Abstract
Mål
Behandling av tykktarmskreft (CRC) er fortsatt en klinisk utfordring, som mer enn 15% av pasientene er resistente mot 5-Fluorouracil (5-FU) -basert kjemoterapeutiske regimer, og tumor tilbakefall kan være så høyt som 50-60%. Cancer stamceller (CSC) er i stand til å overleve konvensjonell kjemoterapi, som tillater regenerering av originale tumorer. Derfor undersøkte vi effekten av 5-FU og anlegg polyphenol (curcumin) i sammenheng med DNA mismatch reparasjon (MMR) status og CSC aktivitet i 3D kulturer av CRC celler.
Metoder
Høy tetthet 3D kulturer av CRC cellelinjer HCT116, HCT116 + CH3 (supplert med kromosom 3) og deres tilsvarende isogene 5-FU-chemo-resistente avledede kloner (HCT116R, HCT116 + ch3R) ble behandlet med 5-FU enten uten eller med curcumin i tids- og doseavhengig analyser.
Resultater
Forbehandling med curcumin økt betydelig effekt av 5-FU på HCT116R og HCR116 + ch3R celler, i motsetning til 5-FU alene som dokumentert av økt oppløsningen av colonospheres, forsterket apoptose og ved å hemme veksten. Curcumin og /eller 5-FU sterkt påvirket MMR-mangel CRC celler i kulturer med høy tetthet, men MMR-dyktig CRC cellene mer følsomme. Disse effektene av curcumin i å forbedre kjemosensitivitet til 5-FU ble videre støttet av sin evne til å effektivt undertrykke CSC bassenger som dokumentert av redusert antall CSC markør positive celler, fremhever egnethet 3D kulturmodell for vurdering av CSC markør uttrykk i et nært
vivo
setting.
Konklusjon
Våre resultater viser nye og tidligere ikke effektene av curcumin i å forbedre chemosensitization til 5-FU-basert kjemoterapi på DNA MMR-mangelfull og deres chemo -resistente kolleger ved å målrette den CSC sub-befolkningen. (246 ord i sammendrag)
Citation. Shakibaei M, Buhrmann C, Kraehe P, Shayan P, Lueders C, Goel A (2014) curcumin Chemosensitizes 5-Fluorouracil Resistente MMR-Mangelmenneske Colon kreft celler i High tetthet kulturer. PLoS ONE 9 (1): e85397. doi: 10,1371 /journal.pone.0085397
Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore
mottatt: 25 oktober 2013; Godkjent: 27 november 2013; Publisert: 03.01.2014
Copyright: © 2014 Shakibaei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje hyppigste. kreft påvirker menn og kvinner likt over hele verden [1]. Eksisterende behandling for behandling av kolorektal cancer i hovedsak består av 5-fluorouracil-baserte kjemoterapier som brukes enkeltvis eller i kombinasjon med oxaliplatin (FOLFOX) eller anti-angiogene midler, og /eller anti-epidermale vekstfaktor midler [2]. Selv om tykktarmskreft forekomst har gått noe ned, er dagens behandlingsformer forbundet med betydelige bivirkninger, høye kostnader og gjentakelse priser i overkant av 50%, hovedsakelig på grunn av utviklingen av ervervet chemoresistance til konvensjonelle kjemoterapeutika [3], [4]. Disse begrensningene markere viktig og presserende behovet for å identifisere og utvikle nye og trygge behandlingsstrategier som kan hjelpe overvinne chemoresistance og forbedre tumor celle respons på anti-svulst narkotika.
Karsinogenese antas å være en flertrinnsprosess som resulterer fra en trinnvis oppbygging av genetiske endringer i forskjellige gener (f.eks metastase-assosierte gener, onkogener, tumorsuppressorgener) som fører til progressiv omdannelse av friske celler til tumorceller [5], [6]. Det er nå videre anerkjent, at epigenetiske endringer slik som avvikende DNA-metylering, histonmodifikasjonene, kromosom ombygging og skade på mismatch reparasjon (MMR) system, også markert innflytelse CRC utvikling, [5], [7]. Skader på MMR systemet bevirker genetisk ustabilitet som det er viktig for bevis lesing DNA-syntese feil i løpet av replikasjon, noe som fører til endrede celle fenotyper, økt mottakelighet for neoplastisk transformasjon og legge til rette for utvikling av chemo-resistente celler [8], [9].
i løpet av tumorigenese og tumorspredning inkludert tykktarmskreft, kreft celler krever selvfornyelse evne, lik den som oppvises av stamceller. Det er nå vidt akseptert som kreft patogenesen i de fleste tumorer, inkludert CRC, er drevet av en undergruppe av tumorceller som oppviser stamcelle har lignende egenskaper som fysiologiske stamceller, inkludert selvfornyelse evner og pluripotency [10], [11], og at disse kreft stamceller (CSC) har potensial til å invadere og danne fjern metastase [12], [13], [14]. I tykktarmen, disse colonic CSC abnormt skille generere et hoveddelen av tumorceller med den større del består av mer differensierte celler og en liten brøkdel av stamceller, som til slutt erstatter de friske kolon stamceller og hele colonic krypten er kolonisert av kreft stammen celler og deres avkom [10]. Et sett av spesifikke markører er identifisert for colonic CSC, inkludert CD133
+, CD 44
+, CD166
+ og ALDH1
+ [15], [16]. Tilbakefall av tumorer etter tilsynelatende vellykket kjemoterapi er antatt å være på grunn av chemo-resistent cscs som omgår hjel av kjemoterapeutiske medikamenter [17]. Derfor nye terapeutiske midler som kan lykkes målrette cscs, er svært sannsynlig den mest lovende terapeutisk strategi for å møte denne enorm klinisk utfordring.
Emerging litteratur tyder på at mange kosttilskudd komponenter kan direkte eller indirekte regulerer betennelsesresponser i tarmen ved å modulere intestinal barrierefunksjonen [18]. Videre har flere naturlig forekommende ernæringsmessige forbindelser er vist som anti-kreft terapeutiske midler [19], [20], [21], [22]. Faktisk bevis dukker opp at konvensjonell kjemoterapi i CRC betydelig fordeler gjennom kombinatoriske behandlinger med noen av disse naturlig forekommende kosttilskudd polyfenoler [5], [23], [24]. En slik botaniske, curcumin (diferuloylmethane), en gul krydder avledet fra rotstokker av
curcuma longa
, har en lang tradisjon som en anti-inflammatorisk agent i tradisjonell indisk ayurvedisk system av medisin. I tillegg har flere studier vist at curcumin virker som en potent og kjemo- radiosensitizer på flere humane krefttyper [25], [26] og kan hemme cellevekst av MMR-systemet manglende tykktarmskreftceller [27], [28]. I en tidligere studie, viste vi at curcumin forbedret kjemosensitivitet av 5-FU i tykktarmskreft cellelinjer ved å målrette NF-kB, Src og NF-kB-avhengige regulerte genprodukter [5]. Videre har det vist seg at målretting tykktarmskreftceller med 5-FU og oxaliplatin (FOLFOX) i kombinasjon med curcumin dempes EGF-R, IGF-1R og Akt-signalreaksjonsveien og markert redusert kreft stamcelle markør-positive celler og som skyldes desintegrasjon av colonospheres [ ,,,0],23], [24].
Vi har nylig vist at kombinert behandling av curcumin med 5-FU induserer mer betydelig cytotoksisitet i DNA MMR-mangel CRC monolagkulturer, i forhold til hver agent individuelt [5]. Følgelig er målet med denne studien var å undersøke om curcumin alene eller i kombinasjon med 5-FU kan påvirke DNA MMR-mangeltykktarmskreftceller som er iboende resistent mot 5-FU i moduler colonosphere dannelse og CSC aktivitet i 3D kulturer.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
menneske~~POS=TRUNC (HCT116, MMR-mangel) ble hentet fra europeiske Innsamling av cellekulturer (Salisbury, UK). HCT116 + CH3, er en MMR-dyktig cellelinje, som ble opprettet i vårt laboratorium ved stallen transfeksjon av kromosom 3 bærer en vill-type kopi av
hMLH1
genet, som beskrevet tidligere [29]. Vi har også generert 5-FU resistente derivater av disse cellelinjer, referert til som HCT116R og HCT116 + ch3R henholdsvis, som ble opprettet av repeterende behandling av foreldrecellelinjer til økende konsentrasjoner av 5-FU over en 10-12 måneders periode. Både paren og 5-FU-resistente cellelinjer ble brukt for å undersøke effekten av individuelle og kombinerte 5-FU og curcumin behandlinger. Cellene ble holdt i vevskulturflasker i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, 4,5 g /L D-glukose) supplert med 10% FBS og 1% antibiotisk /antimykotisk i en fuktet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft og 5% CO
2. Mediet ble skiftet hver tredje dag, og cellene ble passert ved hjelp av Trypsin /EDTA.
Antistoffer
Monoklonale antistoffer mot ALDH1 ble kjøpt fra acris Antistoffer GmbH (Herold, Tyskland). Monoklonale antistoffer mot CD133 og CD44 ble kjøpt fra Abcam PLC (Cambridge, UK). Antistoffer p-aktin (A5316) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Monoklonale anti-PARP [poly (ADP-ribose) polymerase] (7D3-6) antistoff ble kjøpt fra Becton Dickinson (Heidelberg, Tyskland). Alkalisk fosfatase bundet sau anti-mus og sau anti-kanin sekundære antistoffer for immunblotting ble anskaffet fra Millipore (Schwalbach, Tyskland). Alle antistoffer ble brukt ved konsentrasjoner og fortynninger anbefalt av produsenten.
Vekst Media, kjemikalier, og Cytokiner
Vekst medium (Hams F-12 /Dulbeccos modifiserte Eagle medium (50:50) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 25 ug /ml askorbinsyre, 50 IU /ml streptomycin, 50 IU /ml penicillin, 2,5 ug /ml amfotericin B, essensielle aminosyrer og L-glutamin) ble oppnådd fra Seromed (Munchen, Tyskland). Trypsin /EDTA (EC 3.4.21.4) ble kjøpt fra Biochrom (Berlin, Tyskland). Epon ble hentet fra Plano (Marburg, Tyskland). 5-FU ble innkjøpt fra Sigma (Munchen, Tyskland). Curcumin (BCM-95) var en sjenerøs gave fra Dolcas Biotech (Landing, NJ, USA). Curcumin ble fremstilt ved å oppløse det i dimetylsulfoksyd (DMSO) ved en stamkonsentrasjon på 5000 pM, og lagret ved -20 ° C. Seriefortynninger ble fremstilt i kulturmedium.
A 100 mM lager av 5-FU ble fremstilt i absolutt DMSO og lagret ved -20 ° C. Konsentrasjonen av DMSO var mindre enn 1% av medikamentbehandling. For behandling, ble 5-FU fortynnet i DMEM og tilsatt til kulturene for å gi den ønskede sluttkonsentrasjon. Etter 70-80% konfluens, ble cellene behandlet med 5-FU eller curcumin enkeltvis, eller deres kombinasjon.
celleviabilitet Assay
Cellelevedyktigheten ble evaluert av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) opptak metode som tidligere beskrevet [30]. I korthet, HCT116, HCT116 + CH3-celler og 5-FU chemo-resistente cellelinjer ble sådd i en 96-brønns plate (1000 per brønn) og utsatt for forskjellige konsentrasjoner av individuelle 5-FU eller curcumin i triplikat for de angitte tidsperioder for å oppnå IC
50-verdier (50% vekst celle inhiberende konsentrasjon). I tillegg, i et annet sett av eksperimenter ble celler forbehandlet med 5 uM curcumin i 12 timer og deretter ko-behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 uM) i 24 timer for å oppnå optimal dose for kombinasjonsbehandling. Cellene ble vasket to ganger med PBS og deretter, MTT-løsning (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn og platen ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Lyseringsbuffer (20% SDS og 50% dimetylformamid) ble tilsatt, og cellene ble inkubert over natten ved 37 ° C. Absorbansen av cellesuspensjonen ble målt ved 570 nm (OD570) ved bruk av Åp 96-brønns multiscanner plateleser (Bio-Rad Laboratories Inc. Munchen, Tyskland). De oppnådde data ble beregnet, og var representert i prosent av overlevelse sammenlignet med kontrollene. Dette eksperimentet ble gjentatt 3 ganger uavhengig av hverandre, og statistisk analyse ble gjort for å få de endelige verdiene.
Dannelse og Hemming av Colonosphere Colonies
For svulst colonosphere dannelse analyse, 10 mL dråpe, ca 2 millioner cellene ble HCT116, HCT116 + CH3 og deres respektive 5-FU chemo-resistente avledede cellelinjer sådd ut på et cellulosefilter på toppen av et stålnett bro [31]. Cellekulturmediet nådde filtermediet grensesnitt og cellene ble næres ved diffusjon. Denne modellen gjør at cellene til å samle, og danner en distinkt pellet, som ble undersøkt etter 1-10 dager. Den HCT116, HCT116 + CH3 og deres respektive 5-FU chemo-resistente cellelinjer ble behandlet med curcumin (20 uM), 5-FU (5 uM) eller deres kombinasjon (curcumin 5 uM og 5-FU 0,1 pM) i 1, 3, 7 og 10 dager, henholdsvis. Anvendt konsentrasjon ble beregnet, og representert i prosent overlevelse i forhold til ubehandlede kontroller. IC
50 ble definert som den medikamentkonsentrasjon som kreves for å inhibere HCT116, HCT116R eller HCT116 + CH3 og HCT116 + ch3R med 50% i forhold til kontrollene. IC
50-verdier ble beregnet fra doseresponskurven. Data ble avledet fra minst tre uavhengige eksperimenter. Colonosphere dannelse ble bedømt ved lysmikroskopi, DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole, Sigma) og elektronmikroskopi.
transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
Elektronmikroskopi ble utført som tidligere beskrevet [32]. I korthet, høy tetthet cellekulturer, som ble behandlet som beskrevet ovenfor, ble løst i 1 time i Karnovsky sin fikseringsmiddel, etterfulgt av post-fiksering i 1% OsO
4-løsning. Etter dehydrering i en stigende alkohol-serien, ble kulturene innebygd i Epon og kutte supertynn med en Reichert-Jung ULTRACUT E (Darmstadt, Tyskland). Seksjoner ble sammenlignet med en blanding av 2% uranylacetat /bly-citrat og undersøkt med et transmisjonselektronmikroskop (TEM 10, Zeiss, Institutt for farmakologi Berlin, Tyskland).
Kvantifisering av Mitokondriell endringer (MC) og apoptotiske celledød
ultratynne deler av prøvene ble fremstilt og undersøkt med et elektronmikroskop (TEM 10, Zeiss, institutt for farmakologi Berlin, Tyskland). For å kvantifisere MC og apoptotiske celler, ble antall celler med morfologiske trekk ved apoptotisk celledød bestemt ved å score 100 celler fra 25 forskjellige mikroskopiske felt.
DAPI farging for apoptotiske celler
Kromatin kondens og apoptotiske celler ble undersøkt ved hjelp av nukleær farging med DAPI (4 «, 6»-diamidino-2-fenylindol, Sigma), som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt ble de høye kulturer tetthet nedsenket i O.C.T. innstøpningsmediet og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Åtte til ti mikrometer tykke seksjoner ble kuttet. Snittene ble fiksert med metanol i 30 minutter ved 4 ° C i mørket. Deretter ble kulturene vasket to ganger med PBS, og deretter ble 1 pl av DAPI-oppløsning (5 mg /ml) i fem ml PBS ble spredt over kulturene, etterfulgt av inkubering i 20 min i mørket. Merkede celler ble vasket gjentatte ganger med PBS for å fjerne overskudd av DAPI flekken, dekket med fluoromount mountant og evaluert under et fluorescens mikroskop (Leica, Tyskland). Eksperimenter og analyser ble utført i tre eksemplarer.
Western Blot analyse
For å bestemme virkningen av curcumin, 5-FU eller curcumin /5-FU på spaltning av PARP og ekspresjonen av kreft stamcelle (CSC) markører, helcellelysater ble fremstilt og fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE [33]. I korthet ble cellene renset i PBS, og proteinene ble ekstrahert med lyseringsbuffer (50 mM Tris /HCl (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM natriumortovanadat, 50 mM natriumpyrofosfat, 100 mM natriumfluorid, 0,01% (volum /volum) aprotinin, pepstatin A (4 ug /ml), leupeptin (10 ug /ml), og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)) i 30 minutter på is. Etter justering av den totale proteinkonsentrasjon, like mengder (500 ug protein pr kjørefelt) av totale proteiner ble separert ved SDS-PAGE (7,5% eller 12% geler) under reduserende betingelser. Separerte proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner og inkubert i blokkeringsbuffer (5% (w /v) skummet melkepulver i PBS, 0,1% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur. Membraner ble inkubert over natten med det primære antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer ved 4 ° C på en ristemaskin, ble vasket 3 ganger med blokkerende buffer, og deretter inkubert med det sekundære antistoff konjugert med alkalisk fosfatase i 90 minutter ved romtemperatur. Membranene ble vasket 3 ganger i 0,1 M Tris (pH 9,5) inneholdende 0,05 M MgCl
2 og 0,1 M NaCl. Til slutt ble det spesifikke antigen-antistoffkompleksene påvist ved anvendelse av nitro tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indoylphosphate (
p
-toluidine salt; Pierce, Rockford, IL, USA) som substrater for alkalisk fosfatase.
Statistical Analysis
Tall data er uttrykt som middelverdier (+/- SD) for et representativt eksperiment utført i tre eksemplarer. Midlene ble sammenliknet med Student
t
test forutsatt like avvik. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant hvis
p
verdien var mindre enn 0,05.
Resultater
Menneske MMR-mangelfulle og -proficient CRC celler (HCT116, HCT116 + ch3 ) og deres respektive 5-FU chemo-resistente avledede cellelinjer (HCT116R, HCT116 + ch3R) ble anvendt i vår studie for å undersøke effekt av curcumin og /eller 5-FU på celle-levedyktighet, apoptose og kreft stamceller (CSC) i kulturer med høy tetthet.
MMR- Mangel CRC celler og deres respektive 5-FU resistente celler er følsomme for curcumin
Den cytotoksiske effekten av 5-FU eller curcumin på fire tykktarmskreft cellelinjer ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM) eller curcumin (0, 1, 5, 10 og 20 uM) og cellelevedyktigheten ble undersøkt ved MTT-analysen (fig. 1A 0,05. Betydelige verdier er merket med (*).
For å evaluere celle følsomhet for kombinasjonen av curcumin og 5-FU behandling, forbehandlet vi HCT116, HCT116 + CH3 og de respektive 5-FU chemo-resistente celler først med 5 uM curcumin etterfulgt av behandling med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU (0, 0,1, 1, 2 og 4 uM) i 24 timer (fig. 1C). MTT-analyser ble utført og IC
50-verdier ble bestemt. Resultatene viser at curcumin betydelig forbedret cytotoksisiteten av 5-FU for begge cellelinjer (HCT116 og HCT116 + CH3) på omtrent 0,1 uM 5-FU (Fig. 1C). Interessant, forbehandling med 5 uM curcumin redusert IC
50-verdier for 5-FU til 2 uM i 5-FU-resistente HCT116R og HCT116 + ch3R cellelinjer (p 0,05, Fig. 1C). Disse resultater antyder at DNA MMR-mangelfull HCT116R og DNA MMR-dyktig HCT116 + ch3R celler forbehandlet med curcumin var mer følsomme for 5-FU enn celler behandlet med 5-FU alene og innføring av kromosom 3 i HCT116-celler viste en økt sensitivitet av cellene til behandling med 5-FU og /eller curcumin i forhold til de HCT116 cellene.
curcumin og /eller 5-FU Dempe Colonosphere Vekst av MMR-mangel CRC celler og deres respektive 5-FU resistente celler i High density kulturer
for å evaluere effekten av 5-FU og /eller curcumin, enten alene eller i kombinasjon av størrelsen på colonospheres, et fremtredende trekk ved kreft stamceller [34], tredimensjonale høy tetthet kulturer [31] i HCT116 og de tilsvarende chemo-resistente cellelinjer ble utført (fig. 2A-C).
tetthet kulturer av HCT116 (A) eller HCT116R (B) celler Høye var enten ubehandlet eller var behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM), eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 uM). Kulturer ble evaluert etter 1, 3, 7 og 10 dager, og bilder av de innfødte kulturer tatt. Bildene er representative for tre individuelle eksperimenter. Colonosphere størrelse ble målt og resultatene som presenteres er gjennomsnittsverdier med standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter. C: tetthet kulturer Høye av HCT116, HCT116 + CH3 og deres respektive 5-FU-kjemoresistent celler ble enten ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 mm), curcumin (20 mm), eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 mm). Kulturer ble bedømt etter 10 dager, ble colonosphere størrelse målt, og resultatene presentert er middelverdier med standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikante verdier er merket med (*).
I ubehandlede kontrollkulturer, viste resultatene at både HCT116 og HCT116R celler dannet sfæroide kolonier, med en tidsavhengig økning i størrelsen av colonospheres under 10 dagers periode (fig. 2A, 2B). Behandling av HCT116 kulturer med 5-FU alene, i motsetning til deres tilsvarende 5-FU-resistente HCT116R cellelinje, dramatisk redusert størrelsen på colonospheres sammenlignet med de tilsvarende kontroller (fig. 2A, 2B). Som forventet, behandling av 5-FU resistente celler med 5-FU enkeltvis ikke har en negativ effekt på colonosphere størrelse (Fig. 2B). I motsetning til dette, i kulturer behandlet med curcumin alene og /eller 5-FU, den colonosphere størrelse ble signifikant redusert sammenlignet med de tilsvarende kontroller (fig. 2A, 2B, 2C). Behandlingen med curcumin alene eller kombinasjonsbehandling ble vist å være meget effektive i å inhibere sfære dannelsesevne av alle fire CRC-cellelinjer. Størrelsene på colonospheres i med curcumin behandlede gruppene var signifikant mindre sammenlignet med kontrollgruppene, noe som indikerer at a) curcumin i seg selv undertrykt colonosphere størrelse i DNA-MMR mangel HCT 116 celler, og b) curcumin sensibilisert HCT116R og HCT116-celler + ch3R til 5- FU-indusert cytotoksisitet (fig. 2A, 2B, 2C). Ved slutten av forsøksperioden (10 dager), kan det observeres at mens kontrollcellene som dannes velutviklet colonospheres, 5-FU-resistente CRC-celler eksponert for curcumin alene eller i kombinasjon behandling viste betydelig mindre sfæroide formasjonen (fig. 2C). Tatt sammen indikerer disse resultater at colonoshere størrelse ble markert redusert i kulturer med høy tetthet som ble behandlet enten med curcumin alene eller i kombinasjon av curcumin og 5-FU, noe som indikerer en colonosphere inhiberende effekt av curcumin og /eller 5-FUon HCT116, HCT116 + CH3 og deres respektive 5-FU resistente derivater.
Curcumin og /eller 5-FU Øk Cytotoksisitet av Colonospheres av MMR-mangel CRC celler og deres respektive 5-FU resistente celler i High Density kulturer
for å undersøke hvorvidt den colonosphere formasjonen-hemmende effekt av curcumin og 5-FU i HCT116, HCT116 + CH3, er HCT116R og HCT116 + ch3R cellelinjer relatert til induksjon av apoptose, ble behandlede celler evaluert ved anvendelse av DAPI farging, noe som viste at apoptotiske legemer som inneholder atom fragmenter og kromatin kondensasjon ble samlet i løpet av den apoptotiske basseng av celler (fig. 3A, 3B). Faktisk, inkubering av HCT116 og HCT116R cellene i serum-sultet medium resulterte i dannelse av colonosphere i løpet av en periode på 10 dager. Imidlertid inkubasjon av HCT116 og HCT116R celler med 5-FU, curcumin, eller curcumin sammen med 5-FU i 10 dager resulterte i en klar oppløsning av colonosphere (r) sammenlignet med deres tilsvarende kontroller (fig. 3A, 3B). Høyeste oppløsningen ble observert i respons til en kombinasjon av curcumin og 5-FU i HCT116 + CH3 og HCT116 + ch3R cellelinjer (Fig. 3A, 3B).
kulturer høy tetthet av HCT116, HCT116 + CH3 (A ), eller HCT116R og HCT116 + ch3R (B) var enten venstre ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 mm), curcumin (20 mm), eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 mm). Kulturer ble bedømt etter 1, 3, 7 og 10 dager, og farget med Hoechst 33258 (DAPI) for å avsløre apoptotiske endringer av cellekjerner. Bilder er representative for tre individuelle eksperimenter.
Curcumin Forbedrer 5-FU-mediert apoptose av MMR-mangel CRC celler og deres respektive 5-FU resistente celler i High Density kulturer
Å undersøke hvorvidt den veksthemmende effekt av curcumin og 5-FU i colonosphere formasjon i kulturer tredimensjonale høy tetthet er knyttet til induksjonen av apoptose ble ultra evalueringene utført (figur 4 . 5) i HCT116, HCT116 + ch3 , HCT116R og HCT116 + ch3R celler behandlet med 5-FU (5 uM) og curcumin (20 uM) hver for seg, eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 mM) for 1, 3, 7 og 10 dager. I kontrollkulturene, HCT116, HCT116 + CH3 og deres 5-FU-resistente motsvarende cellelinjer oppviste store runde levedyktige celler (inneholdende distinkt fordeling av endoplasmatisk retikulum, mitokondrier og andre cellulære organeller), og disse celler laget intim celle-til-celle-kontakt ( fig. 4A, 5A). Behandling av HCT116-celler med 5-FU eller curcumin alene resulterte i degenerering av celleorganeller, mitokondrie hevelse og utseendet på flere vakuoler, med fremtredende tegn på apoptose spesielt i høy tetthet kulturer curcumin behandlet rundt dag 10 (fig. 4A-B). Disse inkluderte deler av kondensert heterochromatin innenfor atomkjerner, og flere autophagocytic cytoplasmatiske vakuoler. Lignende observasjoner ble gjort for HCT116 + CH3-celler (data ikke vist). I motsetning til dette kan slike effekter ikke observeres i 5-FU eller curcumin behandlet HCT116R (fig. 5A-B) eller HCT116 + ch3R-celler (data ikke vist). Imidlertid, et kombinatorisk behandling av 5-FU og curcumin over 10 dager markert forbedret degenerasjon av alle tumorceller. Merkede degenerative forandringer og apoptotiske celler ble detektert rundt dag 3 i HCT116 (Fig. 4A-B) og HCT116R celler (fig. 5A-B), som allerede var synlige rundt dag 1 i HCT116 + CH3-celler (Fig. 4A-B) og HCT116 + ch3R celler (fig. 5A-B). Kvantifisering og statistisk analyse av ultra data belyser de fremtredende virkninger av kombinerte 5-FU og curcumin behandling på indusering og styrke mitokondrielle endringer (MC) og apoptotiske effekter i HCT116-celler (fig. 4B) og HCT116R celler (Fig. 5B).
A: tetthet kulturer Høye av HCT116 og HCT116 + ch3 ble enten etterlatt ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 mm), curcumin (20 mm), eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0.1 /5 mikrometer). Kulturer ble bedømt etter 1, 3, 7 og 10 dager, og evaluert ultrastructurally med et transmisjonselektronmikroskop. Tidligst tidspunkt da apoptose (piler) først ble oppdaget, blir bildene merket med røde bokser. Mikrografer som vises er representative for tre individuelle eksperimenter. Forstørrelse: x5000, bar = 1 mikrometer. B: MITOKONDRIELLE endringer (MC) og apoptose ble kvantifisert ved å telle 100 celler med morfologiske trekk ved apoptotisk celledød fra 25 ulike mikroskopiske felt og resultatene som presenteres er gjennomsnittsverdier med standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter. Betydelige verdier er merket med (*)
A:. Høy tetthet kulturer av HCT116R og HCT116 + ch3R var enten venstre ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 mm), curcumin (20 mm) eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 uM). Kulturer ble bedømt etter 1, 3, 7 og 10 dager, og evaluert ultrastructurally med et elektronmikroskop. Tidligst tidspunkt da apoptose (piler) ble først oppdaget bildene er uthevet i rødt bokser. Mikrografer som vises er representative for tre individuelle eksperimenter. Forstørrelse: x5000, bar = 1 mikrometer. B: MITOKONDRIELLE endringer (MC) og apoptose ble kvantifisert ved å telle 100 celler med morfologiske trekk ved apoptotisk celledød fra 25 ulike mikroskopiske felt og resultatene som presenteres er gjennomsnittsverdier med standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter. Betydelige verdier er merket med (*).
Curcumin Potenserer den antitumor effekt av 5-FU gjennom apoptose Pathway i HCT116, HCT116 + CH 3 celler og deres respektive 5-FU resistente celler i High Density kulturer
Siden ultra evaluering med elektronmikroskopi viste resultatene at 5-FU +/- curcumin-indusert apoptose (fig. 4-5), og PARP ser ut til å være involvert i induksjon av apoptose i tumorceller [35], derfor vi undersøkt om curcumin forsterker PARP cleavage på med 5-FU-behandlede HCT116, HCT116 + CH3 og deres tilsvarende 5-FU-resistente kolleger. Som vist på fig. 6, immunoblot-analyse viste at spaltingen av PARP ble forbedret, når cellene ble utsatt for curcumin (20 mM) eller 5-FU (5 mM) alene, eller i kombinasjon av curcumin og 5-FU (0,1 /5 pM) . Disse effektene var mer uttalt i kombinasjonsbehandling med curcumin og 5-FU enn i enkle behandlinger (Fig. 6).
tetthet kulturer Høye av HCT116 og HCT116 + CH 3 (venstre lanel) og HCT116R og HCT116 + ch3R (panel til høyre) celler ble enten ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 mm), curcumin (20 mm), eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 mm). Kulturer ble bedømt etter 3 dager og helcellelysater preparert og analysert ved western blotting for spaltning av PARP. Western blot som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter. Housekeeping protein β-actin fungert som en positiv lasting kontroll i alle forsøkene.
Curcumin har Potent Chemosensitization Effekt på tykktarmskreft stamceller i MMR-Mangelfull og -proficient CRC Celler i High Density kulturer
for å demonstrere chemosensitization effekten av curcumin på kolon CSC markører CD133, CD44 og ALDH1 uttrykk i kulturer med høy tetthet, ble western blotting analyse utført (fig. 7). Høy tetthet kulturer av HCT116, HCT116 + CH3 og deres tilsvarende 5-FU-resistente kolleger ble enten ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 mm) eller curcumin (20 mm) alene, eller 5-FU /curcumin i kombinasjon (0,1 /5 mM) i 12 timer.
