Abstract
DLC2 (slettet i leverkreft 2), en Rho GTPase-aktiverende protein, ble tidligere vist å være underexpressed i human leverkreft og har tumor-suppressor-funksjoner i cellekulturmodeller. Vi genererte DLC2-manglende mus for å undersøke tumor suppressor rolle DLC2 i hepatocarcinogenesis og funksjonen av DLC2 in vivo. I denne studien fant vi at i motsetning homolog DLC1, som er avgjørende for embryoutvikling, DLC2 var unnværlig for embryoutvikling og DLC2-mangelfull mus kunne overleve til voksen alder. Vi også observere en høyere forekomst av leversvulster eller diethylnitrosamine (DEN) -indusert hepatocarcinogenesis i DLC2-mangelfull mus. Imidlertid observerte vi at DLC2-manglende mus var mindre og hadde mindre fettvev enn villtype-mus. Disse fenotyper var ikke på grunn av reduksjon av cellestørrelse eller defekt i adipogenesen, som observert i 190B RhoGAP-mangelfull mus modell. Sammen disse resultatene tyder på at mangel på DLC2 alene ikke forbedre hepatocarcinogenesis
Citation. Yau TIL, Leung Thy, Lam S, Cheung AV, Tung EKK, Khong PL, et al. (2009) Slettet i Liver Cancer 2 (DLC2) Var unnværlig for utvikling og dens mangel Visste ikke forverre Hepatocarcinogenesis. PLoS ONE 4 (8): e6566. doi: 10,1371 /journal.pone.0006566
Redaktør: Alfred Lewin, University of Florida, USA
mottatt: 07.04.2009; Godkjent: 10. juli 2009; Publisert: 10 august 2009
Copyright: © 2009 Yau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av Hong Kong stipend~~POS=HEADCOMP Rådets generalsekretær forskningsfond (HKU 7436 /04m) og RGC Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C). I.O.L. Ng er Loke Yew professor i patologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en primær malignitet og er en av de vanligste kreftformene i Asia og Afrika. Infeksjon med hepatitt B eller C virus infeksjon og eksponering for aflatoksin B1 har blitt godt dokumentert som de viktigste årsakene. Men de underliggende molekylære mekanismene som fører til utvikling og progresjon av HCC fortsatt uklare.
Inaktivering av tumorsuppressorgener er et kjennetegn på kreftceller. I en søken etter tumor suppressors involvert i hepatocarcinogenesis identifiserte vi en roman gen
DLC2 plakater (slettet leverkreft 2) på kromosom region 13q12.3, som ofte tapt i HCCs [1]. I likhet med sin homolog DLC1 er DLC2 underexpressed i menneskelig HCCs og har tumorsupressorproteinene funksjoner i dyrkede celler [1], [2].
DLC1 og DLC2 er Rho GTPase aktiverende proteiner (hull). De har tre funksjonelle domener, en katalytisk RhoGAP domene [1], [3], en steril alfa motiv (SAM) protein interaksjon domene [4], [5] og en lipid-bindende Star-relaterte lipid-overføring (START) domene [6], [7]. Rho familie GTPases har 18 medlemmer, hvorav de tre godt studert representanter, Rac1, RhoA, og Cdc42. Disse små GTPases regulerer diverse cellulære signalveier [8], [9]. Det har blitt antydet at Rho proteinene spiller viktige roller i onkogen transformasjon som medieres av Ras og andre oncoproteiner ved å regulere aktin cytoskjelettet organisasjon, celleproliferasjon og celleoverlevelse [10], [11]. Også de stimulere tumorcelle invasjon og metastasering [9]. Rho GTPase-aktiverende proteiner (hullene) inaktivere dem ved å omdanne den aktive GTP-bundet tilstand til den inaktive GDP-bundet gjennom en aktivering av den iboende GTPase aktivitet av Rho-proteiner. Hullene er derfor foreslått å være kreftdemper som motvirker den onkogene potensialet i Rho proteiner.
Det har vært flere linjer med in vitro bevis for å støtte tumor suppressor rolle disse to Rho GAP proteiner, DLC1 og DLC2 [ ,,,0],1], [2], [3], [5], [12], [13], [14], [15], [16]. Dyremodeller som kan utnyttes for å undersøke tumorsuppressorgener funksjonene til disse to proteinene er fortsatt begrenset. Durkin et al. [17] har generert en DLC1-manglende mus modell for å studere de biologiske funksjoner av DLC1. Imidlertid fører DLC1 mangel på embryonale dødelighet ved midgestation. Sordella et al [18] viste at embryoer mangler p190B RhoGAP var ca 30% mindre i størrelse og gitt bevis som tyder på at denne reduksjonen i embryo størrelsen var på grunn av reduksjon i cellestørrelse. De demonstrerte også at murine embryonale fibroblaster avledet fra disse embryoer var defekte i adipogenese sammenlignet med villtype motstykke [19].
I denne studien genererte vi DLC2-manglende mus for å undersøke de biologiske funksjoner av DLC2 og dens rolle i hepatocarcinogenesis in vivo. I motsetning til DLC1 knockout modell, DLC2 var unnværlig for embryoutvikling og DLC2-mangelfull mus kunne overleve til voksen alder. DLC2-mangelfull mus viste ikke høyere forekomst av hepatocarcinogenesis eller diethylnitrosamine (DEN) -indusert hepatocarcinogenesis. Imidlertid DLC2-manglende mus var betydelig mindre og hadde mindre fettvev enn villtype-mus. Analyse av adipogenesen av DLC2-mangelfulle og villtype murine embryonale fibroblaster viste ingen signifikant forskjell mellom dem. Også vi ikke observere noen signifikant forskjell i cellestørrelse mellom G1 fase DLC2-mangelfulle og villtype udødelig fibroblaster med flowcytometri.
Materialer og metoder
Generering av DLC2 mus som mangler
En PAC-klone der muse
DLC-2
genomisk region ble hentet fra Sanger Centre (Cambridge, Storbritannia). Å konstruere musen
DLC-2
genet målretting vektor, en 2,8 kb
Eco
RI /
Bam
HI fragment, som er 3 «til ekson 5, ble klonet inn
Eco
RI /
Bam
HI stedet pPNT (Figur 1a). Et par av primere (forover, 5′-ttactcgagttgctgatgcacaggtcttc, omvendt, 5′-ttactcgagttctcgtgttaggaatgggg) ble anvendt for å amplifisere en genomisk region, 2,7 kb i størrelse og 5 «til ekson 5 (Figur 1a). Fragmentet ble deretter klonet inn i pPNT [20]. Det målsøkende vektor ble linearisert med
Ikke
I og ble elektroporert inn i AB2.2 embryonale stamceller (ES) cellelinje (129s7 /SvEBrd-HPRT b-m2), og cellene ble dyrket i ES-cellekulturmedium supplert med G418 og fialuridine. Resistente kloner ble analysert ved Southern blotting (se nedenfor) for å identifisere
DLC2
-targeted kloner.
(a) Skjematisk diagram som viser genet målrettingsstrategi. Svarte bokser, eksoner av musen DLC2 genet (ekson tall er skrevet på toppen); grå bokser, sekvens av neomycin motstand genet av targeting konstruere DNA; hvit boks, sekvens av tymidinkinasegenet av målrettingen konstruere DNA. Restriksjonsenzymdigestion sider: B, BamHI; Bg, BglII; E, EcoRI; N, NcoI; bare diagnostiske restriksjonsseter er vist for enkelhet. (B) Southern blot-analyse. Bglll-fordøyelse ble probet med 5 «probe som er angitt; størrelser av diagnostiske band: villtype-allelet, 4.7 kb; målrettet allel, 5.7 kb. NcoI fordøyelse ble undersøkt med 3 «probe som angitt; størrelser av diagnostiske band: villtype-allelet, 9,1 kb; målrettet allel, 5.7 kb. (C) PCR genotyping; størrelser av band: villtype-allelet, 414 bp; målrettet allel, 339 bp. (D) RT-PCR for å påvise DLC2 uttrykk i hjerte, lever og skjelettmuskulatur.
All forskning som involverer dyr arbeidet ble godkjent av komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning (Culata) ved University of Hong Kong. Celler fra disse klonene ble injisert i C57BL /6N blastocyster. Chimeras ble parret med C57BL /6N mus, og avkom som inneholder
DLC2
-targeted allel ble identifisert. Mus med blandede genetiske bakgrunn ble back-krysset til C57BL /6N i minst fem generasjoner.
Southern blot analyse, PCR genotyping og RT-PCR
For Southern blot analyse, to sonder, 5 «og 3» ytre, ble benyttet (Figur 1a).
Bgl II
fordøyelse ble probet med 5′-proben og størrelsene av diagnostiske bandene var 4,7 kb av villtype-allelet og 5,7 kb for den målrettede allel.
Nc
oI fordøyelse ble undersøkt med 3 «probe, og størrelsene av diagnostiske bandene var 9,1 kb for villtype-allelet og 5.7 kb for målrettet allel.
To par primere var brukes til PCR genotyping. For påvisning av villtype-allelet, forover (5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) og revers primer 5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) ble anvendt, med forventet størrelse av PCR-produktet 414 bp. For påvisning av den målrettede allel, forover (5′-CTGGGAAGACAGGGAACAAA) og revers primere (5′-GGGGGAACTTCCTGACTAGG) ble anvendt, med forventede størrelse av PCR-produktet blir, 339 bp.
for semikvantitativ RT- PCR-analyse, totalt RNA ble fremstilt fra musevev ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen). Første-tråd cDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA ved hjelp av tilfeldige heksamerer med GeneAmp RNA PCR Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). To mL av cDNA ble så brukt for å detektere uttrykket nivåer av
DLC1, DLC2 Hotell og
DLC3
ved hjelp av følgende primere: For mus
DLC1
genet, fremover primer (5 «- CCCATTCAGTCAGTCCACCTTGA) og reversprimeren (5»-GAGTCTCCCTCGTCGGAAAAC) ble anvendt; For mus
DLC2
genet, fremover primer (5 «GATGAGAAACACAGCCAGCA) og revers primer (5»-GTTGGGTATCTGGACGCACT) ble brukt; For
DLC3
, forover primer (5 «TCCACAGGCAGCCATGCCAG) og reversert primer (5»-TCTTGCTCAAGATCCTGGGCC) ble brukt. PCR tilstand var som følger: denaturering ved 95 ° C i 15 min, etterfulgt av 25 sykluser (
DLC1 Hotell og
DLC2
) eller 27 sykluser (
DLC3
) av denaturering i 30 sek, annealing ved 55 ° C i 30 sek med forlengelse ved 72 ° C i 30 sek, og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. PCR produktene ble løst i 1,2% agarosegel.
Metabolsk bur eksperiment
Mus ble individuelt plassert i metabolske bur i en 12:12 timers mørke lys syklus og ble matet
annonse libitum
. Vann og mat forbruk, og urin og avføring utgang ble målt i 2 dager.
Diethylnitrosamine (DEN) behandling av mus
hepatocarcinogenesis protokollen var som følger. Den 15-dagers gammel mann
DLC2
homozygot knockout mus og villtype mus ble injisert intraperitonealt med 25 mg /kg DEN i sterile PBS. På 35 ukers alder, ble musene avlivet og leveren deres ble høstet og undersøkt. De lever ble så fiksert i 4% formaldehyd i PBS, innebygd i parafin og kuttet i 4-mikrometer seksjoner for histologisk undersøkelse.
Utarbeidelse av murine embryonale fibroblaster (MEFs) og etablering av cellelinjer
Gravide mus ble ofret på 13,5 dager siste samleie (DPC). Embryoene ble dissekert fra livmoren, og ekstra-embryonale membraner og indre organer ble fjernet. Embryoene ble kuttet i små biter, og dyppet i 30 minutter i 4 ml 0,25% trypsin-EDTA ved romtemperatur. Trypsinering ble inaktivert med α-modifisert Eagle medium (aMEM) supplert med 10% varme-inaktivert FBS, 50 enheter av penicillin pr ml, og 50 ug streptomycin pr ml. Cellene ble oppslemmet ved pipettering og føres gjennom en sil. Standard fremgangsmåter ble anvendt for å etablere immortaliserte fibroblast-cellelinjer [21]. I korthet ble cellene passaged etter 3 dager i DMEM supplert med 10% kalveserum og antibiotika i en tetthet på 10
6 celler pr 10 cm plate. Media ble endret på den påfølgende dagen. Stabile udødeliggjorte cellelinjer ble etablert etter 30 til 50 passasjer.
Måling av cellestørrelser
De relative størrelser av
DLC2
+ /+ Hotell og
DLC2
– /-
celler ble bestemt med flowcytometri. I korthet ble cellene BrdU-merket ved anvendelse av FITC BrdU Flow Kit (BD Pharmingen ™, NJ, USA). G1 populasjon av celler ble inngjerdet og termin lysspredning (FSC) på 5000 G1-celler ble bestemt. FSC ble benyttet for å bestemme de relative cellestørrelser.
Induksjon av adipocyttdifferensiering
For induksjon av adipocyte differensiering, MEF celler som ble brukt var i løpet av to passasjer. Induksjon av adipocyttdifferensiering ble utført som tidligere beskrevet [19]. Celler ble dyrket i 6-brønns plater og overført til konfluens. To dager senere ble mediet erstattet med standard differensieringsinduksjon medium (α-MEM inneholdende 0,5 mM isobutylmethylxanthine, 1 uM deksametason, 5 ug insulin pr ml, 10% FBS og 50 U av penicillin pr ml, og 50 ug streptomycin pr ml, og mediet ble fornyet hver annen dag. cellene ble indusert i 8 dager før analyse.
cellene ble fiksert i 10% formalin, skyllet to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), og farget med olje-Red O fargeløsning (0,5% olje-Red O i isopropylalkohol oppløsning destillert vann [60:40]) i 30 minutter ved 37 ° C og deretter vasket med destillert vann tre ganger. adipogenese i olje-Red-O- beiset MEF ble kvantifisert ved å måle absorbansen av lys ved 510 nm etter ekstraksjon med isopropylalkohol.
Rhotekin bindingsanalyse
Cellene ble lysert i 500 ul lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris (pH 7.4 ), 10 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksycholat, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin, og 1 mM PMSF. Lysatene ble fjernet ved sentrifugering ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og 500 ug av hvert lysat ble inkubert med 45 ug GST-RBD (GST-fusjonsprotein inneholdende RhoA-bindende domene av Rhotekin) bundet til glutation-Sepharose perler (Amersham Pharmacia) i 1 time. Etter binding ble prøvene vasket med lyseringsbuffer for tre ganger. Bundne proteiner ble fraksjonert på 12% SDS /PAGE og immunoblottet med polyklonale antistoff for RhoA (Santa Cruz Biotechnology). Totale cellelysat ble også analysert med anti-RhoA-antistoff som en lasting kontroll. Nivået av aktive RhoA ble bestemt etter normalisering med den totale RhoA stede i cellelysatene.
immunfluorescens farging
Celler ble dyrket på dekkglass og ble skylt i PBS, fiksert med 4% paraformaldehyde i PBS i 15 minutter ved romtemperatur, permeabiliserte med 0,5% Triton X-100 i PBS i 5 minutter og blokkert med 5% bovint serumalbumin i PBS. Etter vasking med PBS ble cellene deretter inkubert med paxillin antistoff (Sigma), etterfulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff ved romtemperatur. F-actins ble farget med tetramethylrhodamine B isotiocyanat-merket phalloidin (Sigma) i 20 minutter ved romtemperatur, og kjernene ble farget med DAPI. Celler ble montert med Vectashield antifade løsning (Vector Laboratories).
Resultater
Generering av DLC2-mangelfull mus
For å studere funksjonen til DLC2
in vivo
og rollen DLC2 i hepatocarcinogenesis, genererte vi DLC2-deficent mus. Forstyrrelse av musen DLC2-genet ble oppnådd ved homolog rekombinasjon i embryoniske stamceller (ES-celler). I rekombinasjon, exon 5, den største av exon
DLC2
-genet, ble erstattet av neomycin-resistensgenet av det målsøkende vektor (figur 1a). To målrettede ES-kloner ble anvendt for å etablere DLC2-manglende mus (figur 1b og 1c).
DLC2
– /-.
Mus ikke uttrykke
DLC2
mRNA som oppdages ved RT-PCR på utvalgte vev, hjerte, lever og skjelettmuskulatur (figur 1d)
DLC2-mangelfull mus var anatomisk normalt, men mindre og hadde mindre adipose fett
i motsetning til
DLC1
– /-
mus, som døde i fosterstadiet,
DLC2
– /-
mus kunne overleve til voksen alder. Dette tyder på at DLC2 er unnværlig for embryonal utvikling. Anatomisk analyse viste at
DLC2
– /-
mus var normal (30 uker gammel), men
DLC2
– /-
mus var mindre i størrelse og lettere i vekt (p = 0,01) (figur 2a) og hadde mindre fettvev enn villtype mus (p = 0,02) (figur 2b 2c). Vi ønsket å utelukke at
DLC2
– /-
mus kan spise mindre mat enn
DLC2
+ /+
mus, og dette kan bidra til deres mindre kroppsstørrelse. Vi utførte derfor metabolsk bur eksperiment for å undersøke om det var noen forskjeller i mat og vannforbruk. Men vi kunne ikke påvise noen signifikante forskjeller i mat og vann inntak mellom
DLC2
– /-
mus og
DLC2
+ /+
mus (figur 3)
(a) Kroppsvekt vekt~~POS=HEADCOMP. (B) Vekt av epididymal fett pads. I (a) og (b), er middelverdier ± standardavvik og p-verdier vist. P-verdier ble beregnet ved uparet Student t-test. (C) Representative prøver av bitestiklenes fett pads.
(a) Matinntak, (b) vanninntak, (c) avføring utgang og (d) urinproduksjon i 24 timer. Middelverdier ± standardavvik og p-verdier er vist. P-verdiene ble beregnet ved uparede Student t-test.
Nedbryting av DLC2 ikke påvirke cellestørrelse og adipogenesen i MEFs
De p190B RhoGAP-mangelfull mus embryoer var mindre enn den ville typen embryoer og fibroblaster avledet fra p190B RhoGAP-manglende embryoer var mindre enn de som er avledet fra villtype-embryoer [18]. Også fibroblaster avledet fra p190B RhoGAP-mangel embryoer var defekt i adipogenesen [19]. Vi har derfor undersøkt om fibroblaster avledet fra
DLC2
– /-.
Museembryoer var mindre i størrelse og defekt i adipogenesen
Som demonstrert med flowcytometri, størrelsen på cellene avledet fra
DLC2
– /-
museembryoer var ikke signifikant forskjellig fra
DLC2
+ /+
museembryoer (Figur 4a og 4b). Siden Sordella et al. [18] viste AKT veien var nedstrøms målet for RhoA, og dette førte til slutt til redusert cellestørrelse fibroblaster avledet fra p190B RhoGAP-mangel embryoer, undersøkte vi AKT sti i celler avledet fra
DLC2
– /- Kjøpe og
DLC2
+ /+
museembryoer. Vi oppdaget ikke noen forskjell mellom dem i denne veien (figur 4c). Vi viste tidligere at DLC2 var en RhoGAP; overekspresjon av DLC2 nedregulert Rho-aktivitet i hepatom cellelinjer og resulterte i inhibering av aktin spenning fiberdannelse [2]. Men oppregulering av Rho aktivitet i
DLC2
– /-
celler ble ikke observert (figur 4d) og var det noen liten, men ikke signifikant forskjell i dannelsen av aktin stresset fiber eller fokale sammenvoksninger mellom
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
celler (figur 4e). Dette tyder på at det kan være andre funksjonelt lignende proteiner som kan kompensere funksjon av DLC2
(a) sammenligning av størrelsene av DLC2 + /+ (n = 6) og DLC2 -. /- (N = 6) -celler ved strømningscytometri. Frem lysspredning (FSC) fra G1-fase-celler som bestemt ved strømningscytometri ble anvendt for å måle de relative cellestørrelser. Middelverdier ± standardavvik og p-verdier er vist. P-verdier ble beregnet ved uparet Student t-test. (B) Representative prøver av flow-cytometri resultater. (C) Western blot-analyse av insulin-behandlede DLC2 + /+ og DLC2 – /- celler. (D) RhoA aktivitet av DLC2 + /+ og DLC2 – /- celler som detektert av Rhotekin bindingsbestemmelse. (E) Actin cytoskjelettet og fokale sammenvoksninger i DLC2 + /+ og DLC2 – /-. MEF celler ble oppdaget av immunfluorescens farging av aktin stresset fiber (rød) og Paxillin (grønn), henholdsvis
Vi undersøkt adipogenesen i fibroblaster avledet fra
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
museembryoer. Når
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
celler ble indusert av standard adipocyttdifferensiering induksjon medium, både
DLC2
– /
-. og
DLC2
+ /+
celler var kompetent til å differensiere i adipocytter og var ikke signifikant forskjellig i lipid produksjon kvantitativt (figur 5)
(a) Induksjon av adipogenese ble utført på DLC2 – /- (n = 6) og DLC2 + /+ (n = 6) MEFs. Etter induksjon, ble MEFs farget med Oil Red O-, og flekken ble deretter ekstrahert og absorbans ved 510 nm ble målt. Middelverdier ± standardavvik og p-verdier er vist. P-verdier ble beregnet ved uparet Student t-test. (B) Representative prøver av olje-Red O-farget MEFs.
Nedbryting av DLC2 ikke disponere for dannelsen av leversvulster eller forverre DEN-indusert hepatocarcinogenesis
Vi gjorde ikke observere noen svulstdannelse i leveren hos den voksne
DLC2
– /-
mus opp til en alder av 18 måneder. For å ta rollen som DLC2 i kjemisk-indusert hepatocarcinogenesis, behandlet vi 15-dagers gammel mann
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
mus med DEN . Når musene nådde 35 uker gamle, ble de dissekert og deres lever ble undersøkt for tumordannelse. Vi har observert at leversvulster utviklet i alle de mus behandlet med DEN. I tillegg er antall svulster dannes og de maksimale Tumordiametere var lik i begge
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
mus (p = 0,79 og 0,51, henholdsvis) (figur 6). Disse funnene tyder på at DLC2 mangel ikke forverre kjemisk hepatocarcinogenesis.
(a) Antall svulster som dannes i leveren etter DEN behandling. (B) Størrelse av tumor som representert ved maksimal diameter (i millimeter). I (a) og (b), er middelverdier ± standardavvik og p-verdier vist. P-verdier ble beregnet ved uparet Student t-test. (C) Representative leverprøver behandlet med DEN. Hvite piler indikerer svulster. (D) Representant H . E farget deler av leverprøver behandlet med DEN
DLC1 Hotell og
DLC3
mRNA uttrykk i DLC2-utarmet vev
Semi-kvantitativ PCR ble utført på utvalgte vev inkludert lever, skjelettmuskulatur og hjerter
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
mus ved 3 måneders alder ignorering genet dosering kompensasjon av andre DLC medlemmer i våre
DLC2
– /-
mus. Våre data viste ingen signifikant økning av enten DLC1 eller DLC3 i disse vev av
DLC2
– /-
mus (Supplementary figur S1). Forsøkene ble utført uavhengig tre ganger.
Diskusjoner
Det ble rapportert at DLC1-mangel embryoer hadde nevralrørsdefekter og døde tidlig å midgestation [17]. Som foreslått av Durkin et al. [17], dette kan også være på grunn av den primære funksjonsfeil på andre organer slik som det fremkallende hjerte. Vår gruppe nylig viste at DLC1 negativt regulert Rho /ROCK [22]. Også et relativt høyt nivå av ROCK uttrykk ble tidligere observert i utviklings hjerter embryoer, 7,0-9,0 DPC [23] og 09.05 til 11.05 DPC [24]. Dette tyder på at DLC1 mangel kan forstyrre normal funksjon av ROCK proteiner i embryonale hjertet og føre til embryonale dødelighet. Likevel, de observerte fenotyper tyder på at DLC1 har en avgjørende rolle under tidlig murine utvikling.
I denne studien, viste vi at DLC2 mangel ikke forårsake noen observerbare utviklingsdefekter, og DLC2-mangelfull mus kunne overleve til voksen alder. Dette tyder på at funksjonene DLC2 i embryoutvikling kan bli kompensert av sin homolog, DLC1, men ikke vice versa. Det er vanlig at paraloge gener kompensere funksjonene til de medlemmer av gruppen. For eksempel medlemmer av mus Hox paraloge gruppe 3, Hoxa3, Hoxb3 og Hoxd3, interagere synergistisk for å regulere embryoutvikling på en doseavhengig måte, [25], [26]. Selv om DLC2 mangel ikke førte til embryonisk dødelighet, DLC2-manglende mus var mindre og hadde mindre fettvev. Siden det ble vist at fibroblaster avledet fra 190B RhoGAP-manglende embryoer var mindre, [18] og var mindre effektiv i adipogenese [19], vi undersøkte DLC2-manglende mus langs disse linjene. Men observerte vi ingen signifikante forskjeller i cellestørrelse og adipogenesen mellom fibroblaster avledet fra
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
mus. Også, den metabolske bur eksperimentet ikke påvise noen signifikant forskjell mellom
DLC2
– /- Hotell og
DLC2
+ /+
mus. I denne forbindelse, kunne vi ikke utelukker muligheten for at den metabolske bur eksperimentet kanskje ikke er følsom nok til å detektere den lille forskjell i mengden av matinntaket som kan forårsake den observerte fenotypen i kroppsvekt. Også vi ikke kunne utelukke at
DLC2
– /-
mus kan være mer aktive og forbrukes mer kalorier enn
DLC2
+ /+
mus
det ble demonstrert at DLC2 lokalisert i mitokondriene og kan spille en rolle i lipidtransport [7]. I tillegg har det blitt foreslått at START-domene som inneholder protein, stjerne, er en essensiell komponent i steroidhormonproduksjonen i translokasjon av kolesterol fra den ytre membranen til den indre membran av mitochondria i steroidogenic celle [27]. Siden DLC2 er en START domene som inneholder protein og er i stand til å lokalisere i mitokondriene, vil det være av interesse å studere fysiologiske funksjon av DLC2 i relasjon med lipidmetabolismen samt steroidhormon biosyntese.
DLC2 var vist å være underexpressed i HCC [1], [2], [28] og har tumorsupressorproteinene funksjoner, inkludert undertrykkelse av celleproliferasjon, Ras-indusert kolonidannelse og forankrings-uavhengig vekst [1], [2]. Ett av våre viktigste mål i å generere DLC2-mangelfull mus var å undersøke tumor suppressor rolle DLC2 in vivo. Vi fant ut at DLC2 mangel ikke disponere for dannelsen av HCC eller forverre DEN-indusert hepatocarcinogenesis. Igjen kan tumor suppressor funksjon av DLC2 funksjon kompenseres ved DLC1. Siden DLC1-manglende mus dør i fosterstadiet, ville det være interessant å se om hepatocytt-spesifikk mangel på DLC1 kan disponere slike mus for utvikling av HCC og for å avgrense rolle DLC2 mangel på utvikling av HCC i disse musene. Det ble demonstrert at tap av p53 vil akselerere hepatocarcinogenesis i transgene mus som overuttrykker c-myc [29]. Det ville være lærerikt å krysse DLC2-manglende mus med andre knockout-mus av tumorsuppressorgener slik som p53 og /eller transgene mus som overuttrykker onkogener så som c-myc og TGF-alfa [30]. Alternativt kan den nylig utviklet system av Zender et al. kan utnyttes til å studere tumor suppressor rolle DLC2 i hepatocarcinogenesis [31]. I det systemet, kan p53-manglende lever forløperceller være infisert med en kombinasjon av ekotropisk retrovirus som bærer c-myc, RAS, AKT og DLC2. Dette vil gjøre oss i stand til å undersøke hvorvidt DLC2 har tumor suppressor funksjon in vivo.
DLC2 tilhører et medlem av DLC familie proteiner. Det koder for et RhoGAP domene med høy sekvens homologi med DLC familiemedlemmer, DLC1 og DLC3. I våre tidligere undersøkelser, har vi vist at DLC2 eller DLC1 var i stand til å inhibere aktiviteten RhoA som resulterte i nedregulering av aktin spenning fiberdannelse. Videre studie fra Kawai et al viste at DLC3 kan også hemme RhoA aktiviteten ved sin RhoGAP domene. Ektopisk ekspresjon av DLC3 i HeLa-celler reduseres antallet av aktin spennings fibrer [32]. Resultatene tyder på at de funksjonelle rollene DLC1, DLC2 og DLC3 i cellelinjer og deres nedstrøms effektorer er ganske like. I musemodell, DLC1 utarming var embryonale dødelig mens våre DLC2 knockout mus kan overleve til voksen alder. Dette tyder på at funksjonene DLC2 i embryoutvikling kan kompenseres ved DLC1 eller DLC3. Men fra vår semi-kvantitativ RT-PCR resultat, var det ingen signifikant økning av enten DLC1 eller DLC3 i leveren, hjerter og skjelettmuskulatur av DLC2 knockout mus. Resultatet innebærer at den fysiologiske nivået av DLC1 eller DLC3 uttrykk kan være tilstrekkelig for kompensasjon av DLC2 funksjoner. Det vil være interessant å generere DLC3 knockout-mus for å studere dens betydning i fosterutviklingen og undersøke om dens funksjon kan kompenseres av andre DLC medlemmer. I tillegg knockout mus data indikerer at DLC medlemmer kan spille ulike fysiologiske roller i utvikling. Bortsett fra de vanlige nedstrøms effektor (RhoA), kan det være andre forskjellige molekylære mål blir spesifikt regulert av en bestemt DLC medlem.
Bortsett fra å studere tumor suppressor rolle DLC2 i HCC, de DLC2-mangelfull mus kan være nyttig for å studere andre krefttyper, som nedregulering av DLC2 ble også observert i lunge, eggstokk, nyre-, bryst, livmor, mage, tykktarm og endetarm kreft [33].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression nivå DLC1 og DLC3 i DLC2 – /- og DLC2 + /+ mus. Semi-kvantitativ PCR utføres på leveren, musklene og hjertet til den DLC2 – /- og DLC2 + /+ mus på 3 måneders alder viste ingen signifikant forskjell i mRNA uttrykk nivåer av DLC1 og DLC3. β-aktin-genet ble brukt for normalisering
doi:. 10,1371 /journal.pone.0006566.s001 plakater (0,39 MB TIF)
