Abstract
Bakgrunn
Angiogenese er viktig for vekst og metastasering av kreft. Selv om anti-angiogene midler, særlig vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) hemmere, har utstilt mono aktivitet, er det stor interesse for å kombinere disse nye stoffene med konvensjonell kjemoterapi reagenser for å oppnå en optimal klinisk effekt. Målet med denne studien var å vurdere fordelene ved kombinasjonsbehandling av vaskulær endotelial vekstfaktor trap (VEGF-Trap) med gemcitabin i en lunge svulst modell.
Metoder
En luciferase-uttrykke Lewis lungekarsinom (LLC) modellen ble etablert i C57BL /6J mus og tumorbærende mus ble randomisert til kontroll, VEGF-Trap, gemcitabin og VEGF-Trap /gemcitabin kombinasjon grupper. Tumorvekst og overlevelse dyr ble overvåket. Tumor microvessel tetthet og celleproliferasjon ble evaluert ved CD31 og Ki-67 immunhistokjemisk analyse. TUNEL assay ble utført for å påvise apoptotiske celler. Protein nivåer av Cyclin D1, Pro-Caspase-3, Bcl-2, ble MMP2 og MMP9 i tumorekstrakter undersøkt ved western blot.
Resultatene
VEGF-felle i kombinasjon med gemcitabin viste betydelig forbedret inhibering av tumorvekst og forlenget overlevelse sammenlignet med mus VEGF-felle eller gemcitabin monoterapi. VEGF-Trap /gemcitabin kombinasjonsbehandling ikke bare potent hemmet tumor angiogenese og celledeling, men også økt cellulær apoptose i tumorcellene. I tillegg er kombinasjonsbehandlingen markert ned-regulert ekspresjon av spredning, anti-invasjons apoptose og relaterte proteiner.
Konklusjon
Kombinasjonsterapi ved bruk av VEGF-felle og gemcitabin resultert i forbedret anti-tumor effekt i en lungekreft modell og VEGF-Trap /gemcitabin kombinasjonen kan representere en lovende strategi i behandlingen av menneskelige lungekreft
Citation. Zhou S, Yang Y, Yang Y, Tao H, Li D, Zhang J, et al. (2013) kombinasjonsbehandling av VEGF-Trap og gemcitabin resulterer i økt anti-tumor effekt i en mus Lung Cancer Model. PLoS ONE 8 (7): e68589. doi: 10,1371 /journal.pone.0068589
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 15 mars 2013; Godkjent: 06.06.2013; Publisert: 09.07.2013
Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Shanghai «Science and Technology Innovation handlingsplan» forsøksdyr forskningsprosjekt (nr 10140900400), National Natural Science Foundation of China (No. 31000527), Shanghai Helse Bureau forskningsfond for ung etterforsker (Dr. Shuang Zhou) og Hong Kong Scholar program (No. XJ2011025). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Junli Zhang er ansatt ved Yantai Rongchang Bioteknologi, Ltd. Eli Lilly and Company Shanghai gitt gemcitabin (Gemzar) for denne studien. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Angiogenese er prosessen med nye blodkar formasjon fra eksisterende blodkar. Det er en viktig prosess i utviklingen av ondartede svulster som neoplastiske lesjoner må etablere sin egen blodtilførsel til å vokse utover 1-2 mm i diameter [1]. Den dominerende regulator av tumor angiogenese er vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [2], [3], som er den sentrale angiogene faktor kjent for å være til stede gjennom hele tumoren livssyklusen [4]. Sin kontinuerlige uttrykk, sammen med den genetiske stabiliteten til VEGF-reseptorer i endotelceller, som gjør direkte og konstant undertrykkelse av VEGF signalisere en viktig antitumorstrategi [3], [4]. Med rollen som angiogenese i tumorvekst og progresjon godt etablert, har anti-angiogene midler mottatt mye utbredt oppmerksomhet, men kliniske strategier for optimal bruk er fortsatt under utvikling [5].
Den antiangiogene middel vaskulær endotelial vekstfaktor felle (VEGF-felle eller aflibercept) er en konstruert kimære protein inneholdende det ekstracellulære domene 2 av VEGF-reseptor-1 (VEGFR-1, Flt-1) og ekstracellulære domene 3 av VEGFR-2 (KDR) fusjonert til Fc-delen av humant immunglobulin G1. VEGF-Trap potent blokkerer alle VEGF-A isoformer og PlGF av både menneskelige og muse opprinnelse [6]. VEGF-felle utøver sin anti-angiogene effekter ved regresjon av tumor-karsystemet [7], [8], normalisering av overlevende vaskulatur, og hemming av ny tumor fartøyet spire [9], [10]. Disse lovende resultater førte til fremme av denne agenten i kliniske studier [11], og det har nylig blitt godkjent av US FDA for kolorektal kreft [12]. Imidlertid er det usannsynlig at anti-angiogene terapier er kurativt på egen hånd, fordi anti-angiogene midler seg selv ikke kan drepe tumorceller direkte. Snarere kan sitt største potensial realiseres når den brukes i forbindelse med konvensjonelle anti-cancer-terapier, for eksempel kjemoterapi [13], [14]. Anti-angiogenese-indusert normalisering av tumorvaskulatur kan forbedre svulsten perfusjon og føre til økt kjemoterapi levering [15] – [18]
Lungekreft er den ledende årsak til kreft død på verdensbasis.. Gemcitabin er et deoksycytidin-analog som har vist effekt som en behandling av mange faste tumorer. Gemcitabin er ofte foreskrevet i behandling av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [19], [20], men er dens fordeler begrenset på grunn av lav svarprosent eller ervervet svulst motstand.
i denne studien, forsøkte vi å evaluere effekten av kombinasjonsbehandling med VEGF-Trap og gemcitabin i en mus LLC kreft modell lunge, og å undersøke mulig mekanisme ansvarlig for den økte anti-tumor effekt.
Materialer og metoder
mus og reagenser
C57BL /6J hunnmus ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Science og plassert på Animal Maintenance Facility av Tongji University i minst en uke før bruk. Protokollene ble godkjent av dyreetikk komité Tongji University. Alle dyreforsøk ble utført under spesifikke patogen-frie betingelser i samsvar med institusjonens retningslinjer. VEGF-Trap ble konstruert i henhold til Holash og medarbeidere [8], og uttrykt i kinesisk hamster ovarie (CHO) celler etter stabil transfeksjon. Det rekombinante VEGF-felle ble renset ved protein A-affinitet og ionebytterkromatografi og rekonstituert i sterilt PBS. Kvaliteten av VEGF-felle ble bestemt ved reduserende SDS-PAGE. Den bindende aktivitet av rekombinant VEGF-felle til mus VEGF ble bekreftet ved en ELISA-basis direkte bindingsassay. Proteinet ble lagret ved -20 ° C inntil bruk for subkutan (SC) administrering på 1 g /kg. Gemcitabin (Gemzar) ble vennlig levert av Eli Lilly (Indianapolis, Ind., USA) og lagret ved 4 ° C. Ifølge tidligere studier [21], ble gemcitabin oppløst i steril PBS for intraperitoneal (ip) injeksjon i en dose på 60 mg /kg.
Bygging av luciferase-uttrykke Tumor Cell linje
LLC mus lunge adenokarsinom-celler (CRL-1642) var fra American Type Culture Collection (ATCC), som ble dyrket i DMEM supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (GIBCO-BRL), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM glutamin og 100 mg /l penicillin, og holdt ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 i luft. Luciferase-genet ble amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) fra et cDNA-templat ved hjelp av en forover-primer: 5′-CAC CGA CTC TAG AGC CGC CAC CAT GGA AGA TGC CAA AAA C og en revers primer: 5′-CGG CAA GAT CGC CGT GTA ATA ACG GTC CGT CGA CAA TCA AC, flankert med X-bal I og Sal I restriksjonssete. PCR ble utført med 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C i 45 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 60 sekunder. PCR-fragmentet ble spaltet med X-bal I og Sal I og innsatt i pRRL-CMV lenti-viral plasmid ved X-bal I og Sal I-setet. Lenti-luciferase (lenti-Luc) viral vektor ble pakket i 293T celler ved transfeksjon av lenti-Luc og emballasje plasmider (Invitrogen). Etter 48 timer post-transfeksjon, ble supernatanter inneholdende lenti-Luc-virus høstet. For lenti-Luc viral transduksjon, ble LLC celler sådd ut i en 6-brønns plate og lenti-virus-holdige supernatanter ble tilsatt til mediet (supernatanten: friskt medium = 01:01, ca. 1 x 10
8 virale partikler /ml) i nærvær av polybren (8 ug /ml). En stabil luciferase-uttrykkende klon ble utvalgt ved begrenset fortynning for å skape en Luc-LLC cellelinje. Luciferase aktivitet i Luc-LLC celler ble bestemt ved luciferase assay bruker en luciferase deteksjon kit (Beyotime) og selvlysende imaging (Berthold). Ytterligere sammenligninger av cellevekst, migrering og tumordannende evne LLC og Luc-LLC celler ble utført ved MTT-analysen, sårheling og tumormodell subkutan vurdering, respektivt.
dyretumormodell og behandlingsgruppene
for å inokulere tumorer, 2 x 10
6 Luc-LLC celler ble resuspendert i 200 ul serumfritt DMEM-medium og injisert subkutant inn i høyre flanke av 6 til 8 uker gamle C57BL /6J mus. En uke etter Luc-LLC inokulasjon, ble tumorbærende musene tilfeldig delt inn i følgende grupper (n = 8 per gruppe) basert på Bioluminescens målt etter den første bildedannende og tumorer volum nådde ca 100 mm
3: (a) ubehandlet kontroll (200 ul PBS tre ganger ukentlig ved intraperitoneal injeksjon); (B) VEGF-Trap alene (1 g /kg tre ganger ukentlig ved subkutan injeksjon); (C) Gemcitabin alene (60 mg /kg tre ganger ukentlig ved intraperitoneal injeksjon); (D) VEGF-Trap /gemcitabin kombinasjonen (VEGF-Trap 1g /kg tre ganger ukentlig ved subkutan injeksjon, og gemcitabin 60 mg /kg tre ganger ukentlig ved intraperitoneal injeksjon). Behandling ble fortsatt i 2 uker deretter. Tumorstørrelse ble overvåket annenhver dag i 15 dager med en verniercaliper etter behandlingsstart. Tumorvolumer ble bestemt ved hjelp av formelen: volum (mm
3) =
en
×
b
2 × 0,5, der
en
er den lange diameter og
b
er den korte diameter som tidligere beskrevet [22]. Alle data som er representert som middel ± SE. Musene ble utsatt for avbildning på dag 12 etter starten av behandlingen. På dag 15 etter behandlingsstart, ble musene i alle grupper ofret. Svulster ble veid og bildene ble tatt etter disseksjon. Halvparten av svulstvev ble løst i periodate-lysin-paraformaldehyde (PLP) og O.C.T (Sakura Finetek) innebygd for immunhistokjemi. Den andre halvparten ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Survival kurve analyse ble gjort i et selvstendig behandlingsgruppen. Mus død ble bestemt ved hjelp av en forhåndsbestemt kriterium.
Bioluminesens Imaging
in vivo
bioluminesens bilde ble utført ved hjelp av et dyr bildesystem (nightowl LB 983 Molecular Imaging System , Berthold). Musene ble injisert med en intraperitoneal injeksjon av 150 mg /kg D-luciferin kaliumsalt (Caliper Life Sciences) i 200 ul DPBS. Etter 5 minutter av luciferin injeksjon ble musene bedøvet via intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (50 mg /kg). Hver mus ble plassert i en venstre lateral decubitus posisjon og et digitalt gråtonebilde dyr bildet ble kjøpt opp, etterfulgt av oppkjøpet og overlegg av en pseudocolor bilde som representerer den romlige fordelingen av påviste fotoner som kommer ut av aktiv luciferase innenfor dyret. Eksponeringstiden varierte fra 10 til 30 sekunder, avhengig av intensiteten av Bioluminescens utslipp fra tumorcellene. Fotoner som sendes ut fra bestemte regioner ble kvantifisert ved hjelp av en IndiGo programvare (Berthold). Regioner av interesse (ROI) ble trukket rundt kreft områder og kvantifisert som foton tellinger per sekund.
Immunohistochemistry
tumorvev ble løst i PLP, forankret i oktober, og skjær i 10 mikrometer seksjoner . Deretter ble seksjonene farget med spesifikke antistoffer for analyse.
For analyse microvessel tetthet, tumorsnitt ble farget med et rotte-anti-muse-CD31-antistoff (BD Pharmingen) fulgt av FITC-konjugert kanin-anti-rotte-IgG (Invitrogen ). Cellular kjerner ble kontra med DAPI (Sigma-Aldrich). Kvantifisering av microvessel tetthet (MVD) ble bestemt i henhold til metoden til Weidner et al. [23]. I korthet, ble seksjonene først screenet ved lav forstørrelse (x 40 og x 100) for å identifisere de mest vaskulære området av tumor (hot spot). Innenfor hot spot området, ble farget microvessel telles i en enkelt høyeffekts (× 400) feltet. MVD ble uttrykt som antall microvessel /felt. Eventuelle CD31-farget endotelceller eller endotelcelle klynger som var tydelig skilt fra tilstøtende microvessels, tumorceller, eller elementer bindevev ble betraktet som en enkelt tellbar microvessel.
Immunhistokjemisk analyse av celleproliferasjon ble utført på de frosne tumorsnitt med en rotte anti-mus Ki-67-antistoff (Biolegend) fulgt av FITC-konjugert kanin-anti-rotte-IgG (Invitrogen). Resultatene ble uttrykt som prosentandelen av Ki-67 positive celler ± SEM per 400 x forstørrelse. I alt ti x 400 felt ble undersøkt og tellet fra tre tumorer i hver av behandlingsgruppene. Ki-67 spredning indeksen ble beregnet i henhold til følgende formel: antall Ki-67 positive celler /totallegemer × 100%
TUNEL analysen
In situ.
påvisning av apoptotiske celler i svulstvev ble utført ved terminalen deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) teknikk som bruker en kommersielt tilgjengelig apoptose deteksjon kit (Beyotime) etter produsentens protokoll. Tunel positive celler fra 10 uavhengige feltene ble kvantifisert manuelt. Apoptose Indeksen ble beregnet i henhold til følgende formel:. Hvor mange apoptotiske celler /totalt antall kjerneinneholdende celler x 100%
Western Blot analyse
tumorvev på dag 15 etter behandlingsstart var homogenisert med lyseringsbuffer (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 1 mM PMSF, 10 mg /ml aprotinin , 10 mg /ml leupeptin) på is. Etter sentrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter, ble supernatantene samlet og total proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved BCA-analyse (Pierce). Like mengder av denaturerte proteiner ble fylt på 10% SDS-PAGE-gel og overført på PVDF-membran (Millipore). Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i TBST (1 x TBS inneholdende 0,1% Tween 20) og deretter inkubert med anti-muse primære antistoffer mot CyclinD1, Pro-Caspase-3, Bcl-2, MMP2 og MMP9 (alle fra Santa Cruz Bioteknologi) over natten ved 4 ° C. Etter vask med TBST tre ganger, ble HRP-konjugerte sekundære antistoffer bundet og utføres med chemiluminescence hjelp SuperSignal West Pico substrat (Pierce). Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av bandleder programvare.
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av enveis ANOVA eller Student
t
test, som passer.
*
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant og
**
P
. 0,01 ville være svært statistisk signifikant
Resultater
Etablering av LLC tumor Model med stabil luciferaseekspresjon
for å bedre skjerm tumorvekst og metastase
in vivo
, bygget vi LLC cellelinjer med stabil luciferaseekspresjon og subkutant inokulert Luc-LLC celler i C57BL /6J mus. Tumorer ble målt og avbildes på dag 7, 14 og 21 etter tumor-inokulering. Som vist i figur 1A og B, ble Luc-LLC tumorvekst visualisert med bioluminescens avbildning og fotoner som sendes ut fra bestemte områder ble kvantifisert ved anvendelse av en Indigo programvare, som var i samsvar med tumorvekst kurve (figur 1C). Ingen forskjell ble observert mellom Luc-LLC og patent LLC celler i cellemorfologi, migrasjon og vekst
in vitro
samt tumordannelsesevne
in vivo
(figur S2). Ulike behandlingsplaner var representert i figur 1D
(A) Bioluminesens bilder av LLC svulster på dag 7, 14 og 21 etter Luc-LLC subkutan inokulering (n = 6).; (B) Målinger av fotoner per sekund viser tumor volumer av mus ved hjelp av IndiGo bildeanalyse programvare,
*
P
0,05,
**
P
0,01
vs
dag 7; (C) Tumor vekstkurve fra dag 5-25 etter Luc-LLC subkutan vaksinasjon (n = 6),
*
P
0,05,
**
P
0,01
vs
dag 5; (D) Skjematisk fremstilling av eksperiment protokoll beskrevet i materialer og metoder ble dyrene delt inn i fire grupper: (a) kontroll; (B) VEGF-Trap alene; (C) Gemcitabin alene; (D) Kombinasjon av VEGF-Trap og gemcitabin.
Effekter av VEGF-Trap i kombinasjon med gemcitabin på LLC Svulster
For å undersøke den terapeutiske effekten av kombinasjonsbehandling av VEGF-Trap og gemcitabin på veksten av tumorer LLC, C57BL /6 mus med tumorer LLC ble inndelt i fire behandlingsgrupper som beskrevet ovenfor. VEGF-Trap ble fremstilt som beskrevet i Materialer og metoder. Den rensede VEGF-felle vist som et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 50 kD (figur S1A) og oppviste en sterk bindingsaktivitet til mus VEGF som bestemt ved en direkte bindingsanalyse (figur S1B). Når volumet av tumorene nådde rundt 100 mm
3, ble behandlingen påbegynt. På dag 6 etter første behandling, VEGF-felle og gemcitabin kombinasjonsbehandling viste signifikant hemmende effekt på tumorvekst sammenlignet med kontrollgruppen. Selv om VEGF-felle eller gemcitabin alene også i betydelig grad hemmet tumorvekst, kombinasjonsterapi resulterte i en mer robust inhibering av tumorutvikling, og hadde den mest signifikant forsinkelse i tumorvekst bestemt ved tumorvolum på dag 9, 12 og 15 etter første behandling ( Figur 2C
P
0,01, sammenlignet med kontrollgruppen). Bioluminesens avbildning analyse av LLC tumorer på dag 12 etter starten av behandlingen bekreftet anti-tumor effekt (figur 2A og B). Signifikante forskjeller i kreft størrelser og vekt ble sett på dag 15 når behandlingen ble stoppet og svulster ble dissekert (figur 2D og E). Ingen statistisk signifikant forskjell i tumorstørrelse ble funnet mellom VEGF-Trap og gemcitabin monoterapi. Således kombinasjonsterapi av VEGF-felle og gemcitabin økes anti-tumor effekt ved LLC tumormodell. Tilsvarende ble den øket hemming av tumorvekst i kombinasjonsterapi settes til forlenget dyr overlevelse ifølge Kaplan-Meier-analysen og de mus som fikk kombinasjonsterapi holdt seg på et 100% overlevelse ved slutten av observasjonsperioden (figur 2F) .
(A) bioluminesens bilder av subkutane inokulerte LLC svulster på dag 12 etter behandlingsstart; (B) Imaging analyse (fotoner per sekund) som viser tumor volumer av mus ved hjelp av IndiGo bildeanalyse programvare; (C) Tumorvolumet beregnes på dag 3, 6, 9, 12,15 etter starten av behandlingen; (D) Representative kreft bilder på dag 15 etter behandlingsstart; (E) Tumorvekter ble målt på dag 15 når tumorer ble høstet; (F) Overlevelseskurver ble konstruert ifølge Kaplan-Meier-analysen. n = 8 for hver gruppe, *
P
0,05, **
P
. 0,01
vs
kontrollgruppen
Hemming av tumor Angiogenese og celleproliferasjon
LLC svulster fra alle behandlingsgrupper ble høstet på dag 15 etter behandlingsstart og var forberedt på immunehistochemistry studier som beskrevet i materialer og metoder. Angiogenese i løpet av tumorvevet ble evaluert ved å telle microvessel tetthet følgende immunhistokjemisk farging for CD31. Behandling med VEGF-felle eller en kombinasjonsbehandling resulterte i en tydelig inhibering av angiogenese i tumorer sammenlignet med kontrollgruppen. De gjennomsnittlige tellinger pr fartøyet høyeffekts felt i VEGF-felle eller i kombinasjonsgruppen var signifikant lavere (
P
0,01) enn i kontrollgruppen (figur 3A og B). Selv om det var en statistisk signifikans i microvessel tetthet, vi også bemerkes at gemcitabin-behandlede tumorer viste en sterkere CD31-positive område enn tumorene i kombinasjonsterapigruppen.
(A) Representative bilder av CD31-positive microvessel området og Ki67 positive celler i levedyktige LLC tumorvev på dag 15 etter behandlingsstart ble estimert ved immunhistokjemisk farging; (B) og (C) microvessel tetthet og prosentandelen av Ki67-positive celler ble bestemt ved å telle antallet av positiv farging per høyeffekts-feltet i den delen, som beskrevet i «Materialer og metoder». *
P
0,05, **
P
0,01
vs
kontrollgruppen. Scale bar, 50 mikrometer.
For å undersøke celleproliferasjon i tumorvev etter behandling, ble frosne tumorsnitt farget med Ki-67 antistoffet og Ki-67 spredning indeksen ble beregnet basert på immunhistokjemisk analyse. Ki-67 proliferasjon indeks viste en 8-gangers reduksjon i VEGF-felle og gemcitabin kombinasjonsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3A og C), noe som tyder på en betydelig undertrykkelse av tumorcelle-proliferasjon i behandlingsgruppene.
Økt tumor Cell apoptose
for ytterligere å undersøke mekanismen av den kombinerte effekten av VEGF-Trap og gemcitabin på LLC svulster, ble en TUNEL analyse utføres for å studere svulst celle apoptose. Som vist på figur 4A og B, den TUNEL-analysen viste en markert økning i apoptose i tumorcellene fra kombinasjonsterapigruppen (
P
0,01)., Sammenlignet med de andre gruppene
(A) Cell apoptose ble evaluert av TUNEL flekker, de representative deler av LLC tumorvev ble hentet fra mus på dag 15 etter behandlingsstart; (B) Den apoptotiske indeksen ble bestemt som beskrevet i «Materialer og metoder». *
P
0,05, **
P
0,01
vs
kontrollgruppen. Scale bar, 50 mikrometer.
Nedregule Uttrykk for spredning, Anti-apoptose og Invasion Relaterte Proteiner
Etter å ha etablert endringene i microvessel tetthet, celleproliferasjon og apoptose indeksen i respons til VEGF-Trap og gemcitabin kombinasjonsbehandling, ved siden søkte vi å undersøke mulig mekanisme av den kombinerte effekten observert i tumormodell
in vivo
ved å vurdere uttrykk for celleproliferasjon (cyclin D1), anti-apoptose ( pro-Caspase-3, Bcl-2), og invasjon (MMP2, MMP9) relaterte proteiner ved anvendelse av western blot. I ekstrakter fra LLC tumorer på dag 15 etter starten av behandlingen, Cyclin D1, Pro-Caspase, Bcl-2, MMP2 og MMP9 ekspresjon ble nedregulert i VEGF-felle og gemcitabin kombinasjonsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,01). Western blot resultater bekreftet at VEGF-felle eller gemcitabin monoterapi kan nedregulerer ekspresjonen av alle disse proteinene, men kombinasjonsterapi ytterligere forbedret disse effektene (figur 5A og B). Disse data var i overensstemmelse med resultatene fra immunohistokjemisk analyse og TUNEL assay (figur 3, figur 4).
(A) Western blot-analyse viste at VEGF-felle i kombinasjon med gemcitabin hemmet ekspresjon av Cyclin D1, Pro- caspase-3, Bcl-2, MMP2 og MMP9 i LLC svulster; (B) Kvantitering av proteinnivåer. p-aktin fungert som en intern kontroll. Densitometer kvantifisering var i forhold til de første datasettet i hvert tilfelle (indikert med en verdi på 1). Alle data er representative for i det minste to uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
. 0,01
vs
kontrollgruppen
Diskusjoner
Angiogenese er en strengt regulert prosess, med en dynamisk balanse mellom stimulerende og hemmende signaler. Angiogenese oppstår når balansen mellom angiogene stimulatorer og inhibitorer er i favør av stimulatorer [24]. Blokaden av nøkkelen angiogene stimulator, VEGF, er et effektivt middel for å hemme angiogenese i dyretumormodeller [25], [26]. Imidlertid har anti-VEGF monoterapi begrenset kliniske fordeler for kreftpasienter og i høy dosering kan ofte føre til ulike bivirkninger som høyt blodtrykk, proteinuri, tromboser, og GIP [27], [28]. Derfor er videre forskning er nødvendig for å maksimalisere anti-tumor effekt samtidig som de minimerer antall bivirkninger fra antiangiogene terapi.
Økende bevis tyder på at kombinasjonen av angiogeneseinhibitorer med kjemoterapi produsert bedre terapeutiske resultater i behandling av kreft [29] – [35]. En fase III klinisk studie viste at en kombinasjon av anti-VEGF monoklonalt antistoff bevacizumab med karboplatin-paclitaxel betydelig forbedret total overlevelse (OS) i lungekreftpasienter sammenlignet med kjemoterapi alene [36]. Det er således klinisk relevant for å utforske flere kombinasjoner mellom anti-angiogene midler og regimer for chemo flere terapeutiske alternativer.
Gitt den brede anvendelse av gemcitabin i behandling av NSCLC, er det viktig å bestemme om kombinasjonen av en antiangiogen agent med gemcitabin kan gi noen klinisk nytte. Nylig ble en fase III-studie (benytte prøve) som sammenlignet bevacizumab pluss cisplatin-gemcitabin til chemocherapy (cisplatin-gemcitabin) viste en forbedret fremgang overlevelse, men ikke total overlevelse [37]. Det er fortsatt en utfordring å forlenge den totale pasientoverlevelse på toppen av gemcitabin terapi.
VEGF-Trap er en kimære VEGF lokkefugl reseptor-Fc fusjonsprotein, og har nylig blitt godkjent av US FDA for metastatisk kolorektalcancer [12]. Sammenlignet med bevacizumab, er VEGF-Trap et mer potent angiogenese hemmer på grunn av sin høyere affinitet til VEGF. I tillegg kan VEGF-felle også blokkere PlGF som også er et pro-angiogen faktor. Det ville således være interessant å vurdere om kombinasjonen av VEGF-felle og gemcitabin kan resultere i en mer effektiv terapi for lungekreft.
I den foreliggende undersøkelse har vi antatt at en kombinasjonsterapi som består av VEGF-felle og gemcitabin kunne oppnå forbedrede antitumoreffekter. For å teste denne hypotesen, undersøkte vi den terapeutiske effekten av denne kombinasjonen terapi i en kreft modell LLC lunge. Resultatene viste at kombinasjonsbehandling med VEGF-Trap og gemcitabin gitt mer terapeutiske fordeler enn hver enkelt modalitet. Kombinasjonsbehandling hadde betydelig høyere hemmende effekt på tumorvekst og forlenget overlevelse, ikke bare hemme tumor angiogenese og celledeling, men også øke celle apoptose i tumorcellene.
For å utforske mulige mekanismen bak den forbedrede anti- svulst effekt hos VEGF-felle og gemcitabin kombinasjonsbehandling, ble tumor vevsekstrakter undersøkt ved western blot for proteinekspresjon. Resultatene viste at VEGF-felle eller gemcitabin alene nedregulert ekspresjon av proliferasjon (Cyclin D1), anti-apoptose (Pro-Caspase-3, Bcl-2), og invasjon (MMP2, MMP9) relaterte proteiner, men kombinasjonen behandling resulterte i en mer betydelig nedregulering av disse markørene sammenlignet med monoterapi. Denne informasjonen var konsistent med resultatene fra immunhistokjemisk analyse og TUNEL analysen, støtter ideen om at kombinasjonsbehandling av VEGF-Trap og gemcitabin kan forbedre anti-tumor effekt.
Den kraftige effekten av VEGF hemming av VEGF-Trap merker denne agenten en ideell partner for kombinasjon med tilnærminger rettet mot andre mekanismer for tumorprogresjon. I klinikker, kan VEGF-Trap terapi tilby tilleggsfordeler gjennom normalisering av tumor blodkar, noe som reduserer interstitiell press og fartøy permeabilitet, og øker levering av andre agenter inn i tumorvev, som kan gjøre kreftcellene mer følsomme for cellegift [38] – [40]. Kombinasjonen av kontinuerlige VEGF inhibering av VEGF-felle med andre behandlingsmetoder kan representere en mer optimal terapeutisk alternativ i mange tumortyper.
Vårt Resultatene antydet at kombinasjonen av VEGF-felle og gemcitabin kan være en mer effektivt alternativ for human lungekreft, som kan danne grunnlag for en begrunnelse for kliniske studier for å undersøke fordelene ved kombinasjonsbehandling av VEGF-Trap og gemicitabine i lungekreft.
i konklusjonen, kombinasjonsbehandling av VEGF -felle og gemcitabin resultert i forbedret anti-tumor effekt ved LLC tumormodell. Kombinasjonsterapi inhiberte tumorvekst og forlenget dyr overlevelse gjennom trykkes tumor angiogenese og celleproliferasjon, samt øket tumorcelle-apoptose. VEGF-Trap /gemcitabin kombinasjonsbehandling kan utgjøre en lovende strategi for menneskelig lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
kvalitet og aktivitet av VEGF-Trap. (A) Kvaliteten på VEGF-felle ble bestemt ved reduserende SDS-PAGE for å vise som et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 50 kD; (B) VEGF-Trap viste en potent bindingsaktivitet til mus VEGF som bekreftes av en direkte bindingsanalyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068589.s001 plakater (TIFF)
Figur S2. Host Sammenligning av biologiske funksjonene LLC og Luc-LLC celler. Cellemorfologi og migrasjon (A) er veksten (B), og tumordannelsesevne (C) av LLC og Luc-LLC celler ble utført ved sårtilheling, MTT-analysen og subkutan tumormodell vurdering, henholdsvis, noe som viste ingen forskjell mellom de transgene og ikke-transgene celler. Scale bar, 200 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068589.s002 plakater (TIFF)
Takk
Vi takker Eli Lilly and Company Shanghai for vennlig å gi gemcitabin (Gemzar).
