Abstract
Mycoplasma infeksjon i menneskelig og dens forurensning i cellekulturer er over hele verden problemer. Legemidlene som er tilgjengelige for forhindring eller behandling av mykoplasmainfeksjon lider av lav følsomhet, sterk motstand og høy toksisitet. Vår tidligere arbeid viste at
Mycoplasma hyorhinis product: (
M
.
hyorhinis
) infeksjon ble formidlet av samspillet mellom p37 av
M
.
hyorhinis Hotell og Annexin A2 (ANXA2) av vertsceller, men overføringsverdi av denne mekanismen var ukjent. Heri, syntetiserte vi den N-terminale fra ANXA2 polypeptid (A2PP) og fant at A2PP kunne redusere infeksjon av
M
.
hyorhinis
til magekreftceller og blokkere
M
.
hyorhinis
infeksjon-indusert celle migrasjon. Videre fant vi at A2PP kunne redusere
M
.
hyorhinis
forurensning av passasjen celler. Videre, sammenlignet med de kommersielle antibiotika som vanligvis brukes i cellekultur for å forhindre
M
.
hyorhinis
infeksjon, A2PP viste en mer effektivitet, men en lav toksisitet på cellevekst. Dermed vår studie for første gang avslørte A2PP potensial for behandling og forebygging av
M
.
hyorhinis
infeksjon
Citation. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-terminal polypeptid av Annexin A2 Reduserer Infeksjon av
Mycoplasma hyorhinis
til magekreft Cells . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10,1371 /journal.pone.0147776
Redaktør: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Tyskland
mottatt: 16 oktober 2015; Godkjent: 07.01.2016; Publisert: 26 januar 2016
Copyright: © 2016 Yuan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papiret. Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltredelse no.GSE73777)
Finansiering:. Finansiert av National Natural Science Foundation of China (81572532). https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC har mottatt finansiering. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskript
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Patogene mykoplasma, inkludert Mycoplasma pneumoniae (
M
.
pneumoniae
), mycoplasma hyorhinis (
M
.
hyorhinis
), oral mykoplasma (
M
.
orale
) og Mycoplasma genitalium (
M
.
genitalium
), tilhører klasse Mollicutes, som er den minste mikroorganisme levende i naturen og uavhengig av hverandre kan duplisere [1-2]. Mange studier viser at infeksjon med disse mykoplasma var assosiert med kreftutvikling [3-8].
M
.
orale
forårsaker kromosom abnormitet i humane diploide celler og induserer celletransformasjon [6]. Infeksjon med
M
.
hyorhinis
eller
M
.
genitalium
kan øke migrasjon og invasivitet av prostata epitelceller [3].
M
.
hyorhinis
infeksjon har vært knyttet til leddgikt, serositt, ufruktbarhet og kreft av menneskelig [9-12].
I tillegg mycoplasma forurensning i cellekultur er et alvorlig problem, og frekvensen av passasjen celler smittet ved mycoplasma er høy. Cellekultur er mye brukt i miljø-og biovitenskap, for eksempel i den grunnleggende forskning, klinisk studie forskning, utvikling og produksjon av biologiske produkter, samt innen biofarmasøytisk og vaksineproduksjon. Hindre cellene fra mikrobiell forurensning er avgjørende for å sikre kvaliteten på forskningen. Den mycoplasma forurensning er det mest vanlig problem i cellekultur med en hyppighet på 30% -60% [1]. Det ble vist at fire arter av mykoplasma står for mer enn 95% av infeksjon i cellekultur, inkludert
M
.
orale
, arginin mykoplasma (
M
.
arginini
),
M
.
hyorhinis
, og Levin ingen Acholeplasma (
A
.
laidlawii
) [13,14,15,16]. På grunn av liten størrelse, mycoplasma er neppe å bli funnet under lysmikroskop og er lett oversett av forskere. I de senere år tallrike antibiotika som brukes for mycoplasma behandling gjentatte ganger resulterte i fremveksten av mycoplasma motstand. Av disse grunner er det viktig å utvikle nye midler for å forebygge eller redusere mykoplasmainfeksjon.
Vårt tidligere arbeid viste at
M
.
hyorhinis
infeksjon avhenger av samspillet av p37 (major membran protein av
M
.
hyorhinis
) og vert ANXA2 gjennom sine N-terminal domener. Vi har også funnet polyklonale antistoff mot p37 kan blokkere infeksjon av
M
.
hyorhinis Hotell og nedgang
M
.
hyorhinis
-promoted migrasjon av magekreft celle [17]. Basert på disse funnene, hevet vi en hypotese om at peptid, syntetisert i henhold til aminosyresekvensen av ANXA2 N-terminale område (fra 1
st til 30
th aa, her navngitt vi dette peptid som A2PP), kan blokkere
M
.
hyorhinis
smitte via sin konkurranse med ANXA2 og muligens brukes som et legemiddel for å forebygge
M
.
hyorhinis
infeksjon i cellekultur. I denne studien har vi testet denne hypotesen, og også sammenlignet effekten av A2PP med andre legemidler for å forebygge
M
.
hyorhinis
infeksjon.
Materialer og metoder
Cell Culture
AGS magekreft cellelinje var fra American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 magekreft cellelinje ble etablert ved Peking University Folkets sykehus og ble kjøpt fra Cell Culture Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). AGS og BGC823 celler ble dyrket i RPMI-1640 medium tilsatt 10% føtalt kalveserum oppnådd fra Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). Mycoplasma testen ble gjennomført før hvert nytt eksperiment ved PCR forsterkning av
M
.
hyorhinis p37
.
Mycoplasma Formering og Co-Culture
Mycoplasma forplantning og co-kultur ble utført som tidligere rapportert [17,18,19].
antistoffer og reagenser
Anti-p37 monoklonalt antistoff PD4 ble generert og preget tidligere [5,20,21]. Polyklonalt anti-p37-antistoff ble oppnådd fra immunisere kaniner med GST-p37 fusjonsprotein etter standardprotokollen. Anti-EGFR og Anti-fosfor-EGFR ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (CST, USA). Anti-ANXA2 var fra Novus Bioteknologi (Novus Bioteknologi, USA). Anti-fosfor-ANXA2 var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1
st til 30
th aa) og ulike avkortede A2PP peptider, inkludert A2PP-ND4 (5
th til 30
th aa), A2PP-ND8 (9
th til 30
th aa), A2PP-Nd12 (13
rd til 30
th aa), A2PP-Nd16 (17
th til 30
th aa), A2PP-CD4 (1
st til 26
th aa), A2PP-CD8 (1
st til 22
nd aa), A2PP-CD12 (1
st til 18
th aa), A2PP- CD16 (1
st til 14
th aa), sammen med tilfeldige kontroll peptider (ConP) ble syntetisert ved Sbsbio (Beijing, Kina). Antimikrobielle mycoplasma I (MYCO I) og mycoplasma II (MYCO II) ble kjøpt fra M C genteknologi (Beijing, Kina). Ciprofloxacin (CIP) var fra Double-Crane Pharm (Beijing, Kina).
Påvisning av
M
.
hyorhinis
av kvantitativ PCR (qPCR)
DNA ble ekstrahert fra AGS eller BGC823 celler etter
M
.
hyorhinis
infeksjon ved DNA-lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20, og 200 mg /l proteinase K) i overensstemmelse med standardprotokollen. qPCR ble utført med 30 ng DNA og SYBR Grønn Real-time PCR 2 × premix kit (Takara, Otsu, Japan) ved hjelp av trinn en system fra ABI (Foster City, CA, USA). Reaksjons programmer og
p37
-spesifikke primere (forward: 5′-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 «reverse: 5′-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3») ble rapportert tidligere [22]. Å sammenligne
M
.
hyorhinis
DNA-nivåene i cellene,
GAPDH plakater (frem: 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 «, reversere: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3») ble forsterket som kontroll og dataene ble analysert ved hjelp 2
-ΔΔCt metode. Primere ble syntetisert ved Sangon (Shanghai, Kina).
Western blotting
Cellene ble høstet fra kultur tallerken med 2 × SDS lasting buffer. Polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [23].
Cell-ELISA
96-brønn ble sådd med celler (1 x 10
4 /vel), etterfulgt av behandling av angitte peptider og infeksjon av
M
.
hyorhinis
i 24 timer. Cellene ble immobilisert med 0,05% glutaraldehyd i 10 minutter, deretter celle ELISA ble utført som beskrevet tidligere [24].
Solid-Phase bindingsanalyse og Pull-Down analysen
rekombinant GST-p37 og GST-proteiner ble samlet og renset som tidligere beskrevet [17]. GST-p37 og GST ble fortynnet i buffer (0,1 M Na
2CO
3, 0,1 M NaHCO
3, pH 9,6) og belagt på en 96-brønners plater ved 4 ° C over natten. Platene ble vasket med PBS tre ganger og blokkert med 5% skummet melk /PBS ved romtemperatur (RT) i 2 timer. Etter vasking med PBS, indikerte konsentrasjoner av biotin-konjugert A2PP (syntetisert ved Sbsbio) ble tilsatt og inkubert ved RT i 2 timer. Etter vasking med PBST til 3 ganger, streptavidin-HRP-konjugert (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Etter farge utvikling med ortofenylendiamin (Sigma), optisk tetthet på 490 nm (OD490) ble registrert med en mikroplateleser (Bio-Rad 550). For pull-down analysen, 100 ng GST-p37 eller GST protein var co-inkubert med 20 mikrometer biotin-A2PP og streptavidin perler (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) i bindingsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF og 1 x fullstendige protease-inhibitorer) ved 4 ° C over natten. Bunnfallet ble vasket med bindingsbuffer for fire ganger og analysert ved Western blotting.
Co-Immunpresipitasjon
M
.
hyorhinis
infiserte celler (BGC823 eller AGS) ble homogenisert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF og 1 x fullstendige proteaseinhibitorer) ved 4 ° C i 10 min. Etter 12, 000 g sentrifugering i 10 minutter ved 4 ° C, ble supernatantene gjenvunnet. Protein lysates (500 mikrogram) inkubert med 20 mikrometer A2PP eller ConP, 1 mikrogram anti-ANXA2 pluss protein G sepharosekuler (GE Healthcare) ved 4 ° C over natten. Pre-immun IgG (1 pg) ble anvendt som kontroll. Utfelte Kulene ble vasket med lyseringsbuffer til fire ganger, eluert i 2 x ladningsbuffer, kokt, og analysert ved Western blotting.
Immunofluorescens-analyse
Cellene ble sådd ut på dekkglass og dyrket over natten. Neste dag ble cellene behandlet med angitte peptider og infisert med
M
.
hyorhinis
i 24 timer. Da celler ble vasket med iskald PBS tre ganger, fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved RT. Etter blokkering i 1 time i 5% BSA /PBS, cellene ble inkubert med angitte antistoffer ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble cellene vasket 3 ganger med PBST igjen og inkubert med FITC eller TRITC merkede sekundære antistoffer i 30 minutter ved RT. Etter vasking med PBS og kontra med DAPI, ble cellene montert på 50% glycerol /PBS. En ZEISS LSM780 konfokal mikroskop (Zeiss Microsystems, Oberkochen, Tyskland) ble brukt til å observere lokalisering av indikert proteiner.
Cell Migration analysen
Transwell kammer med 8,0 mikrometer pore membraner (Corning, NY, USA) ble anvendt i celle migrasjon analysen. Den nederste kammeret ble fylt med 800 ul medium inneholdende 10% FBS som kjemotiltrekkende. Cellene ble resuspendert i serumfritt medium som inneholder
M
.
hyorhinis
pluss A2PP eller ConP, deretter ble forsiktig overført til den øverste kammeret til hver Transwell-apparat ved en tetthet på 2 x 10
5 celler /ml (120 pl /kammer). Celler ble tillatt å migrere i 24 timer ved 37 ° C. Den øverste overflaten av hver membran ble ryddet av celler med en bomullspinne. Celler penetrert til den nedre side av membranen ble fiksert i kald metanol, farget med 0,1% krystallfiolett og tellet i ni tilfeldig valgte mikroskopiske felt per brønn. Hver prøve ble fremstilt i triplikate kamre, og hvert eksperiment ble gjentatt minst 3 ganger.
Cell Proliferation Assay
magecancer-celler ble sådd ut i 96-brønners kulturplater ved tetthet på 5 x 10
3/100 ul /brønn i tre paralleller, og ble behandlet med angitte reagenser. Spredning av celler ble kvantifisert ved cellen samløpet med en CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
microarray analyse og Real-Time RT-PCR
AGS og BGC823 celler ( 1 × 10
6 per 10 cm
2 plate) ble behandlet med A2PP, CIP, MYCO jeg og MYCO II for 24 timer, vasket med PBS, og høstet i Trizol reagens. RNA prøver ble undersøkt i OE Bioteknologi (Shanghai, Kina) ved hjelp av Affymetrix Genechip
® PrimeView
™ Menneskelig Gene Expression Array. Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltredelse no.GSE73777). Rådata ble registrert ved hjelp av Affymetrix Genechip kommandokonsollen (versjon 4.0, Affymetrix). Deretter Genespring programvaren (versjon 12.5, Agilent Technologies) ble ansatt for å fullføre grunnleggende analyse med rådata. Til å begynne med, rådata ble normalisert med RMA-algoritmen. Differensielt uttrykte gener ble deretter identifisert gjennom ganger endring. Terskelen satt for opp- og ned-regulerte gener var en fold endring ≥ 2,0. Etterpå, GO og KEGG analyse ble brukt for å velge ut gener som er relatert til cellesyklus og celle apoptose. Real-time RT-PCR ble brukt til å validere resultatene av microarray og utført i henhold til produsentens instruksjoner (SYBR, Toyobo). Expression nivåer av beslektede gener ble normalisert gjennom
GAPDH
og 2
-ΔΔCT ble brukt til å beregne relativ genekspresjon. De primere for real-time RT-PCR (
ATF
, fremover, 5′-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 «, revers, 5′-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3»;
DDIT3
, fremover, 5 « -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 «, revers, 5′-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3»;
CEBPB
, fremover, 5′-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 «, revers, 5′-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3») ble syntetisert ved Sangon
Statistical Analysis
data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjellene ble analysert ved ANOVA i SPSS 11.0 programvare og P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Mikromatrise Tiltredelse Antall
Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltredelse no. GSE73777).
Resultater
A2PP har ingen effekt på levedyktigheten eller Migrasjon av magekreft Cells
for å vurdere rollen til ANXA2 sin N-terminal domene i
M
.
hyorhinis
infeksjon, vi først syntetisert A2PP peptid som tilsvarer N-terminal av ANXA2 (fig 1A). Biotin-merket A2PP ble vist å spesifikt interagere med GST-p37 i den faste fase bindingsanalysen (figur 1B) og pull-down-analysen (figur 1C). Vi la merke til at A2PP ikke påvirker morfologi av AGS og BGC823 celler (figur 1D). I tillegg, i konsentrasjoner mindre enn 20 uM, A2PP hemmet ikke celleproliferering (figur 1E), hvilket antyder at A2PP har minimal toksisitet for celler. EGFR har vært innblandet i regulering ANXA2 fosforylering [17,25,26], mens A2PP hadde ingen effekt på phosphorylations eller protein nivåer av EGFR og ANXA2 [2A]. Videre A2PP hadde ingen effekt på migrasjon av AGS og BGC823 celler (figur 2B og 2C). Cellulær lokalisering av ANXA2 er regulert av dets fosforylering, som er kritisk for dens funksjon [17,27,28]. Vi fant A2PP ikke endre subcellulære lokalisering av endogen ANXA2 (Fig 2D). Disse resultatene indikerer at A2PP alene har ingen effekt på maligne fenotyper eller EGFR-signalisering ANXA2 av gastrisk kreft celler.
(A) Skjematisk diagram av aminosyresekvensen til N-terminalen i ANXA2 polypeptid (A2PP). (B) Fast-fase-bindingsanalyse. OD490 av 15 nM biotin-A2PP til GST ble satt som en og relative bindinger ble caculated. Middelverdi ± SD fra tre uavhengige forsøk med triplikate prøver. ***, P 0,001. (C) Streptavidin pull-down-analyser identifiserte Biotin-A2PP som et GST-p37 bindende polypeptid. (D) Cell morfologi av AGS og BGC823 følgende angitte konsentrasjoner av A2PP behandling for 24 timer og 48 timer. (E) Spredning av magekreft cellelinjer (AGS og BGC823) behandlet med økende konsentrasjon av A2PP for 72 timer. Mean ± SD fra tre eksperimenter med triplikatprøvene.
(A) Western blotting av fosfor-EGFR, fosfor-ANXA2, EGFR, og ANXA2 fra AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP i 24 timer. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (B) Representative bilder av migrasjon av AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP i 24 timer. Skala barer, 200 mikrometer. (C) Statistisk oppsummering av migrasjonsanalyse. Middelverdi ± SD fra tre eksperimenter med triplikate prøver. ns, ingen betydning. (D) Immunofluorescens av ANXA2 lokalisering (rød) i AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP i 24 timer. Skala barer, fem mikrometer.
A2PP Reduserer
M
.
hyorhinis
Infeksjon
Vårt tidligere arbeid har vist at N-terminal av ANXA2 medierer
M
.
hyorhinis
infeksjon [17]. Som vist av resultatet av celle ELISA-analysen, fant vi at
M
.
hyorhinis
infeksjon ble blokkert av A2PP på en doseavhengig måte i BGC823 og AGS celler, men ConP-behandlede celler ble fortsatt sterkt infisert av
M
.
hyorhinis plakater (figur 3A). Disse resultatene ble understøttet av qPCR-analyser (figur 3B). Konsekvent, A2PP også redusert protein nivåer av p37 protein i Western blotting-analyse (Fig 3C og 3D). I mellomtiden nivåer av phophos-AXNA2 og phophos-EGFR i infiserte celler ble nedregulert ved behandling med A2PP (Fig 3C og 3E), mens totale nivåer av AXNA2 og EGFR var relativt stabil (figur 3C). I immunfluorescens analyse, ble A2PP funnet å hemme
M
.
hyorhinis
infeksjon-indusert p37 akkumulering og samlokalisering mellom p37 og ANXA2 (fig 4A). I co-immunoprecipitation analysen med proteinlysatene fra
M
.
Hyorhinis
infiserte celler, redusert A2PP samspillet mellom p37 og ANXA2 (fig 4B). Sammen utgjør disse bevisene støttet ideen om at A2PP kan redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon og bekreftet våre tidligere funn om at N-terminal av ANXA2 er nødvendig for formidling
M
.
hyorhinis
infeksjon [17].
Cell ELISA analyse av p37 (OD 490 nm) av p37 protein i AGS og BGC823 celler infisert med 10
5 CCU (farge skiftende enheter) /ml
M
.
hyorhinis Hotell og behandlet med A2PP eller ConP i 24 timer.
M
.
hy
,
M
.
hyorhinis
. Middelverdi ± SD av 3 forsøk med tre paralleller for hver prøve. (B) Kvantitativ PCR (qPCR) analyse av
p37
i AGS og BGC823 celler som er infisert og behandlet som i (A). Middelverdi ± SD av 3 forsøk med tre paralleller for hver prøve. (C) Western blotting av p37, p-EGFR, EGFR, p-ANXA2 og ANXA2 fra AGS og BGC823 celler behandlet som i (A). (D) Kvantifisering av p37 protein nivåer av i (C). Nivåer av p37 ble normalisert til de av GAPDH. Middelverdi ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. (E) Kvantifisering av p-EGFR og p-ANXA2 nivået i (C). Nivåer av p-EGFR eller p-ANXA2 ble normalisert til de av EGFR eller ANXA2. Middelverdi ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. **, P 0,01; **, P 0,001; ns, ingen betydning.
(A) lokaliseringer av ANXA2 (rød) og p37 (grønn) i BGC823 og AGS celler infisert med 10
5 CCU /ml
M
.
hyorhinis Hotell og behandlet med A2PP eller ConP i 24 timer. Colocalization ble vist av fusjonerte signaler (gul). Skala barer, fem mikrometer. (B) Co-immunoprecipitation analyse for å validere ANXA2-p37 samhandling i BGC823 og AGS celler infisert med
M
.
hyorhinis Hotell og behandlet med A2PP eller ConP i 24 timer.
A2PP undertrykker
M
.
hyorhinis
indusert Migration
Våre tidligere studier antydet at
M
.
hyorhinis
infeksjon kan fremme migrasjon av magekreftceller [17, 23]. I denne studien har vi lagt merke til at
M
.
hyorhinis
-promoted migrering av magekreftceller ble ikke påvirket av ConP, men ble doseavhengig inhibert av A2PP (figur 5A og 5B). Disse resultatene tyder på at A2PP hemmet
M
.
hyorhinis
indusert migrasjon, som ble assosiert med sin evne til å redusere infeksjons fremmet phosphorylations av EGFR og ANXA2 (Fig 3C og 3E).
(A) Migrering av 10
5 CCU /ml
M
.
hyorhinis
-infected AGS og BGC823 celler behandlet med angitte peptider i 24 timer. (B) Oppsummering av migrasjons assays (n = 3). Middelverdi ± SD av 3 uavhengige eksperimenter med triplikate prøver. ***, P . 0.001
A2PP Har Essential Motif til å øke
M
.
hyorhinis
Infeksjon
For å karakterisere det kritiske motiv av A2PP, forsøkte vi å finne ut om ulike avkortede peptider av A2PP (figur 6A) kunne reduseres
M
.
hyorhinis
infeksjon. I qPCR analyse, A2PP og avkortede peptider A2PP-ND4, ND8, Nd12, CD4, CD8, og CD12 redusert
M
.
hyorhinis
infeksjon i mage kreftceller, men A2PP-Nd16 og A2PP-CD16 mislyktes i å redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon (fig 6B). Tilsvarende mønster av inhibering ble oppnådd fra Western blotting-analyse (figur 6C). Disse resultatene tyder på at det eksisterer et bestemt motiv av A2PP er essensiell for dens evne til å redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon. For ytterligere å kartlegge kjerne sekvenser av dette potensialet motiv, syntetisert vi de to peptider tilsvarende 11
th -20
th aa (betegnet som A2PP-10AA) og 13
th -18
th aa (betegnet som A2PP-6aa) (figur 7A). I qPCR analysen, kunne begge peptider redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon (figur 7B), som ble støttet av Western blotting-analyse (figur 7C). Spesielt, de inhiberende virkninger av A2PP-10AA var bedre enn de til A2PP-6aa, men effekten av begge peptider var mindre robust som de av A2PP (figur 7B og 7C). Thesefore, de sentrale sekvenser (11
th -20
th) fra A2PP kan være avgjørende motiv for å hemme
M
.
hyorhinis
infeksjon.
(A) Skjematisk fremstilling av avkortede peptider av A2PP. (B) qPCR analyse av
p37
i AGS og BGC823 celler infisert med 10
5 CCU /ml
M
.
hyorhinis Hotell og behandlet med 20 mikrometer indikert peptider i 24 timer. Middelverdi ± SD av 3 forsøk med tre paralleller for hver prøve. (C) Western blotting av p37 fra AGS og BGC823 celler infisert og behandlet som i (B). Mean ± SD fra 3 uavhengige eksperimenter.
Skjematisk fremstilling av to forkortede former av A2PP. (B) qPCR analyse av
p37
i AGS og BGC823 celler infisert med 10
5 CCU /ml
M
.
hyorhinis Hotell og behandlet med 20 mikrometer indikert peptider i 24 timer. Middelverdi ± SD av 3 forsøk med tre paralleller for hver prøve. (C) Western blotting av p37 fra AGS og BGC823 celler infisert og behandlet som i (B). Middelverdi ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001.
Sammenligning av A2PP med andre rusmidler for å forebygge
M
.
hyorhinis
Infeksjon
M
.
hyorhinis
var en av de viktigste forurensningskildene cellekultur [13,14,15]. Den beste måten å eliminere
M
.
hyorhinis
infeksjon er å forkaste celler og raskt sterilisere alle kontaktet årene, men noen infiserte celler kan ikke byttes i flere tilfeller. Derfor er det viktig å bruke spesifikke antimikrobielle tilnærminger for å forebygge eller eliminere
M
.
hyorhinis
infeksjon. Det har vært forskjellige antimikrobielle midler for å hindre
M
.
hyorhinis
infiserer. For eksempel kan Ciprofloxacin (CIP) utrydde
M
.
hyorhinis
i en egnet konsentrasjon [29]. To antimikrobielle komponenter navngitt som mycoplasma I (MYCO I) og mycoplasma II (MYCO II) kunne redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon ved å blokkere protein og nukleinsyre syntese. Imidlertid kan noen bekymringer som lav følsomhet, sterk motstand og høy giftighet begrense sine søknader i cellekultur. Basert på disse vurderingene, mener vi det er nødvendig å sammenligne effektiviteten av A2PP, CIP, MYCO jeg og MYCO II i å forebygge
M
.
hyorhinis
infeksjon. Ved Western blotting og qPCR analyser, har vi funnet at A2PP sin hemmende effekt på
M
.
hyorhinis
infeksjon var lik som MYCO jeg, men var bedre enn de av CIP og MYCO II (Fig 8A og 8B). Interessant, fant vi ut at A2PP kan også effektivt eliminere
M
.
hyorhinis
infeksjon i sterkt infiserte celler i prosessen passeringer fra P
1 til P
3 (figur 8C og 8D). I tillegg, sammenlignet med MYCO I og II MYCO, A2PP hadde mindre hemmende effekt på celler proliferasjon (figur 9A). For å utforske mekanismene for A2PP, CIP, MYCO jeg og MYCO IIs virkninger på celler spredning, vi utførte microarray analyse og vist en undergruppe av forskjellig uttrykt gener i A2PP, CIP, MYCO jeg og MYCO II behandlede celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse viste økt uttrykk av apoptose relaterte gener (
ATF5
,
DDIT3
,
CEBPB
) ved MYCO I og MYCO II behandling, men små endringene var observert i A2PP og CIP grupper (figur 9b). Disse resultatene indikerer at A2PP har mindre toksisitet og bedre forebyggende potensial i å blokkere
M
.
hyorhinis
infeksjon i dyrkede celler.
(A) Western blotting av p37 fra AGS og BGC823 celler infisert med 10
5 CCU /ml
M
.
hyorhinis
og behandlet med A2PP (20 uM), CIP (4 ug /ml), MYCO I (5 mikrogram /ml), eller MYCO II (10 ug /ml) i 24 timer. Middelverdi ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. (B) qPCR-analyse av
p37
i AGS og BGC823 celler behandlet som i (A). Middelverdi ± SD av 3 forsøk med tre paralleller for hver prøve. (C) Western blotting av p37 fra AGS celler infisert med 10
5 CCU /ml
M
.
hyorhinis
og behandlet med A2PP i prosessen av cellepassasjer fra P
1 til P
3. Middelverdi ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. (D) qPCR-analyse av
p37
i AGS celler infisert og behandlet som i (C). Middelverdi ± SD fra 3 eksperimenter med triplikate prøver. **, P 0,01; ***, P 0,001; ns, ingen betydning.
(A) spredning av AGS og BGC823 behandlet med A2PP (20 mm), CIP (4 mikrogram /ml), MYCO I (5 mikrogram /ml), eller MYCO II (10 ug /ml) i 72 timer. Middelverdi ± SD fra 4 uavhengige eksperimenter med triplikate prøver. (B) RT-PCR analyse av
ATF5
,
DDIT3
,
CEBPB
i AGS og BGC823 celler behandlet med A2PP (10 mm), CIP (4 mikrogram /ml ), MYCO i (5 mikrogram /ml), MYCO II (10 ug /ml) i 24 timer. Mean ± SD fra 3 eksperimenter med triplikatprøvene.
Diskusjoner
Mycoplasma infeksjon og forurensning er fortsatt utbredt i dag og ta betydelig risiko for pasienter og forskningskvalitet. I de senere årene har flere studier antydet at mykoplasmainfeksjon var også assosiert med tumorgenese [3-8]. Mycoplasma infeksjon kan føre til DNA-skader, påvirke genekspresjon, og forstyrre cellesyklus sjekkpunkt og apoptotisk respons [30].
M
.
hyorhinis
ble funnet i 56% av magekreft, 55,1% av tykktarm kreft og 39,7% brystkreft vev [20]. Dessuten serologiske tester viste at 36% benign prostatahyperplasi (BPH) og 52% prostata kreft vev var
M
.
hyorhinis
positiv [4]. Disse studiene tyder på en mulig sammenheng mellom
M
.
hyorhinis
infeksjon og forekomst av svulster [4,20]. Dessuten, i prosessen med cellekulturen, de mest vanlige forurensningskildene er mykoplasma, bakterier og mugg, men den forurensning hastighet på mykoplasma er forholdsvis høyere [13]. Resultater fra ulike grupper har vist at frekvensen av mycoplasma forurensning varierte fra 15 til 80%, noen enda nådd 100% [15,31]. En analyse av DNA-sekvenser fra 1000 genomer prosjekt som innebar at 7% av prøvene ble forurenset av mycoplasma [32]. Imidlertid hindrer mykoplasmainfeksjon og forurensning er vanskelig. For det første, på grunn av pleomorfe, plastisitet, filtrerbarhet og lett oppløselighet, kunne mycoplasma passere gjennom mikrofiltreringsmembran lett, hvilket gjør dem finnes på vertscelleoverflaten eller for å bli endocytose av celler [1,13,33]. For det andre mangler mykoplasma cellevegger, hvilket gjør dem ufølsomme overfor antibiotika som inhiberer celleveggsyntese, for eksempel penicillin. Effektive antimikrobielle stoffer finnes, men deres kontinuerlige applikasjoner i cellekultur er ikke anbefalt på grunn av giftigheten til cellene. Endelig er mykoplasma en atypisk bakterier, som forårsaker difficulities i riktig diagnose [34].
En rekke anti-mykoplasma medikamenter har blitt utviklet, slik som erytromycin, leucomycin, roxitromycin, Ofloxacin, og Ciprofloxacin. Men de negative effektene, giftighet, og motstanden fortsatt bringe problemer for forurensning minking [10,11,35-38]. Dessuten kontinuerlig administrering av disse antibiotika kan ikke fullstendig eliminere mycoplasma for en eller enda flere uker [39,40]. Derfor er det viktig å finne nye måter som kan eliminere mykoplasma infeksjon eller forurensning effektivt og tidsriktig. Løsningen på dette målet kan sikkert bli funnet gjennom karakterisering av molekylære mekanismene bak mykoplasmainfeksjon.
Vår tidligere studie fant at samspillet mellom P37 protein med AXNA2 mediert
M
.
hyorhinis
infeksjon [17]. I denne studien vi først syntetisert den N-terminale polypeptid ANXA2 (A2PP) og validert dens spesifikk interaksjon med GST-p37-protein i fast-fase-binding og streptavidin pull-down-analyser. Inspirert av et slikt samspill, lurte vi på om A2PP kunne motvirke smitte av
M
.
hyorhinis
. Vi fant ut at A2PP, i en passende konsentrasjon (20 mm), redusert
M
.
hyorhinis
infeksjon, hemmet infeksjon-forfremmet migrasjon, og redusert smitte provoserte phosphorylations av EGFR og ANXA2 i mage kreftceller. Disse effektene ble assosiert med redusert samhandling mellom p37 og ANXA2. Det bør bemerkes at A2PP alene utstilt minimal effekt på spredning av celler og phosphorylations av EGFR og ANXA2, noe som tyder på at A2PP er sannsynlig å være et nyttig reagens for å redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon. Denne forestillingen ble støttet av sammenligninger av A2PP tallet og kommersielle antibiotika «effekter på celleproliferasjon og
M
.
hyorhinis
infeksjon, som viste at A2PP faktisk hadde mindre toksisitet overfor celler, men sterk evne til å motvirke infeksjon.
Til tross for at A2PP, en 30 aa polypeptid, kan redusere
M
.
hyorhinis
infeksjon effektivt, vi fortsatt trenger å forstå om forkortede former av A2PP kunne oppnå tilsvarende anti-
M
.
hyorhinis
evne.
