Abstract
Denne studien beskriver allergi mekanismen til termisk stress ved histondeacetylase hemmere (HDACIs) i lungekreftceller og viser at Ku70, basert på sin acetylering status, formidler beskyttelse av lungekreft fra hypertermi ( 42,5 ° C, 1-6 timer). Ku70 regulerer apoptose ved avsette pro-apoptotiske Bax. Imidlertid er dets rolle i varmespenninger ikke fullt ut forstått. Funnene viste at pre-behandling lungekreftceller med HDACIs, nikotinamid (NM) eller Trichostatin A (TSA) eller begge betydelig forbedret hypertermi-indusert Bax-avhengig apoptose i PC-10 celler. Vi fant ut at hypertermi induserer sirt-en, Sirtuin, oppregulering men ikke HDAC6 eller sirt-3, derfor transfeksjon med dominant negativ sirt-1 (Y /H) også eliminert beskyttelse og resulterte i mer celledød ved hypertermi, i H1299 cellene gjennom Bax aktivering. Hypertermi alene primet lungekreftceller til apoptose uten fremtredende død. Etter hypertermi Bax ble oppregulert, ble BCL-2 nedregulert, forholdet Bax /BCL-2 ble inversed og Bax /BCL-2 heterodimer ble skilt. Selv om hypertermi ikke påvirke total Ku70 uttrykk nivå, det stimulerte Ku70 deacetylering, som i sin tur kan binde mer Bax i PC-10-celler. Disse funnene tyder på en flukt mekanisme fra hypertermi-indusert Bax aktivering. Hvis du vil kontrollere hvilken rolle Ku70 i denne beskyttelsesmekanisme, ble Ku70 brakt til taushet av siRNA. Ku70 stanse betydelig sensitivisert de lungekreftceller til hypertermi. De Ku70 KD celler gikk cytotoksiske G1 arrest og caspase-avhengig apoptose i forhold til egge transfektanter som viste bare G2 /M cytostatisk arrest i cellelinjene undersøkt, noe som tyder på en ekstra cellesyklusavhengig, roman, rollen Ku70 i beskyttelse mot hypertermi. Til sammen våre data viser en Ku70 avhengig beskyttelsesmekanisme fra hypertermi. Målretting Ku70 og /eller dets acetylering under hypertermi kan representere et lovende terapeutisk tilnærming for lungekreft
Citation. Hassan MK, Watari H, Salah-Eldin A-e, Sultan AS, Mohamed Z, Fujioka Y, et al. (2014) histondeacetylase hemmere bevisst lungekreft celler til Hypertermi: Involvering av Ku70 /sirt-1 i Thermo-beskyttelse. PLoS ONE 9 (4): e94213. doi: 10,1371 /journal.pone.0094213
Redaktør: Sue Cotterill St. Georges, University of London, Storbritannia
mottatt: 30 august 2013; Godkjent: 14 mars 2014; Publisert: 11 april 2014
Copyright: © 2014 Hassan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av tilskudd-i-hjelp HW for Scientific Research (C 22591844 og 20659255) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En langvarig forskning interessen har vært rettet mot de spesifikke mekanismene som er ansvarlig for utvikling av kreft celle motstand mot ulike behandlingsformer. Målretting disse mekanismene kan forsterke den spesifikke ødeleggelse av kreftceller. Hypertermi er en modalitet som brukes i klinisk setting, for behandling av mange kreftformer; det er vanligvis brukes i kombinasjon med radioterapi og /eller kjemoterapi [1], [2]. Imidlertid er en vesentlig hindring for effektiviteten av hypertermi er utvikling av cellulær motstand, som blokkerer apoptotisk signalering og fremmer celleoverlevelse [3], [4]. Denne motstand bevirker begrensning av apoptose etter hypertermi [5], [6]. Dermed identifisering av de mekanismene som er ansvarlig for utviklingen av termo motstand i kreftceller, kan bidra til å forbedre spesifikk målretting for å forbedre mobilnettet følsomhetsbehandlingsresultatene til hypertermi. Motstand mot apoptose er en vanlig egenskap ved kreftceller [3], [7]. Apoptose induseres ved, ytre og indre baner [8]. Binding av ligander til en død reseptor aktiverer ytre vei; den indre vei aktiveres av cellen stress, slik som DNA-skade. Den BCL-2 proteiner familie regulerer indre vei; den påvirker permeabiliteten av den ytre mitokondriemembranen [9]. Medlemmer av BCL-2-familien er delt inn proapoptotiske proteiner som Bax, Bak, og Bok og antiapoptotic proteiner inkludert BCL-2, BCL-XL, BCL-w, og Mcl-1 [10] – [13].
Opphopning av Bcl-2 og Bcl-xL kan beskytte cellene mot apoptose, fremme celle overlevelse og akselerere tumorvekst ved å avsette pro-apoptotiske Bax. Ku70 er et annet anti-apoptotiske molekyl; det naturligvis binder Bax, avsette det fra aktivering eller mitokondriell translokasjon i trykklette celler [14], [15]. Ku70 er en av komponentene i Ku70 /Ku80 heterodimeren som er involvert i DNA-skade reparasjon [16]. Acetylering av to kritiske lysiner, ved karboksylsyreenden av Ku70, regulerer binding /dissosiasjon til Bax, og dette påvirker den etterfølgende følsomheten av cellen til apoptotiske stimuli [14]. Bare deacetylert Ku70 kan binde seg til Bax. Høy uttrykk for Ku70 i kreftceller vil forbedre DNA reparasjon evne og reduserer Bax-mediert apoptose; Derfor, Ku70 kan spille en rolle i behandlingen motstand. Den apoptose-relatert aktivitet av Ku70 er uavhengig av dens rolle i DNA-reparasjon [17]. Den Ku70 acetylering /deacetylering syklus er regulert av histon acetyl transferaser og histone deacetylases (HDACs). Ku70 er et mål for noen medlemmer av klasse I /II HDAC og klasse III HDAC [18], [19]. Den HDAC familien av proteiner som er delt inn i to kategorier: sink-avhengige enzymer (HDAC1-11), oppdelt i klasse I og klasse II som blir hemmet av Trichostatin A (TSA) og NAD
+ – avhengige enzymer (klasse III; SIRT1-7) som hemmes av nicotinimide (NAM). Mer presist, sirt-1, et medlem av klassen III HDACs, spiller en avgjørende rolle i Ku70 deacetylering, som forbedrer beskyttelse av celler fra Bax under caloric begrensning [19]. Flertallet av kreftceller over-uttrykker SIRT1 [20]. Dermed rettet mot Ku70 avhengig beskyttelse mot apoptose, ved HDAC hemmere som hemmer sirt-en, kan være en effektiv strategi for sensibiliserende kreftceller til forskjellige behandlingsformer. I denne studien er vår modell som lungekreftceller er betydelig drept av hypertermi når forbehandlet med HDACIs sammenlignet med hypertermi bare. Sirt-en og dens mål, Ku70, står sentralt i den mekanismen som lungekreftceller kan unnslippe termisk-indusert død. Endringer i aktiviteten til Bax, Ku70 acetylering og cellesyklusen ble undersøkt i løpet av eksponering for hypertermi. I tillegg ble effektiviteten av sekvensspesifikk målretting av Ku70, ved hjelp av siRNA, også undersøkt med hensyn til sensibilisering lungekreftceller til hypertermi. Ku70 ser ut til å spille en avgjørende rolle i å beskytte celler fra hypertermi sannsynligvis ved avsette oppregulert Bax.
Materialer og metoder
Cellelinjer
To menneske, ikke- småcellet carcinom cellelinjer: PC-10 [21], og H1299, ble kjøpt (American Type Culture Collection, ATCC) og dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum ( Sigma, St. Louis, MO, USA) (komplett medium) i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C. Det dyrkede medium ble erstattet med friskt komplett medium hver tredje dag.
Antistoffer og reagenser
Anti-human Bax kanin polyklonalt antistoff (pAb) og anti-human Ku70 mus monoklonalt antistoff (mAb) var kjøpt fra BD Biovitenskap (Erembodegem, Belgia); et annet anti-humant Ku70 mus mAb for immunopresipitering, anti-human HDAC-6 og anti-human sirt-3-kanin (pAb) ble anskaffet fra Abcam (Cambridge, UK); anti-human Ku80 mus-mAb fra signaltransduksjon (USA), antihuman sirt-1 og anti pan-K (acetylert lysin) fra Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA); anti human BCL-2 mus mAb ble kjøpt fra DAKO (Glostrup, Danmark). Påvisning av immunoblotting ble utført med anti-mus eller anti-kanin sekundære HRP-konjugert Antistoffer (Dako) utvannet 1: 2000. Immunfluorescens farging ble utført ved hjelp av anti-kanin FITC-konjugert sekundære antistoffer (Dako) utvannet 1:. 50. histondeacetylase hemmere (HDACIs), nikotinamid (NAM) og Trichostatin (TSA) ble kjøpt fra Wako Chemicals, Japan
HDACI behandling optimalisering
Hver HDACI brukt ble screenet for sin sub-dødelig dose i et pilotforsøk. Cellelevedyktigheten ble evaluert ved hjelp av MTT-analysen, med eller uten DMSO bare, og tilsetning av forskjellige doser av hver av de HDACIs; 300 nM av TSA og 20 mM av NAM ble valgt som ikke-toksiske doser og videre anvendes i de etterfølgende eksperimenter.
Termisk behandling
Cellene festet til bunnen av kulturskåler, ble pre-kultur i 48 timer, og ble deretter inkubert i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved enten 37,0 ° C (kontroll) eller 42,5 ° C i 1-9 timer.
Strømningscytometri, cellesyklusanalyse og Annexin V-farging
etter eksponering til hypertermi, cellene ble re-inkubert ved 37 ° C i 0 timer, 24 timer eller 48 timer. Deretter ble cellesyklusfaser analysert. I korthet ble cellene fiksert med 70% etanol ved 4 ° C over natten. Etter vask med Ca
2 + Mg
2 + -fri Dulbeccos PBS, ble cellene behandlet med 0,1 mg /ml RNase (Type IA, Sigma, St. Louis, MO, USA) og deretter farget med 100 mikrogram /ml propidiumjodid (PI; Sigma), i mørket, ved romtemperatur i 20 min. Etter å ha passert gjennom en 40 nm mesh nylon, ble prøvene holdt på is inntil målinger. Dataene oppnådd ved hjelp av FACS kalibrator, ble anvendt for å analysere cellesyklus fase proporsjoner med ModFit programvare. En cellefraksjon av DNA, under den sub-G0 /G1 topp, angitt apoptotiske celler; DNA-histogrammer ble brukt for deres estimering.
For Annexin V-farging ble cellene farget med direkte PI og Annexin V-Flous (Roche) i 10 minutter og deretter vasket med inkubasjonsbuffer. Cellene ble identifisert med en FACS kalibrator etter innstilling av spenning med ubehandlede farget kontrollceller. Cellene ble analysert ved hjelp av Cell quest software og klassifiseres i fire ulike stadier: ufargede levende celler, tidlig alder apoptotiske celler farget bare med Annexin-V, middels alder apoptotiske celler dobbelt farget, og sen alder apoptotiske og nekrotiske celler farget med PI bare
Immunoutfelling
cellene (5 x 10
6 /skål) ble vasket med kald PBS, lysert på is i RIPA lysebuffer (50 mM Tris, pH 7, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksycholat og 0,1% NP-40) (NP-40; Nacalai Teque, Kyoto, Japan) eller CHAPS lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 1% CHAPS) [22] supplert med en protease inhibitor cocktail (Sigma) i 1 time, og deretter sentrifugert ved 15.000 rpm i 10 min. Supernatanten ble blandet med protein A-Sepharose (for pAb) eller protein G-Sepharose (for mAb) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), pre-svellet i PBS og forhåndsbelagt med det ønskede antistoff mot Bax, Ku70, acetylert lysin eller sirt-1 ved forsiktig risting i 1 time ved 4 ° C og sentrifugert i 1 minutt ved 3000 rpm. Etter vasking med lyseringsbuffer, ble immunkompleks fraksjonert ved SDS-PAGE (10-12% geler) og deretter gjennomgikk Western blot-analyse.
Western Blot analyse
etter SDS-PAGE, proteiner ble overført til en PVDF-membran (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranen ble blokkert ved 4 ° C over natten med blokkeringsbuffer. Membranen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med det ønskede Ab. Etter vasking tre ganger med TPBS ble membranene inkubert i 1 time med sekundær Ab, ved romtemperatur, etterfulgt av tre vaskinger med TPBS. Membranen ble utviklet ved hjelp av ECL-reagenser (Amersham). Den chemiluminescence ble visualisert med et polaroid-kamera (Amersham Pharmacia) og kvantifisert ved hjelp densitometry.
siRNA design og transfeksjon
siRNA oligomerer mot Ku70 mRNA (Ku70-siRNA) og en kontrollsekvens som ikke samsvarer med en hvilken som helst gensekvens (forts-siRNA) ble enten kjøpt som en validert en (Ambion, USA; Ku70-siRNA-2 og cont-siRNA-2, henholdsvis) eller utformet av undersøkerne og deretter syntetisert ved Ambion henhold til den følgende sekvens : Ku-siRNA, 5_UUCUCUUGGUAACUUUCCCdTdT_3 (Ku70-siRNA-1) og 3_dTdTAAGAGAACCAUUGAAAGGG_5; Cont-siRNA, 5_GCG CGC UUU GUA GGA UUC GdTdT_3 og 3_dTdTCGCGCG AAA CAU CCU AAG C_5 (forts-siRNA-1). Denne sekvensen målet ble validert [23]. siRNA oligomerer mot Bax mRNA (Bax-si) ble kjøpt fra Qiagene (Cat No. SI04948202). Den Bax-si, den Ku70-sirnas eller forts-sirnas ble transfektert inn i lungekreftceller (10
5 celler /60-mm rett) bruker SIPORT
Neofex plakater (Ambion, USA) til en endelig konsentrasjon på 200 nM, to ganger. En dag etter den siste transfeksjonen ble cellene trypsinert og sådd ut på 60 mm skåler (50.000 celler pr tallerken) i triplikat. Etter cellebinding, ble cellene eksponert for hypertermi ved de angitte tidsintervaller i henhold til den eksperimentelle design. Hver Forsøket ble gjentatt minst tre uavhengige ganger for reproduserbarhet og statistisk beregning.
Statistisk evaluering
statistiske analysene ble utført ved hjelp av Minitab Slipp (Ver.12). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. En enveis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å vurdere den statistiske signifikans mellom middel. Forskjeller mellom midler ble ansett signifikant ved p-verdier mindre enn 0,05.
Resultater
HDACIs betydelig styrket celledød med hypertermi
Som et faktum, sirt-en, et menneske deacetylase, ble spesielt rettet av små molekyler som kalles HDACIs, for eksempel NAM. Videre ble Ku70 deacetylering hemmet av inhibitor molekyler som er rettet mot klasse I /II HDAC; for eksempel TSA. Vi først forbehandlet PC-10 celler med forskjellige HDACIs, NAM (20 mm), TSA (300 nM) eller begge deler, for 4 timer rett før eksponering for hypertermi. Denne kombinerte behandling betydelig økt apoptose, mer enn to folder, sammenlignet med hypertermi behandling alene, som observert ved fasekontrastmikroskopi (fig. 1A) og Annexin V-farging (fig. 1B). Den Bax uttrykksmønster ble analysert i helcellelysater fra behandlede og ubehandlede PC-10-celler. Bax uttrykk (21 kDa) ble økt med hypertermi. Interessant, HDACIs (NAM og TSA) øket produksjon av 18 kDa Bax, som er kjent for å være en N-terminus avkortet form av Bax. Gitt at Bax aktivering indusert av enten den N-terminale ende eksponering av konformasjonsendring (reversibel forandring) eller N-terminal trunkering (irreversibel endring), Disse funnene tyder på at en bærekraftig forbedret apoptose med hypertermi og HDACIs er Bax avhengig, og dette apoptose kan avhenge på oppregulering av Bax eller frigjøring av Bax fra antiapoptotic protein (er) for å fremme apoptose (figur. 1C). Viktigere, behandling av lungecancerceller med HDACIs, bare ved valgte doser, hadde ingen merkbar toksisk effekt. ble observert tilsvarende virkninger av HDACIs på H1299-celler (fig. S1 og S2). Uventet, trippelkombinasjonen av NAM, TSA og hypertermi var mindre effektiv i H1299 enn dual kombinasjon. Selv om den eksakte molekylære mekanismen for dette fenomenet er fortsatt uklar, er en mulig årsak til at trippelkombinasjonen kan forbedre delingen av de overlevende celler rømt utfordringen med trippel behandling, noe som kan gi produksjon av nye datterceller innen 48 timer etter behandling ( før annexin V farging deteksjon) og forårsaker reduksjon av annexin V farving prosent endelig. For å kontrollere at Bax spiller stor rolle i hypertermi-indusert apoptose etter målgruppe Ku70 deacetylering ble Bax målrettet av spesifikke siRNA i PC-10 celler (se materialer og metoder). Bax var mottagelig for siRNA transfeksjon (Bax-si) sammenlignet med kontroll egge oligo siRNA (forts-si) som oppdaget av western blot analyse (figur 1D;. Øvre panel). Igjen, når Bax-slått ned PC-10-celler ble behandlet med hypertermi i 6 timer i nærvær av HDACIs ble hypertermi-indusert celledød inhiberte signifikant (figur 1D;. Nedre panel). I mellomtiden, celledød ble ikke fullstendig blokkert i henhold hypertermi behandling alene (figur 1D;. Nedre panel og S3 fig.). Dette resultatet kan tyde på involvering av andre pro-apoptotiske molekyler i den begrensede celledød indusert av hypertermi.
A
. Fasekontrast fotografier av PC-10-celler, to dager etter behandling med HDACIs da-hypertermi i 6 timer. Bildet viste begrenset antall gjenvundne celler, så vel som de avrundede og flytende apoptotiske celler i koloniene forbehandlet med HDACIs deretter hypertermi.
B
. Forbehandling av PC-10 celler med HDACIs betydelig økt hypertermi-indusert apoptose. Sammenlignende cytogrammene viser Annexin V-farging etter hypertermi i PC-10-celler forbehandlet med nictotinamide (20 mM), Trichostatin A (300 nM) eller begge deler (øvre panel). Oppsummering av gjennomsnittlig annexin V resultater er avsluttet (nedre panel).
C
. Bax ekspresjonsnivåer, ved Western-analyse, på PC-10-celler etter hypertermi (6 h) forbehandlet med forskjellige HDACIs. Lavere band (18 kd) indikerer avkortet, aktiv, Bax bare økt når celler behandlet med kombinasjon av HDACIs og hypertermi.
D
. En representant western blot viser endring av Bax for den spesifikke siRNA brukt. PC-10 celler ble enten transfektert med Bax-si eller cont-si to ganger. Actin immunoblot ble brukt som en startstyre (øvre panel). Betydelig reduksjon av annexin V flekker etter hypertermi og HDACIs i Bax KD celler sammenlignet med kontroll (er) som indikerer at Bax er nøkkelen proapoptotiske aktør i dobbel behandling-indusert apoptose (nedre panel). Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av tre forsøk; barer betegne SD; ** Indikerer forskjell fra kontroll transfektant på P 0,01
Effekt av hypertermi på uttrykk for apoptose relaterte proteiner i PC-10 celler
For å undersøke effekten av hypertermi på Bax og. sine store bindende molekyler, ble noen av apoptose relaterte proteiner (Bax, BCL-2, Ku70 og Ku80) studert av western blot analyse i et representativt cellelinje, PC-10. Fordi de fleste av renhold gener er lydhør overfor hypertermi, ble dermed Ponceau S farging brukes til å vise lasting kontroll. Hypertermi (42,5 ° C) i 1-9 timer induserte kvantitative endringer i Bax og BCL-2 uttrykk, uten observerbare endringer i BCL-XL, Ku70 og Ku80 (figur. 2A) Bax uttrykk var litt oppregulert mens BCL-2 ekspresjon ble nedregulert i PC-10-celler. Den Bax /BCL-2 prosenten økt gradvis etter hypertermi behandling (figur. 2B, øvre panel). Western blot analyse av Bax og BCL-2, med ulike belastnings mengder protein (20 mikrogram, 40 mikrogram og 60 mikrogram /kjørefelt), etter 0 timer og 6 timer hypertermi behandling bekreftet økt Bax /Bc-l2-forholdet (figur. 2B , nedre panel) som bekreftet denstimetrically (ved hjelp av Scion Bilde programvare). Lignende observasjoner ble også oppnådd i H1299-celler (fig. S4). Derfor hadde vi mye interesse for å svare på spørsmålet hvorfor kreftceller, med vill-type Bax, som ble oppregulert, ikke viser fremtredende apoptose etter hypertermi mindre DHACIs er lagt til. Merkbart, ved immunocytokjemi Bax og Bcl-2 viste hovedsakelig cytosoliske lokalisering i cellelinjene undersøkt (fig. S5). Derfor flyttet vi til å studere Bax dimerization.
En
.Whole celle ekstrakter ble forberedt på angitte perioder etter 42,5 ° C hypertermi og Bax, Ku70, Ku80 og BCL-2 ble analysert ved immunoblotting . Svak økning i Bax først etter seks og ni timer hypertermi og begrenset Bax aktivering etter 9 timer er observerbare. Hypertermi redusert BCL-2 mens BCL-xL og Ku70 ikke hadde vært tydelig påvirket. Anaysis ble utført på samme blott slik at hvert protein virket som en lastekontroll for den andre. En representant Ponceau S farging av membranen ble vist å verifisere normalisering fordi de fleste av de grunnleggende hus-holde gener (f.eks: aktin og tubulin) reagerer på hypertermi.
B
. Kvantitative analyser av Bcl-2 og Bax proteinekspresjon under hypertermi. Hvert bånd ble kvantifisert densitimetrically. Et representativt sett av Bax /BCL-2-forholdet er vist. Western-analyse med forskjellig lasting mengden av PC-10-celler lysater etter 6 timer hypertermi verifiserer endring i forholdet Bax /Bcl-2, mens Bcl-xL ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting fra samme blott.
Forstyrrelse av Bax heterodimerisering ved hypertermi
i trykksvake celler, heterodimerizes Bax med mange, anti-apoptotiske, partner molekyler; det homodimerizes under stress å indusere apoptose. For å studere effekten av hypertermi på Bax dimerisering, ble Bax immunopresipitert fra PC-10-celle-lysat etter 6 timers eksponering for hypertermi. Figure.3A, viser redusert Bax /BCL-2 heterodimer formasjon; den Bax /Bcl-xL heterodimer ble ikke påvirket av hypertermi, i henhold til resultatene av Western blot-analyse. Av notatet, var at mengden av Ku70 bundet til Bax økt med økt eksponering tid til hypertermi. Den Ku70 immunoprecipitation bekreftede forbedret Bax /Ku70 bindende etter 6 timer eksponering for hypertermi, mens Ku70 /Ku80 bindende viste ingen endring (figur. 3B). Lignende observasjon ble oppdaget da CHAPS buffer ble brukt til immunoutfellingsstudier eksperimenter (figur. S6)
En
. PC-10-celler ble inkubert ved 42,5 ° C i 0, 1, 3 og 6 timer. Bax ble co-immunopresipitert fra 2 mg totalprotein og BCL-XL, Bcl-2 og Ku70 ble påvist i immunoprecipitant av vestlige analyse. Hypertermi induserer Bax oppregulering og Bax dissosiasjon fra BCL2 og forsterker tilknytningen mellom Bax og Ku70, mens ingen effekt på Bax /BCL-xL forening. I motsetning til dette, Ku70 ble ko-immunopresipitert fra lignende cellelysater. Bax og Ku80 vises i immunoprecipitant.
B
. Etter hypertermi, totalt Ku70 nivåer viste ingen endringer, men sammenhengen mellom Ku70 og Bax ble forbedret.
Hypertermi redusert Ku70 acetylering i PC-10 celler
acetylering av enten K539 eller K542 ved Ku70 C-terminal linker er tilstrekkelig til fullstendig å blokkere Ku70 undertrykkelse av Bax-mediert apoptose [14]. Effektene av hypertermi på Ku70 acetylering status ble derfor undersøkt ved sondering blot av Ku70 immunoprecipitant med antiacetylated lysin Ab (figur 4A.); Resultatene viser en signifikant reduksjon i Ku70 acetylering etter 6 timers eksponering for hypertermi i PC-10-celler. I tillegg er mengden av Ku70 detektert, i det acetylerte proteiner immunoprecipitant, redusert i en tidsavhengig måte (fig. 4B).
A
. Ku70 ble immunopresipitert fra like proteinmengder (3 mg) PC-10 celle Lysatet etter hypertermi ved angitt tid. Ku70 og acetyl Lysin ble påvist i immunoprecipitant. Total Ku70 viste ingen endring etter 6 t hypertermi (i put), men acetylert Ku70 ble redusert.
B
. Alle acetylerte proteiner ble immunopresipitert, fraksjonert, blottet og Ku70 ble påvist i blot. Bands indikert acetylert Ku70 ble svakere med økende hypertermi tid.
C
. Hypertermi forbedret både Ku70 uttrykk og Ku70 /sirt-en bindende. Sirt-en ble immunopresipitert fra PC-10 etter hypertermi (0-6 timer). Blot indikerer sirt-1 oppregulering (i put, nedre panel) og forbedret binding til Ku70, i samme blot, ble oppregulert (øvre panel).
D
. Ligner hypertermi behandling i H1299. Total Ku70 ble felt. Ku70 og sirt-1 ble påvist i immunoprecipitant ved Western-analyse. Sirt-1 /Ku70 binding ble økt, noe som indikerer en forbedret Ku70 deacetylering i lungekreftceller ved hypertermi.
sirt-en formidler Ku70 avhengig cytobeskyttelse fra hypertermi
Det er vel kjent som Ku70 acetylering er spesielt reversert ved sirt-1, en human deacetylase, under svak spenning (for eksempel, kaloribegrensning); Under slike betingelser sequesters Ku70 mer Bax og beskytter cellene mot Bax-mediert apoptose [19]. For å undersøke om acetylering hemming, med eksponering for hypertermi, skyldes aktivering av sirt-en, analyserte vi sirt-1 uttrykk etter eksponering for hypertermi (0-6 timer). Western blot analyse viste at sirt-1-ekspresjonen ble indusert ved hypertermi i PC-10-celler (fig. 4C). Videre sirt-1 ble immunopresipitert fra PC-10 hele cellelysater og deretter underkastet Western blotting-analyse. Mengden av Ku70 immunopresipitert med sirt-1 ble forbedret ved eksponering for hypertermi (fig. 4C). På tilsvarende måte er mengden av sirt-1 immunopresipitert med Ku70 ble også forbedret ved eksponering for hypertermi (0-6 h) om at Ku70 /sirt-1-binding ble forbedret ved hypertermi i PC-10-celler (Figure.4D). Vi spekulert i at oppregulert sirt-en, under forhold med hypertermi, binder seg til Ku70 og endrer det fra acetylert til deacetylert form, noe som gir Ku70 å beslaglegge mer Bax, enten frigjort fra BCL2 eller nylig induseres under hypertermi, for å hemme hypertermi-indusert apoptose endelig. Disse resultatene forklare, i det minste delvis, hvorfor HDACIs, såsom NAM, kan øke apoptose av hypertermi, sannsynligvis ved å målrette noen HDACs som sirt-1. Spesielt, gjorde andre histone deacetylases inkludert HDAC6 og sirt-3, ikke viser vesentlige endringer i uttrykket profilen etter eksponering for hypertermi (figur. S7). For å bekrefte resultatene ovenfor, H1299-celler (med forholdsvis høy transfeksjonseffektivitet, 50% som bestemt ved beta gal transfeksjon) ble transient transfektert med enten villtype sirt-1 eller dominant negativ H363Y /sirt-1. Hypertermi-indusert apoptose ble betydelig forbedret i H363Y /sirt-en-transfekterte celler sammenlignet med kontroll vektor transfektanter (Figur 5A,. P 0,01). Viktigere, villtype sirt-1-transfekterte celler viste svak, men signifikant (P 0,05) beskyttelse fra hypertermi i de undersøkte celler, noe som indikerer at anti-apoptotiske virkning av det eksogene sirt-1 er signifikant, men begrenset. Dette var sannsynligvis fordi det endogene sirt-1 hadde utløst det meste av spontan beskyttelse mot hyerthermia som antydet ved DNA-innhold eksperimenter (fig. 5A). Lignende resultater ble oppnådd fra Annexin V flekker; H363Y /sirt-1 transfeksjon inn i H1299-celler i betydelig grad forbedret apoptose etter eksponering for hypertermi sammenlignet med den tomme vektoren transfektant (fig. 5B). Spesielt, verken villtype sirt-en eller dominant negativ H363Y /sirt-en transfeksjon viste individuelt vesentlige endringer i cellesyklusen.
A
. Sirt-en er involvert i cytobeskyttelse fra hypertermi. Western blot viser den overuttrykt sirt-1. FACS analyse av H1299 celler etter transient transfeksjon enten med bredt typen sirt-en, dominant negative sirt-en eller FLAG ekspresjonsvektor. H363Y /sirt-en betydelig forbedret hypertermi-indusert celledød, mens bredt typen sirt-en hadde ingen signifikant effekt (øvre panel).
B
. Resultater av annexin V farging av H1299 celler, fra lignende eksperiment, som bekrefter at H363Y /sirt-1-indusert celledød er apoptose (nedre panel).
Målretting Ku70 av siRNA forbedret hypertermi-indusert celledød
for å undersøke om Ku70 var en viktig formidler i den nevnte beskyttelse av celler fra hypertermi, Ku70 mRNA ble rettet av sekvensspesifikk Ku70-siRNA-1, -2. Ku70 mRNA var mottagelig for Ku7-siRNA-1 (custom design) og deretter, nivået av protein-ekspresjon ble betydelig redusert (dose; 200 nM) i PC-10-celler (figur 6A.). Kontrollen siRNA (forts-siRNA-1) transfeksjon påvirket ikke Ku70 uttrykk. I tillegg Ku70-siRNA-2 transfeksjon (se materialer og metoder) ble bekreftet å effektivt knockdown Ku70 (figur. 6A, nedre panel). Deretter ble både den Ku70 knockdown (KD) og kontrollcellene utfordret med eksponering for hypertermi. De Ku70 KD PC-10-celler viste forbedret celledød etter hypertermi eksponering på en tidsavhengig måte (fig. 6B, C) i forhold til forts-siRNA transfektant, to dager etter behandling, som indikert ved FACS-analyse (ved hjelp av Ku70- siRNA-1). Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av H1299-celler (ved hjelp av Ku70-siRNA-2 og S8) forts-siRNA-2 (fig.). Disse resultatene tyder på at Ku70 formidler cytobeskyttelse fra hypertermi eksponering og spiller trolig en nøkkelrolle i hypertermi-indusert apoptose.
A
. En representant western blot viser endring av Ku70 for begge siRNAs brukes. PC-10-celler og H1299-celler ble transfektert med en siRNA to ganger. Den vestlige Resultatet viser betydelig banke ned av Ku70-siRNA-1, -2 sammenligne med cont-siRNA-1, -2, henholdsvis. Actin immunoblot ble anvendt som en kontroll lasting. Forsøket ble gjentatt tre uavhengige ganger for reproduserbarhet. PC-10-celler ble transfektert med Ku70-siRNA-1 eller cont-siRNA-en (200 nM) to ganger. 24 timer etter siste transfeksjon, ble like antall celler dyrket i ytterligere 24 timer, og deretter behandlet med hypertermi for angitte tidsintervaller, og deretter re-dyrket ved 37 ° C i 24 timer (B) eller 48 timer (C) Celler ble anskaffet ved FACS analysator for cellesyklus analyse. Resultatene som er vist er en representant for en fra i det minste tre uavhengige eksperimenter for hvert tidspunkt (24 timer og 48 t).
D
. Ku70 er nødvendig for cytostatisk arrest ved hypertermi. Histogrammene viser den differensielle akkumulering av cellepopulasjoner i G2 /M-fasene i celler med eller uten Ku70, en og to dager etter 0, 1, 3 og 6 timer hypertermi behandling. Populasjoner i ulike cellesyklusfaser, G1, S og G2 /M faser, ble beregnet ved hjelp av datamaskinen etter hypertermi behandling. Resultatene som vises er gjennomsnittet fra tre uavhengige forsøk.
E
. Betydelig forbedring av annexin V flekker etter hypertermi i Ku70 KD celler sammenlignet med kontroll som indikerer at Ku70 lyddemping baserte celledød ved hypertermi er apoptose. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av tre forsøk; barer betegne SD; * Viser forskjell fra kontroll transfektant på P . 0.001
Ku70 mediert hypertermi-indusert G2 /M opphopning
Puls-merking eksperimenter med bromdeoksyuridin (BrdUrd; 20 mm) i PC- 10 celler indikerte at eksponering for hypertermi indusert cytostatisk men ikke cytotoksisk arrest (data ikke vist). Den hypertermi-indusert cellesyklus forstyrrelse ble analysert 24 timer og 48 timer etter 1-6 timer eksponeringer til hypertermi. G2 /M-subpopulasjoner ble signifikant økt i 24 timer etter eksponering for hypertermi og deretter gradvis redusert til normale subpopulasjoner 48 timer etter eksponering for hypertermi (fig. 6D). Samtidig den prosent av G1 og S-fasen subpopulasjoner gradvis redusert 24 timer etter eksponering for hypertermi og gjenvunnet 48 timer etter fjerning hypertermi.
B
.
