Abstract
Bakgrunn
Deregulering av kanoniske Wnt /CTNNB1 (beta-catenin ) veien er en av de tidligste hendelsene i patogenesen av tykktarmskreft. Mutasjoner i
APC
eller
CTNNB1
er svært hyppig i tykktarmskreft og forårsake avvikende stabilisering av CTNNB1, som aktiverer transkripsjon av Wnt målgener ved å binde seg til kromatin via TCF /LEF transkripsjonsfaktorer. Her rapporterer vi en integrerende analyse av genom-wide kromatin belegg på CTNNB1 av kromatin immunoprecipitation kombinert med high-throughput sekvensering (Chip-seq) og genuttrykk ved mikromatriser analyse på RNAi-mediert knockdown av CTNNB1 i tykktarm kreft celler.
Resultater
Vi observerte 3629 CTNNB1 bindende topper over genomet og en signifikant korrelasjon mellom CTNNB1 bindende og knockdown-indusert genekspresjon endring. Vår integrerende analyse førte til oppdagelsen av en direkte Wnt mål signatur bestående av 162 gener. Gene ontologi analyse av denne signaturen avdekket en betydelig berikelse av Wnt pathway gener, noe som tyder på flere tilbakemeldinger reguleringer av veien. Vi gir bevis på at dette genet signatur delvis overlapper med den Lgr5
+ intestinal stamcelle signatur, og er betydelig anriket med normale tarm stamceller så vel som i kliniske prøver kolorektal kreft. Interessant, mens uttrykk for CTNNB1 målet genet sett ikke korrelerer med overlevelse, forhøyet uttrykk for negative tilbakemeldinger regulatorer i signaturen spår bedre prognose.
Konklusjon
Våre data gir et genom-wide visning av kromatin belegg og genregulering av Wnt /CTNNB1 signalering i tykktarm kreft celler
Citation. Watanabe K, Biesinger J, Salmans ML, Roberts BS, Arthur WT, Cleary M, et al. (2014) Integrative ChIP-seq /microarray analyse Identifiserer en CTNNB1 Target signatur Beriket i Tarm stamceller og tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (3): e92317. doi: 10,1371 /journal.pone.0092317
Redaktør: Ted S. Acott, Casey Eye Institute, USA
mottatt: Oktober 30, 2013, Godkjent: 20 februar 2014; Publisert: 20 mars 2014
Copyright: © 2014 Watanabe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finansiering fra Susan G. Komen gi KG110897 (XD), en US Department of Defense BCRP postdoktorstipend (KW W81XWH-10-1-0383), og National Institutes of Health innvilge R01HG006870 (til XX). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Brian S. Roberts og William T. Arthur er tidligere ansatte i Rosetta Inpharmatics, LLC , Merck Co., Inc. Det er ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Bakgrunn
Wnt /CTNNB1 signalering er en fredet gangsti som spiller grunnleggende roller i embryoutvikling, vev homeostase og vedlikehold av stamceller. I normal tarmen, er denne veien essensielt for utvikling og opprettholdelse av tarm stamceller [1], [2]. Aktivering av kanonisk Wnt signalering omfatter stabilisering av cytoplasmatisk CTNNB1, som ellers nedbrytes av proteasomet gjennom en degradering kompleks som består av tumor suppressor protein APC, serin /treonin kinase GSK-3, og Axin. Stabilisert CTNNB1 translocates inn i cellekjernen hvor det bindes til TCF /LEF transkripsjonsfaktorer og aktiverer målgenet uttrykk [2]. En viktig initiering ved kolorektal kreft (CRC) er CTNNB1 stabilisering gjennom tap av
APC
gen eller aktiverende mutasjoner i
CTNNB1
genet [3]. Denne genetiske hendelsen oppstår først og fremst i tarmstamcelle befolkningen [4] – [6] og fører til unormal spredning av muterte cellene gjennom aktivering av målgener som
MYC Hotell og
CCND1 product: [7 ]. Men gitt den avvikende cellulære roller Wnt /CTNNB1 signalering, andre mål gener kan også bidra til patogenesen av CRC.
Dermed identifisering og karakterisering av CTNNB1 målgener genome-wide har vært en viktig jaktstarten i CRC studier. Transkripsjonell profilering ble brukt til å identifisere Wnt /CTNNB1 målgener i tykktarm kreft celler [8]. Imidlertid er analyse av genekspresjon alene begrenset på grunn av manglende evne til å skille mellom primære og sekundære virkninger av Wnt pathway aktivering. Mer nylig, kromatin immunoutfelling (chip), etterfulgt av stor-skala DNA-analyse, slik som DNA-brikke (chip-chip) eller high-throughput sekvensering (chip seq) [9], [10] ble brukt til å identifisere genomiske loci til som CTNNB1 eller TCF-faktorer direkte binde [11] – [14]. Men chip-baserte studier av ulike transkripsjonsfaktorer tyder på at ikke alle bindende hendelser identifisert korrelerer med transkripsjonen regulering på et funksjonelt nivå [15]. Derfor er det viktig å utføre en integrerende analyse som omfatter både genom-wide kromatin belegg kartlegging og genekspresjon profilering i den samme type av tykktarmskreftceller for å identifisere direkte og funksjonelle Wnt /CTNNB1 målgener, som ennå ikke er blitt gjort i litteraturen.
i denne studien, kombinerer vi ChIP-seq med microarray analyse bruker SW480 human tykktarmskreft cellelinje, hvor deregulert Wnt signal aktivitet er godt dokumentert. Vi rapporterer en signifikant korrelasjon mellom CTNNB1 bindende og uttrykk regulering, og identifiseringen av en kjerne sett av 162 gener som «Wnt direkte målgener» som er bundet og aktiveres av CTNNB1. Wnt målet genet signaturen ble beriket i normale tarm stamceller og CRC, men ikke klarte å forutsi prognose for CRC pasienter. Vår studie gir en viktig ressurs for å forstå biologien til Wnt signal.
Resultater
ChIP-seq analyse av CTNNB1 kromatin belegg i SW480 celler
SW480 celler inneholder en inaktive mutasjon i
APC
genet som resulterer i et høyt nivå av konstitutivt stabilisert CTNNB1 protein i kjernene [16], [17]. For å fange antagelig dynamisk samspill av CTNNB1 med kromatin [18], [19], vi optimalisert en chip protokollen ved hjelp av amin bestemt protein-protein kryssbindere før formaldehyd kryssbinding kombinert med atom utvinning [20] (Se Methods) . Spesifikk binding av CTNNB1 ble først godkjent av Chip-PCR for kjente mål inkludert
MYC Hotell og
LEF1 plakater (figur 1A). DNA fra flere chip eksperimenter med anti-CTNNB1 antistoff eller isotypekontrollantistoff IgG kontroll ble slått sammen for Solexa /Illumina sekvensering, som ga ca 26 millioner individuelle 36-nukleotidsekvens leser i hvert løp. Bare leser entydig tilordnet på det humane genomet (15,776,628 for kontroll IgG og 17.112.552 for anti-CTNNB1) ble anvendt for den påfølgende analysen (tabell 1). Modellbasert analyse chip-Seq (MACS) [21] identifisert 3629 CTNNB1 bindende peak regioner (
p
verdi ≤ 1E-5, FDR ≤ 5%) over hele genomet (tabell 1). Omtrent 60% av toppene befinner seg i en umiddelbar nærhet av gen-kodende regioner, inkludert promoter (2-kb 5′-flankerende region, 21,5%), 5′-UTR (6,9%), ekson (5,5%), intron (21.6 %), 3′-UTR (3,2%) og nedstrøms (2-kb 3′-flankerende region, 0,5%) regioner (figur 1B). Anrikning av CTNNB1 binding ved promotorene (21,5%) var statistisk signifikant (
p
0,001) sammenlignet med fordelingen av tilfeldig genererte toppene av samme størrelser (3,5 ± 0,2%). I samsvar med en tidligere rapport [12], peak distribusjon korrelerte signifikant med nærhet av transkripsjonsstartsider (TSS) (figur 1C). Siden en CTNNB1 /TCF-bundet Enhancer kan fungere eksternt fra TSS [18], vi har søkt for TSSs som ligger innenfor 20 kb fra de observerte toppene, og identifisert 2794 gener som ble brukt i den påfølgende analyse for å identifisere de direkte målgener .
A.
ChIP optimalisering. ChIP-PCR ble utført for kjente CTNNB1 bindende elementer i MYC og LEF1 genet regulatoriske regioner. * Anti-PYGO2 antistoff ble anvendt som en positiv kontroll, som PYGO2 protein forbinder med CTNNB1-TCF /LEF proteinkompleks [51].
B.
Fordeling av CTNNB1-bindende regioner på genomet i forhold til RefSeq menneskelige gener. En «promoter» er definert som den to-kb region oppstrøms for TSS, mens en «nedstrøms» region er definert som to-kb region nedstrøms for transkripsjonstermineringssete. Intergeniske region refererer til alle andre enn «promoter «, 5′-UTR,» ekson «,» intron «,» 3′-UTR», eller «nedstrøms» steder.
C.
Avstand fra midten av hver CTNNB1 binding topp til TSS på nærmeste genet. Den røde linjen representerer et tilfeldig fordelt mønster generert ved å ta 1000 tilfeldige permutasjoner av toppene.
D MEME program.
Identifiserer en konsensus TCF /LSF-bindende motiv innen chip-seq topper.
Ved hjelp av Multiple EM for Motif elicitation (MEME), en de novo motiv oppdagelsen program [22], analyserte vi den unike CTNNB1 toppene for tilstedeværelse av eventuell enighet motiv. En utvidet TCF /LSF konsensus sekvens [12], [13] dukket som toppen rangert motiv (E verdi = 7.9e-1135) (figur 1D). Flere andre kandidat sekvenser ble også identifisert; Men de syntes å representere repeterende sekvenser, som er vanlige gjenstander av denne analysen (data ikke vist). Disse data bekrefter at CTNNB1 binder seg til kromatin primært gjennom TCF /LEF DNA-bindende proteiner [11]. Dette sa vi ikke kan utelukke potensielle bindende motiver som ikke har blitt oppdaget av MEME, samt eksistensen av andre tilknyttede motiver som ligger utenfor chip peak regioner [12], [14]. Faktisk, en k-mer søk [23] viste at AP-en konsensus sekvens (TGAYTCA) er betydelig beriket sammenlignet med tilsvarende størrelse tilfeldige genomiske fragmenter (
p
= 1.78e-50), i samsvar med tidligere arbeid rapportering anriking av AP-1 motivene CTNNB1-bindende elementer [12].
Bruke UCSC Genome nettleser (NCBI36 /hg18) [24], visualisert vi CTNNB1 binding til kjente Wnt /CTNNB1 målgener.
Axin2
er et klassisk mål og inneholder flere TCF /LSF bindende regioner i sin promoter og første intron [25]. Vår ChIP-seq analyse faktisk identifisert flere topper i
AXIN2
, med sine posisjoner tilsvarende godt med de rapporterte bindingssteder (figur 2A). Vi har også oppdaget topper på de rapporterte regioner av andre kjente målgener inkludert
MYC product: [12] og
LEF1 product: [26] (figur 2B og C).
Synlig er resultater for CTNNB1 og IgG-distribusjoner på Ref-seq gens. Røde boksene viser posisjonene til enighet TCF /LSF-bindende motiver. H3K4me1 og H3K4me3 domener fra flere Encyclopedia of DNA Elements (KODE) cellelinjer er vist som referanser for forsterker /promoter og promoter regioner, henholdsvis.
kombinatoriske analyse av kromatin bindende og genuttrykk data identifiserer en direkte CTNNB1 målet genet signatur som inneholder tilbakemelding regulatorer av Wnt signalveien
for å identifisere direkte og funksjonelt relevante CTNNB1 målgener, analyserte vi chip-seq datasett mot transkripsjons profilering data for kontroll og CTNNB1-utarmet SW480 celler [27] . Som tidligere beskrevet [27], knockdown av CTNNB1 ble oppnådd ved hjelp av to forskjellige CTNNB1 spesifikke sirnas, som når den ble testet i en funksjonell analyse ved hjelp av en Beta-catenin-Aktivert Reporter (BAR) [28] var i stand til å undertrykke BAR aktivitet ved ~99 % og ~97%, respektivt. Vi utførte Gene satt berikelse analyse (GSEA) ved hjelp av den modifiserte Kolmogorov-Smirnov (KS) test [29] for å evaluere CTNNB1-bundet gener for deres fordeling i microarray datasettet, hvor genene ble rang bestilt for deres differensial uttrykk mellom kontroll og CTNNB1-utarmet celler. KS test avslørte en meget signifikant korrelasjon (
p
= 0) mellom CTNNB1 bindende og genuttrykk endringer etter CTNNB1 knockdown, og dette var sant med begge sirnas (figur 3A og data ikke vist). Et flertall av CTNNB1-bundne gener ble positivt korrelert, mens et lite antall gener er negativt korrelert med CTNNB1 uttrykket (figur 3B). Dette er konsistent med CTNNB1 hovedsakelig opptrer som en transkripsjonen aktivator, men også er i stand til å undertrykke ekspresjon av visse gener [30].
A-B
. KS plott som viser sammenheng mellom CTNNB1 bindende og uttrykk regulering. De 2794 CTNNB1 bundne gener ble sammenlignet for deres sammenheng med uttrykk endringer ved siRNA knockdown av CTNNB1. Gener i microarray ble rangert etter
p
verdi (
En
,
p
= 4.4e-16) eller fold økning (
B
,
p
= 0) i hver GSEA
Ved hjelp av en kombinatoriske kriterier, dvs. nedregulering i microarray analyse med
p
. 0,01 og logge ratio -0,2 etter behandling av både siRNAs og vise CTNNB1 bindende toppene innenfor ± 20 kb fra TSS, identifiserte vi 162 gener som direkte og funksjonelle wnt mål (Tabell S1). Inkludert i dette målet signatur er kjent mål som
AXIN2, CDX2, ID2, LEF1, LGR6, MSX1, NKD1, NKD2, SP5, TDGF1, etter og
TNFRSF19
, indikerer gyldighet signatur. Vi har også samplet 10 gener fra listen, og brukes ChIP-PCR for å bekrefte CTNNB1 bindende på de forventede områdene (Figur 4A). Ved hjelp av en shRNA mot CTNNB1 som er forskjellig fra de to siRNAs brukes i microarray analyse, validert vi at knockdown av CTNNB1 resulterte i en betydelig nedregulering av de fleste av de testede genene inkludert
FASLG, IL10, LMO2, MPZL2, NOTUM , PPP1R2, Hotell og
TREM2 plakater (figur 4B).
A
. Spon PCR-analyse av de angitte genene ved hjelp av en uavhengig fremstilt kromatin prøven.
LEF1 Hotell og
GAPDH
fungere som positive og negative kontroller, henholdsvis.
B
. Kvantitativ RT-PCR av de angitte gener. Gjennomsnitt ± standardavviket av 4 uavhengige eksperimenter er vist.
p
verdiene beregnes med to-tailed standard
t-
test. NS: ikke signifikant, *:
p
0,05, og **:
p
0,01
Gene ontologi (GO) sikt berikelse av. database for kommentering, visualisering, og integrert Discovery (DAVID) [31] i 162-target-signatur foreslo viktige utviklingsfunksjonene i Wnt veien, inkludert embryonale vedheng morphogenesis, hjerte, eller muskel utvikling (tabell S2). GÅ analyse også avslørt gener som er involvert i flere signalveier, som kan tyde på mulige kryss samtaler mellom Wnt signal og disse banene. Spesielt betydelig oppdaget pathway GO vilkårene inkluderer cytokin signalering (
Fasl, BMP7, CXCL4, CXCL6, CXCL14, EDAR, IL10RA, IL10, TNFRSF1B, TNFRSF11B, TNFRSF19
), veier i kreft (
Fasl, GLI3 , AXIN2, FGF3, FGF9, FGF19, LEF1, WNT6, WNT11
), eller Hedgehog signalveien (
GLI3, BMP7, WNT6, WNT11
) (tabell 2).
GÅ analyse også identifisert gener som koder wnt signalkomponenter som CTNNB1 mål og vi generert en utvidet liste over potensielle tilbakemeldinger regulatorer (Tabell 3).
AXIN2, LEF1, NKD1 Hotell og
NKD2
har blitt beskrevet som negative eller positive tilbakemeldinger regulatorer av veien [25], [32], [33].
WNT6 Hotell og
WNT11
kode Wnt ligander som har potensielle kreftfremmende roller selv i CRC med
APC
mutasjoner [34] og som har evnen til å signalisere til stromal komponenter for å modulere tumormikromiljøet [35]. Andre potensielle tilbakemelding regulatorer har
APCDD1
,
NOTUM, PPP1R2
, og
ZNRF3
.
APCDD1
er rapportert å ha en negativ regulere reaksjonsveien ved ligand-reseptor-interaksjon trinn og dens mutasjon er ansvarlig for en autosomal dominant hårtap sykdom, arvelig hypotrichosis simplex [36].
NOTUM
koder for et utskilt α /β-hydrolase, som er kjent for å antagonisere Wnts ved å slippe glypicans fra celleoverflaten [37].
PPP1R2
genprodukt hemmer proteinfosfatasen en kompleks, som regulerer phospholyration status av GSK3p [38] og følgelig CTNNB1 degradering [39].
ZNRF3
koder en E3 ubiquitin ligase som spesifikt fremmer ubiquitinering og nedbrytning av frizzled reseptorer [40], [41]. Som vist ovenfor, har vi bekreftet
NOTUM Hotell og
PPP1R2
å være bona fide mål for CTNNB1. Samlet utgjør disse data tyder på at Wnt signal er underlagt komplekse tilbakemeldinger forskrifter.
Den CTNNB1 målet signatur er beriket i tarm stamceller og CRC, men ikke korrelerer med overlevelsen av CRC pasienter
Lgr5
+ tarmcellene aktivt sykling stamceller og Wnt /CTNNB1 signalveien spiller en avgjørende rolle i deres selvfornyelse [2]. Vi sammenlignet derfor CTNNB1 målet signatur identifisert i denne studien med en nylig rapportert gen signatur (et sett av 510 gener identifisert fra microarray-baserte transkripsjonen profilering og massespektrometrisk protein profilering) som er beriket i Lgr5
+ tarm stamceller [42 ]. En statistisk signifikant overlapp (
p
8.9e-07, representasjon faktor 4,1; sammenligne med tilfeldigheter) ble funnet: 17 gener (~ 10%) i CTNNB1 målet genet signatur var også en del av den Lgr5
+ intestinal stamcelle signatur (figur 5A, tabell 4). GSEA på en microarray datasett fra en EphB2-beriket tarmstamcelle befolkning av menneskelige kolon epitelceller (GSE31257) [43] avslørte også berikelse av vår 162-target-signatur i disse cellene [Normalisert Enrichment Score (NES) = 1,81, FDR
q
verdi = 0,0; Figur 5B]. Disse data tyder på at de direkte CTNNB1 målgener i SW480 celler er også aktivert i normale tarm stamceller.
A
. Overlapping mellom CTNNB1 målet genet sett og Lgr5
+ intestinal stamcelle gen sett.
p
verdi og representasjon faktor høydepunkt statistisk signifikans i forhold til tilfeldigheter. Beregning var basert på en forutsetning om at det totale antallet gener er 20000.
B-C
. GSEA for de 162 genene som bruker komparative data mellom EphB2
høy menneskelig tarmstamcelle og EphB2
nonstem celle populasjoner lave (
B
), eller mellom tykktarmskreft og prøver normalt vev (
C
).
for å undersøke relevansen av 162-target-signatur i kliniske prøver, utførte vi GSEA på genuttrykk data fra menneskelige tykktarmskreftprøver (GSE41328) [44] . Denne analysen viste en slående berikelse av CTNNB1 målet signatur i tykktarm kreft prøvene i forhold til vanlig kolon vev (NES = 2.01, FDR
q
verdi = 0,0, figur 5C). Vi brukte også en offentlig tilgjengelig genuttrykk datasett for å teste om 162-target-signatur kan forutsi utfallet av tykktarmskreftpasienter [45]. Til tross for anrikning av signaturen i tykktarm kreft prøver, gjorde vi ikke observere noen signifikant sammenheng mellom den generelle uttrykk for signaturen og sykdomsfrie etter kirurgi overlevelse for tykktarmskreftpasienter (Figur 6A). Dette er sagt, uttrykk for flere av de negative tilbakemeldinger regulatorer som vi identifiserte i dette arbeidet korrelert med en bedre sykdomsfri overlevelse. For eksempel pasienter med høy gjennomsnitts uttrykk for
AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2
, og
NOTUM
viste betydelig lengre sykdomsfri overlevelse sammenlignet med lav expresser gruppen (Figur 6B). Sammen våre resultater viser en berikelse for direkte CTNNB1 målgener i tarm stamceller og kliniske CRC prøver. Men det er en signifikant sammenheng med prognose for CRC pasienter begrenset til en utvalgt undergruppe av CTNNB1 målgener, nemlig de negative tilbakemeldinger faktorer, snarere enn hele målet signatur.
Totalt 232 pasienter ble kategorisert i høy ( rød) eller lave expressers (blå) basert på uttrykket av de 162 genene (
A
) eller fem negative tilbakemeldinger gener (
AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2, NOTUM) plakater (
B
).
p
verdier ble beregnet ved log rank analyse.
Diskusjoner
Vårt objektiv genom-skala screening for CTNNB1 målgener kombinerer chip seq og microarray analyser gir en viktig ressurs for tykktarmskreft forskning. Til tross for signifikant korrelasjon mellom kromatin bindende og genekspresjon regulering, avdekker vårt arbeid et lite antall (162) av gener som direkte, funksjonelle CTNNB1 mål i SW480 tykktarmskreftceller. Dette tallet er vesentlig mindre enn den for CTNNB1-bundet loci eller av CTNNB1-responsive gener, noe som tyder på at ikke alle bundet loci er funksjonelt benyttes i SW480 celler for transkripsjonsregulering, og at mye av endringer i genekspresjonen som indirekte følger av CTNNB1 uttømming. Vi kan ha gått glipp av noen beskjedent regulert målene ved å kreve at genuttrykk endringen skal skje ved behandling med to forskjellige sirnas og ved hjelp av strenge grenseverdier. Noen av de CTNNB1-bundet loci kan reguleres i en kontekstavhengig måte; for eksempel kan gener som har flere lag med regulering, slik som de som er stilnet av DNA-metylering eller hovedsakelig kontrollert av andre transkripsjonelle /translasjonelle regulatorer i SW480 celler som ikke viser en betydelig reduksjon i transkripsjon ved CTNNB1 uttømming. Det er fortsatt mulig at slike loci er regulert av CTNNB1 i andre cellulære sammenhenger.
Våre validerings eksperimenter tyder på en 80% suksessrate i identifisering av bona fide CTNNB1 mål ved hjelp av genomisk tilnærming. En forskjell i knockdown effektivitet blant si /shRNAs eller off-target effekter av si /shRNAs kan forklare de «falske positive». Den CTNNB1 målet underskrift av 162 gener viser noen interessante funksjoner. Mest slående er tilstedeværelsen av tilbakekoblings regulatorer av reaksjonsvei. Tilbakemelding regulering av Wnt /CTNNB1 veien har blitt godt etablert basert på studier av enkeltgener [25]. Ved hjelp av serieanalyse av kromatin belegg (SACO), har CTNNB1 belegg av komponenter på den kanoniske Wnt signalveien blitt oppdaget [11]. Våre funn som Wnt sti komponenter er overrepresentert i CTNNB1 målet signatur legger ytterligere bevis for å støtte denne viktige modusen av regulering. Av notatet, vår studie og SACO studie [11] avdekke stor grad forskjellige Wnt pathway gener som CTNNB1 mål: ut av de 15 gener som ble identifisert i SACO studien, bare to gener (
AXIN2 Hotell og
WNT11
) ble funnet i vår liste over 10 Wnt pathway gener (tabell 2). Videre, sammenlignet med en annen CTTNB1 chip seq studie som brukes HCT116-celler [12], ble en overlapping av 161 CTNNB1-bundne gener som finnes mellom 988 gener som er identifisert i denne studien og 2794 genene som er identifisert i denne studien. Selv om overlappingen er statistisk signifikant (
p
4.8e-07), et betydelig antall målgener var spesifikk for hver studie. Dette kan være delvis på grunn av en forskjell i parameter innstilling eller potensielle støy i analysen, men kan også gjenspeile en reell forskjell i CTNNB1 funksjon mellom CRC cellelinjer (HCT116 vs. SW480) som brukes i de to studiene. Faktisk, en lymfeknute metastatisk variant av SW480, har blitt rapportert en forskjell i DNA metylering mønstre av Wnt målgener mellom HCT116 og SW620 [46]. Som sådan, vårt arbeid avslører nye fasetter av tilbakemeldinger regulering av Wnt /CTNNB1 signalering. Finjustering av Wnt signale produksjonen av flere tilbakekoblingsmekanismer kan være viktig for nøyaktig tid og rom regulering av sin aktivitet i vevet mønster og vedlikehold av vev homeostase. I tillegg kan feilfunksjon av disse mekanismene bidrar til patologiske tilstander slik som kreft [47].
Selv for et forholdsvis lite antall gener i 162-target-signatur, de tilhørende funksjonsbetingelser vises udefinert og mangfoldig. Dette er konsistent med de divergerende biologiske effektene av Wnt /CTNNB1 signale [2]. Signaturen omfatter en rekke transkripsjonelle regulatorer (tabell S1), impliserer at det finnes sekundær /indirekte transkripsjonelle mål. Identifiseringen av direkte CTNNB1 /TCF mål ved andre [11] – [14] og dette arbeidet gir en ramme å dissekere de relative bidrag av direkte og indirekte målgener til de biologiske effektene av veien
Det er det. allment anerkjent at dereguleringen av Wnt /CTNNB1 veien er en viktig start trinn i tarm tumorigenesis [48]. Dette deregulering er tenkt å skje i tarm stilk cellepopulasjon som brensel tumorvekst [5], [6]. I samsvar med denne oppfatningen, fant vi CTNNB1 målet signaturen skal betydelig anriket i isolerte tarm stamceller samt i kliniske CRC prøver. Vi har imidlertid ikke observere en signifikant sammenheng mellom uttrykk av målet signatur og prognosen for CRC pasienter. Dette er interessant i betraktning at forhøyet ekspresjon av en intestinal stamcelle signatur forut dårlig prognose av CRC-pasienter [46], [49], og at deregulering av Wnt reaksjonsveien har vært kjent som et kjennetegn på CRC [50]. Det faktum at CTNNB1 målrette signaturen omfatter en rekke tilbakekoblings faktorer kan komplisere scenario. For eksempel kan undertrykkelse av de negative tilbakekoblings regulatorer slå på onkogene Wnt signal aktivitet i kreftceller, men siden disse tilbakemelding faktorer seg selv er wnt mål, kan det totale Wnt Målet genuttrykksmønstrene ikke synes å korrelere med prognose. Faktisk stanse av Wnt målgener av arrangøren metylering har blitt bemerket i CRC med dårlig prognose [46]. Våre resultater viser at ekspresjon av utvalgte negative feedback faktorer fra vårt gen liste faktisk korrelerer positivt med overlevelse av CRC pasienter (figur 6B). I slike tilfeller hvor de negative tilbakemeldinger regulatorer av veien er forstummet, kan den gjennomsnittlige målet genuttrykk ikke reflekterer den faktiske signal aktivitet av veien. Dermed denne studien og andre [46] antyder at overveielser av de komplekse regelverk og sammenheng avhengighet er garantert om den kliniske nytten av ulike Wnt mål gensettene som har dukket opp i litteraturen. Vår studie legger til et helhetlig syn på Wnt signalregulering i CRC, som har blitt studert i flere tiår, men ennå ikke fullt ut forstått.
Konklusjon
Våre data gir et genom-wide view av gen regulering av Wnt /CTNNB1 signalering i CRC. Målgenet analyse avslørte flere lag av feedback regulering av Wnt /CTNNB1 pathway. Den CTNNB1 direkte målet genet signaturen ble sterkt uttrykt i tarmstamcellepopulasjoner og kreftceller, men viste ikke signifikant korrelasjon med overlevelse av CRC pasienter. Denne studien gir en viktig ressurs for å forstå de komplekse og avvikende funksjoner av Wnt /CTNNB1 sti.
Metoder
Cell kultur
SW480 celler ble oppnådd fra ATCC og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte eagle medium supplementert med 10% føtalt bovint serum.
Chromatin immunoutfelling (chip) og high-throughput sekvense
brikken ble utført i henhold til protokollen fra Millipore med noen modifikasjoner. SW480 celler var tverrbundet først med en cocktail av protein-protein crosslinkers [0,67 mM disuccinimidyl sulfat (DSS), 0,67 mM disuccinimidyl glutarate (DSG), og 0,67 mM etylen glycolbis (succinimidylsuccinate) (EGS)] [20] for 45 minutter ved romtemperatur, og deretter i 0,75% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Etter vasking ble kromatin skåret inn i ~100-300-bp-fragmenter ved hjelp av en Bioruptor (Diagenode Inc.). Lysater ble klaret med Dynabeads protein A (Invitrogen) i en time ved 4 ° C, og små alikvoter av den gjenvunnede supernatanten ble underkastet revers tverrbinding og rensing av DNA (som inngangs prøver). Input-prøver ble brukt til å måle konsentrasjonen av kromatin DNA og immunoutfelling ble utført med 25 ug av DNA-innehold kromatin ved 4 ° C over natten med kontroll IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) eller anti-CTNNB1-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, sc-7199). Immuno-kompleksene ble deretter renset med Dynabeads protein A og omvendt tverrbundet ved å inkubere med 200 mM NaCl ved 65 ° C i 5 timer. Etter proteinase K-behandling i 1 time, ble ChIP DNA utvunnet ved hjelp av QIAquick PCR-rensesett (Qiagen, 28104). Bibliotek generasjon ble utført ved hjelp av samle ChIP DNA-prøver fra fire uavhengige Chip forberedelser ved hjelp av Illumina protokollen. Kort sagt ble ChIP DNA-fragmentender repareres og fosforylert ved bruk av Klenow, T4 DNA polymerase og T4 polynukleotidkinase (Illumina kit komponenter). Etter ligering av Illumina adaptere, DNA ble størrelse valgt av gel rensing og deretter PCR forsterket ved hjelp av Illumina primere. Sekvensering ble utført ved Ambry genetikk på en Illumina Genome Analyzer IIx, ett kjørefelt per prøve, 36-bp singleton sekvensering.
Validerings Forsøket ble utført ved hjelp ChIP-PCR med primere som er oppført i tabell S3.
Microarray analyse
analysen ble publisert tidligere [27], og eksperimentelle detaljene er som følger. To-farge mikromatriser ble utført i duplikater for SW480 celler transfektert med kontroll (siRNA mot luciferase genet) og to uavhengige sirnas mot CTNNB1 (CTNNB1 # 1 fremover; CUAUCUGUCUGCUCUAGUATT, revers, UACUAGAGCAGACAGAUAGTT, CTNNB1 # 2 fremover, CUGUUGGAUUGAUUCGAAATT, reverse, UUUCGAAUCAAUCCAACAGTT), henholdsvis. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble RNA ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen, Valencia, CA). cDNA ble syntetisert med Cy3 (kontroll) og Cy5 (CTNNB1 siRNA) merking, ved hjelp av en tilpasset automatisert versjon av aminoallyl MessageAmp II kit (Life Technologies). Merkede prøver ble hybridisert med Rosetta /Merck Humant 44k 1,1 mikroarray (GPL4372) ved inkubering ved 40 ° C i 48 timer på en roterende karusell. Etter vasking for å fjerne ikke-spesifikke hybridiserte prøvene, ble mikromatriser tørket i en ozonfritt nitrogen kammer. Mikromatriser ble skannet med Agilent LP2 laserskanner. Skanneren utgang er en TIFF-fil, som inneholder kvantitative hybridisering data fra hver enkelt microarray. TIFF filene ble deretter behandlet ved hjelp av Rosetta spesialtjeneste utvinning programvare, som utfører feil modellering. Data ble deretter behandlet ved hjelp av Rosetta Resolver® system, som utfører en klem operasjon som kombinerer replikater av samme sekvens i en matrise mens søknad feil vekting. Feilen vekting besto av å justere for additiv og multiplikativ støy.
