC3 [19] og DU145 [24], tilsvarende karakteristikker av holoclones
in vitro Hotell og
in vivo
hadde vært indikert og fungerte som bevis for å støtte stamcelle eiendom holoclones.
Videre uttrykk for celleoverflatemarkører, gener og microRNAs blant forskjellige typer kolonier også foreslått stamcelle eiendom holoclones. For det første celleoverflatemarkører for kreft i bukspyttkjertelen stamceller, CD44, CD24, og CD133, ble evaluert. Basert på to uavhengige rapporter, ble bukspyttkjertelkreft stamceller identifisert som befolkningen i CD44
+ CD24
+ ESA
+ eller CD133
+, men disse to populasjonene viste liten overlapp med hverandre [10 ], [11]. I henhold til resultatene av flowcytometri (fig. 4A, C) og kvantitativ RT-PCR (fig. 4E) analyser, ekspresjon av
CD133 plakater (ikke målbart) og
CD44
(sterkt uttrykt) ble begge undistinguishable blant tre typer av kolonier. Ekspresjonen av
CD24
ble nedregulert i holoclones enn i paraclones (fig. 4F, fig. S5), som potensielt kan varieres fra tidligere rapport [10]. I likhet med det uventede uttrykk status for
CD133 product: [11], [25] og
CD24 product: [10] i bukspyttkjertelen cellelinjer BxPC3 og PC3, avvikende uttrykk for
CD133
i en viss cellelinjen ble også rapportert i eggstokkreft cellelinjer OVCAR3 og SKOV3 [26] – [28], som kan i det minste delvis på grunn av noen ubestemte endringer indusert ved langvarig dyrking
in vitro
. Dessuten har CD133- kreft stamceller blitt identifisert i glioma og foreslått som mer primordial drevet kraft for tumorutvikling enn CD133 + cellepopulasjonen [29]. For nærmere vurdering av stamcelleegenskaper av holoclones, ble en rekke gener og mciroRNAs assosiert med kreft stamceller kvantifisert. Blant de genene oppregulert i holoclones,
BMI1 plakater (Fig. 5A) har vist seg å spille nøkkel regulerende rolle i selvfornyelse av nevral [30], bryst [31], blodkreft [32] stamceller og flere typer kreft stamceller [31], [33], [34]. Hva mer,
BMI1
arrangøren har blitt brukt til å drive EGFP som en intracellulær markør for å berike blodkreft stamceller [35]. I likhet med våre resultater,
BMI1
hadde nylig blitt rapportert fortrinnsvis uttrykt i holoclones avledet fra glioma cellelinje [20]. Høyden av
GLI1 Hotell og
GLI2
i holoclones (Fig. 5A) tyder på økt aktivitet av Hedgehog signalering, som var i samsvar med høyere nivå av
SHH
uttrykk i CD44
+ CD24
+ ESA
+ kreft stamceller isolert fra humane primære kreft i bukspyttkjertelen prøver [20]. The Hedgehog signalveien spiller også en viktig rolle i å opprettholde kreftstamceller i bryst [31] og hjernen [36].
CXCR4
, den sentrale formidler av metastaser, var oppregulert i holoclones (Fig. 4B, G) også. I CD133
+ bukspyttkjertelkreft stamceller, er CXCR4
+ undergruppe mer invasive enn autolog CXCR4
– undergruppe [11]. Blant microRNAs oppregulert i holoclones,
MIR-214
,
MIR-221
,
MIR-222 Hotell og
MIR-155 plakater (fig. 5B) ble ofte overuttrykt i brystkreft stamceller [37]. Men
La-7a plakater (Fig. 5C), som var signifikant nedregulert i holoclones, spiller en negativ rolle i selv revewal, tumorigenitet, og chemoresistance av brystkreft stamceller [12]. Tilsvarende MIR-30a /b /c (Fig. 5C) ble også overexpressed i paraclones. I brystkreft, hemmer dette mikroRNA familie selv fornye av stamceller, induserer apoptose, og reduserer spredning til lungene [38].
Høyere chemoresistance ble indikert i holoclones snarere enn i meroclones og paraclones (Fig . 6A, B), som er i overensstemmelse med den støttende rolle av kreft stamceller i chemoresistance tidligere rapportert [11], [13]. I samsvar med den robuste chemoresistance i holoclones, gener og microRNAs som opprett chemoresistance, inkludert
BMI1 product: [39],
GLI1 /2 product: [40],
CXCR4 product: [41 ],
MIR-214 product: [42],
MIR-21 product: [43], og
mir-155 product: [44] (fig. 4G, fig. 5A, B) ble oppregulert i holoclones. I respons til medikamentelle behandlinger, ekspresjon av medikament-inntak transportører, hvorav den høyere ekspresjonsnivået var korrelert med lengre overlevelse av pasienter [45] – [48], ble indusert i paraclones fortrinnsvis (figur 6C.). Dette betyr at stoffet i-take vil bli økt raskere i paraclones enn i holoclones. Dette kan være en av de potensielle opprinnelsen til fortrinnsrett overlevelse av kreft stamceller versus ikke-stilk kreftceller i kjemoterapi.
Til sammen kan koloniene med forskjellige morfologi og i ulike stadier av differensiering tjene som en potensiell modell for analyse av kreft stamceller (fig. 7). Med denne modellen, kan gener og microRNAs potensielt korrelerte med kreft stamceller bli identifisert. Enda viktigere, kan parallell evaluering av chemotheraputic legemidler utføres på kreft stamceller og autologe ikke-stilk kreftceller. Dette betyr at den klonale morfologier cancer stamcelle modell vil være nyttig for å lede til den nyere forståelsen av chemoresistance, som bør være ganske forskjellig fra de som oppnås fra heterogene kreftcellepopulasjoner, og vil være nyttig for å overvinne den chemoresistance i cancerterapi.
kreft i bukspyttkjertelen stamceller og deres etterkommere i differensiering kan utvikle seg til enkeltkolonier med ulike morfologi. Basert på in vivo og in vitro egenskaper, Holoclones tilsvarer de kreft stammen /stamceller, mens paraclones tilsvare de fullt differensierte celler og meroclones svarer til cellene i mellomtrinnet. Genene og microRNAs som forbinder med kreft stamceller og støtter chemoresistance, inkludert
BMI1
,
GLI1 /2
,
CXCR4
,
mir-21/214 /221/222/155
, er anriket i holoclones. Men
La-7 Hotell og
mir-30a /b /c
anrikes i paraclones.
Materialer og metoder
Cell linjer
Menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje BxPC3 (kjøpt fra Cell Bank of China Academy of Sciences, Shanghai, Kina) og PC3 ble (kjøpt fra Kina Union Medical Collage, Beijing, Kina) dyrket i RPMI-1640 (Hyclone ) med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Hyclone) og passert som 1:10 med 0,25% trypsin /EDTA (Hyclone). Disse cellelinje ble etablert fra primær bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom og med typisk epitel morfologi [22], [23]. BxPC3 [22] ble hentet fra europeisk avstamning og PC3 [23] var avledet fra kinesisk.
Kjemiske stoffer
Frysetørket pulver av gemcitabin (Lilly) ble oppløst i Kalsium /Magnesium gratis PBS (Hyclone ) og lagret ved -20 ° C med konsentrasjon på 4 mg /ml. 5-FU-løsning (Roche) ble lagret ved -20 ° C med konsentrasjon på 25 mg /ml. Før bruk, ble stocks fortynnet til arbeids konsentrasjoner (5, 10, 50, 100, og 500 nM for 5-FU, og 1, 5, 10, 50, og 100 nM for Gemcitabin) med kulturmedium.
Dyr
Alle forsøkene ble godkjent av Animal Care og bruk komité Peking University (godkjenningsnummer var IRB00001052-09051). NOD /SCID-mus ble kjøpt fra Experimental Animal Sciences Center of Peking University og vedlikeholdes i standard tilstand i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Enkelt celle kloning
Celler ble høstet ved 70% ~80% av samløpet med Accumax (Chemicon) og resuspendert i medium uten serum. Enkelt celle ble sådd ut i hver brønn av 96-brønners plater med MoFlo flowcytometri (DakoCytomation). To dager etter plettering ble 96-brønners plater sjekket med mikroskopi. Wells inneholder bare en levedyktig cellen ble markert. Og så, medium ble fornyet hver 3. dag. Kolonier ble klassifisert som holo-, mero- og paraclones henhold til deres morfologi. 14 dager etter flow-cytometri sortering, ble typiske kolonier valgt for videre forsøk.
tumorcelle implantasjon
Valgte kolonier ble utvidet og høstet med Accumax (Chemicon), telles og resuspendert i 01:01 blanding av RPMI-1640 og Matrigel (BD). Alikvoter av cellesuspensjonen ble injisert subkutant inn i dorsolateral del av NOD /SCID-mus. Tumor latens (dvs. tiden fra injeksjon til deteksjon av palpable tumorer) ble bestemt. I løpet av 9 uker etter implantering, ble tumorbærende musene avlivet. I mellomtiden ble xenografttumorer dissekert ut kirurgisk og veies. Mus med ingen tegn til tumorbyrden ble holdt i minst 9 uker siden implantering og deretter undersøkt på necroscopy for å bekrefte at de var tumor-fri.
For serietransplantasjon, ble xenografttumorer hakket i små biter med saks, suspendert i M199 medium, og behandlet ved 37 ° C i ca. 3 timer med 200units /ml ulturapure collagenas IV (Worthington Biochemicals). Ytterligere mekanisk fordøyelse ble utført med en 25 ml pipette hvert 15. minutt. Etter fordøyelse, ble cellesuspensjonen filtrert gjennom en 40 um nylonnett og forsiktig applisert på det øverste laget av Histopaque-1077 gradient (Sigma-Aldrich) (1~3 x 10
6 celler /ml Histopaque anvendes i totalvolumet av 3 ml) og deretter sentrifugert ved 400 x g i 30 minutter ved romtemperatur. Levedyktige kjerneholdige celler ble samlet i grensesnittet, mens røde blodlegemer, døde celler og rusk ble eliminert. Den høstet enkeltcellesuspensjon ble anvendt for transplantasjon som beskrevet ovenfor.
kjemoresistent assay
Celler fra den samme type kolonier ble høstet, slått sammen og utsådd i 96-brønners plater med densitet 5000 celler /brønn. 24 timer senere, medium ble fornyet og midler (gemcitabin eller 5-FU) ble tilsatt.
