Abstract
NRP-2 er en høy affinitet kinase-mangel reseptor for ligander som tilhører klasse 3 semaphorin og vaskulær endotelial vekstfaktor familier. NRP-2 er blitt detektert på overflaten av flere typer humane kreftceller, men dets ekspresjon og funksjon i gastrointestinale (GI) cancerceller gjenstår å bli bestemt. Vi har søkt for å bestemme funksjonen av NRP-2 ved formidling av nedstrømssignalene som regulerer vekst og overlevelse av humane gastrointestinale kreftceller. I humane magecancerprøver, ble NRP-2-ekspresjon detektert i tumorvev, men ikke i tilstøtende normal slimhinne. I CNDT 2,5 celler, shRNA mediert knockdown NRP-2 uttrykk førte til redusert migrasjon og invasjon in vitro (p 0,01). Fokusert gen-rekke analyse viste at tap av NRP-2 redusert ekspresjon av en kritisk metastase mediator-genet, S100A4. Steady-state nivåer og funksjon av β-catenin, en kjent regulator av S100A4, ble også redusert i shNRP-2 kloner. Videre knockdown av NRP-2 sensibiliserte CNDT 2,5 celler
in vitro
til 5FU toksisitet. Denne effekten var assosiert med aktivering av kaspaser 3 og 7, spalting av PARP, og nedregulering av Bcl-2.
In vivo
vekst av CNDT 2,5-celler i leveren hos nakne mus ble signifikant redusert i shNRP-2-gruppe (p 0,05). Intraperitoneal administrering av NRP-2 siRNA-DOPC reduserte tumorbelastning i mus (p = 0,01). Samlet våre resultater viser at tumorcelle-avledet NRP-2 formidler kritisk overlevelse signalering i gastrointestinale kreftceller
Citation. Samuel S, Gaur P, Fan F, Xia L, Gray MJ, Dallas NA, et al . (2011) Neuropilin-2-medierte β-catenin signale og overlevelse i Human Gastro-Intestinal Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (10): e23208. doi: 10,1371 /journal.pone.0023208
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 31 mars 2011; Godkjent: 12 juli 2011; Publisert: 20 oktober 2011
Copyright: © 2011 Samuel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. RE » Bob «Smith Fond for Cancer Research (SS); National Institutes of Health stipend fem T32 CA09599 (ND, PG, og DB); Senter for RNA interferens og ikke-kodende RNA (GL-B, AS), og et program Prosjektutvikling Grant danne Ovarian Cancer Research Fund (GL-B, AS); William C. Liedtke jr, leder for Cancer Research (LE); National Institutes of Health stipend R01 CA112390 (LE). Disse organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Genentech, Inc. betalt for lønn og forskningsinfrastruktur for sine ansatte GP og AB, men hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, eller utarbeidelse av manuskriptet. Genentech, Inc. godkjent publisering av manuskriptet
Konkurrerende interesser. LE er en konsulent til Genentech, Inc., som ga de NRP-2 antistoffer, og til Roche. GP og AB ble betalt ansatte i Genentech på tidspunktet for undersøkelsen. En patentsøknad er inngitt knyttet til anti-NRP antistoffer fra Genentech som ble brukt i dette manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Neuropilin-2 (NRP-2) er et transmembran-glykoprotein som opprinnelig ble beskrevet som en reseptor for axon veiledning mediatorer, de semaphorins [1]. Deretter ble det funnet å bli uttrykt av venøse og lymfatiske endotelceller og identifisert som et coreceptor for medlemmer av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) familie [2], hvilket antyder en rolle i angiogenese og lymphangiogenesis [3]. NRP-2 ekspresjon er blitt rapportert på tumorceller i lungekreft [4], [5], neuroblastom [6], bukspyttkjertelkreft [7], osteosarkom [8], og blærekreft [9]. Imidlertid er funksjonen av NRP-2 i tumorcellemembran i humane kreftformer, inkludert de av gastrointestinal (GI) neuroendokrine og gastrisk opprinnelse, forblir stort sett udefinert. Tidligere har vi vist at NRP-2 uttrykkes på tykktarm og pankreatisk kreft celler og at dens ekspresjon er involvert i å fremme tumorvekst [10], [11]. Hensikten med denne studien var å bestemme funksjonen av NRP-2 ved formidling av nedstrømssignalene som regulerer vekst og overlevelse av humane gastrointestinale kreftceller. Vi fant at NRP-2 ble overuttrykt i humane magecancerprøver og i mage- og karsinoide celler in vitro. Vi belyst rollen til NRP-2 i cellelinjer med høyest NRP-2-ekspresjon. Vi har funnet at tap av NRP-2 redusert steady-state nivå og funksjon av β-catenin i disse celler. NRP-2 knockdown førte til reduksjon i ekspresjonen av S100A4 og redusert migrering og invasjon av celler in vitro. Videre knockdown av NRP-2 lysfølsomt CNDT 2,5-celler in vitro til 5FU toksisitet. Disse resultatene indikerer at NRP-2 formidler kritiske onkogene funksjoner i GI kreftceller og at hemming av sitt uttrykk og aktivitet kan utnyttes for terapeutisk effekt hos pasienter med metastatisk sykdom.
Resultater
Uttrykk for NRP-2 i humane mage kreft vev og cellelinjer
Vi først vurderes uttrykk for NRP-2 protein i parafininnstøpte vev av human magekreft og tilstøtende normal slimhinne av immunoperoksidasefarging. I representative prøver magekreft, ble NRP-2-protein uttrykt i magekreft epitel, men ikke i normal mukosal epitelium (figur 1A). NRP-2 protein (~130 kD) ble heterogent uttrykk over fem av de seks gastrointestinale kreftcellelinjer analysert ved Western blotting: AGS, CNDT 2,5, MKN74, NCI-N87 og KKLS (figur 1B). CNDT2.5 (en human cellelinje karsinoid [12], [13]), og NCI-N87 uttrykte de høyeste nivåene av NRP-2, og ble derfor brukt for etterfølgende knockdown studier. Som en kontroll preinkubasjon av NRP-2-antistoff med det immuniserende peptidet bekreftet spesifisiteten av antistoffet.
(A) Immunohistokjemisk farging for NRP-2-ekspresjon i representative vevssnitt (20X) av normal human mageslimhinnen og magekreft prøver (B) Immunoblot-analyse av NRP-2-ekspresjon i seks human GI cancercellelinjer. Vinculin fungert som en intern lasting kontroll. (C) Generering av stabile CNDT 2,5 cellelinjer med NRP-to knockdown. Immunoblotanalyse av NRP-1 og -2-ekspresjon i CNDT 2,5-celler transfektert med shcntr eller shNRP-2-plasmider (shNRP-2 kloner, C6 og C10). Vinculin fungerte som en lasting kontroll. (D) MTT analyseresultatene. Vekstratene var ikke annerledes mellom kontrollceller og NRP-2 knockdown kloner. Linjene indikerer SEM. (E) Topp: Midlere antall celler som migrerte i en Boyden kammer assay. Bunn: Representative bilder (10x) av migrasjon analyser. (F) Top: Gjennomsnittlig antall celler som invaderte i BioCoat Matrigel invasjonen kammer analysen. Bottom: Representative bilder (10x) av invasjons analyser
Effekt av NRP-2 uttrykk på celleproliferasjon in vitro
For å forstå funksjonen av NRP-2 i gastrointestinal kreft, vi. første undersøkte effekten av NRP-2 stanse på veksten av CNDT 2,5-celler in vitro. Vi valgte disse cellene fordi de uttrykker høye endogene nivåer av NRP-2. CDNT 2,5 celler ble stabilt transfektert med en shRNA kontroll (shcntr) eller shNRP-2 (shNRP-2) plasmid, og to shNRP-2 transfekterte kloner med en markant nedgang i NRP-2 protein uttrykk (C6 og C10, figur 1C) var valgt. shNRP-2 transfeksjon ikke påvirke ekspresjon av NRP-1 i disse cellene, bekrefte spesifisiteten av NRP-2 shRNA. Vi så brukt en MTT analyse for å bestemme virkningen av NRP-2 knockdown på vekst av celler in vitro. Kloner stabilt transfektert med shNRP-2 viste ingen endring i spredning priser i forhold til at av shcntr-transfekterte celler (figur 1D).
Effekt av NRP-2 uttrykk om migrasjon og invasjon
Effekten av NRP-2 RNAi på motiliteten av CNDT 2,5-celler ble undersøkt ved anvendelse av Boyden kammer analyser. Antall celler som migrerte til bunnen kammeret var betydelig lavere i shNRP-2 transfekterte celler (37 ± 5 per felt) enn i shcntr transfekterte celler (140 ± 12 per felt) (p 0,001; figur 1E, øverst). Motsatt, når celler med lav endogen ekspresjon av NRP-2 (KKLS) ble transient transfektert med en NRP-2 cDNA-ekspresjon konstruere for å overuttrykke proteinet, ble cellemigrasjon betydelig økt (data ikke vist).
celle invasjon ble evaluert ved bruk av den modifiserte Boyden kammer analysen med membraner belagt med Matrigel. NRP-2 RNAi vesentlig hemmet invasjon av CNDT 2,5 celler (64,4%; p 0,001; figur 1F, øverst). Men på grunn invasjon av celler i denne analysen er også en funksjon av den vandrende potensial av cellene, er det vanskelig å lokke ut de individuelle bidragene. Som sådan, gitt at forskjellene mellom de to gruppene er lik i begge analysene, vi kan ikke utelukke den oppfatningen at det reduserte antallet invaderende celler kan bare reflektere redusert migrasjon av shNRP2 kloner.
Effekt av NRP- 2 knockdown på uttrykk kjente metastatiske gener
Siden invasjonen og migrasjon er forbundet med metastatisk fenotype, utførte vi et gen rekke analyse ved hjelp av en fokusert menneskelige metastase microarray som representerer 113 gener som er kjent for å være involvert i metastasering. Undertrykkelse av NRP-2 førte til en reduksjon i ekspresjonsnivået av flere metastatiske gener (figur 2A). Mange av de downregulated genene som var responsive til NRP-2 knockdown er kjent for å være assosiert med degradering av den ekstracellulære matriks og er sterkt uttrykt i løpet av metastasering. Mest spesielt, observerte vi at downregulating NRP-2 forårsaket en signifikant reduksjon (mer enn 95%) i ekspresjon av S100A4 (figur 2A). Fordi S100A4 var svært lydhør overfor NRP-to knockdown, fokuserte vi på dette genet for videre studier. Western blot analyse bekreftet at S100A4 protein uttrykk ble betydelig redusert etter NRP-to knockdown (figur 2B).
(
A
) autoradiografisk bilde av tabellen membran viser differensial uttrykk for metastatisk gener i shcntr (
venstre
) og shNRP-2 (
høyre
) celler. Sirklet flekker indikere posisjonen til S100A4 genet. (B) Validering av S100A4 protein ekspresjon nivå i celler ved immunblotanalyse. Actin fungerte som en lasting kontroll. (C) Reduksjon av steady-state nivå av β-catenin av NRP-to knockdown. β-catenin ekspresjon i shcntr og shNRP-2-celler ble bestemt ved immunblotting. Vinculin fungerte som en lasting kontroll. (D) Verifikasjon av redusert β-catenin uttrykk i shNRP-2 celler ved immunfluorescens farging. shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5 celler vokser i kammer lysbilder ble fikset og immunostained med anti-β-catenin antistoff (rød). Kjerner ble kontra med DAPI (blå). (E) Validering av β-catenin reduksjon i en andre NRP-2 knockdown magekreft cellelinje. NCI-N87 magekreftceller ble infisert med lentivirus inneholder shcntr eller shNRP-2 konstruksjoner. Immunoblot analyse viste reduksjon i β-catenin uttrykk i NCI-N87 NRP-2 knockdown celler. Actin fungerte som en lasting kontroll. (F) β-catenin nivå i det cytoplasmatiske (Cyto) og kjernefysiske (NUC) fraksjoner av shcntr og shNRP-2-celler. HSP90 (cytoplasma) og LaminB (kjernekraft) tjente som fraksjone kontroller.
Effekt av NRP-to knockdown på uttrykk og lokalisering av β-catenin
Fordi S100A4 er et direkte transkripsjonen mål av β-catenin, undersøkte vi ekspresjonen av β-catenin i NRP-2 knockdown-celler. Total β-catenin protein uttrykk var betydelig lavere i CNDT 2,5 shNRP-2 celler enn i shcntr celler (Figur 2C). For ytterligere bekreftelse, shcntr og shNRP-2 kloner ble fikset og immunostained med anti-β-catenin antistoff (rød fluorescens). I samsvar med de vestlige blot data ble samlet β-catenin nivåer betydelig redusert i NRP-to knockdown celler (figur 2D). For ytterligere validering i en andre magekreft cellelinje, ble NRP-2 slått ned i NCI-N87 celler som uttrykker en høy endogene nivået av NRP-2, med lentivirus-mediert stabil shNRP-2 innlemmelse. Etter verifisering av NRP-2 knockdown (figur 2E, USA panel) i disse celler, ble det β-catenin nivå bestemt ved western blotting. Den totale β-catenin nivået ble betydelig redusert i disse NRP-to knockdown celler (figur 2E, Top panel).
For å finne ut om NRP-2-mediert β-catenin uttrykk var ligand avhengige eller ligand uavhengig, β-catenin status ble evaluert ved western blot-analyse i CNDT 2,5-celler etter behandling med blokkerende antistoffer til NRP-2 (anti-NRP-2
B, som blokkerer VEGF-C-binding, og pan-anti-NRP, som blokkerer Sema binding til både NRP-1 og NRP-2 og også blokkerer VEGF-bindings gjennom sterisk hindring); anti-NRP1 antistoff fungerte som kontrollgruppe (alt fra Genentech, San Francisco, California). Sammenlignet med kontrollgruppen, var det ingen forskjell i ekspresjonen av β-catenin i celler behandlet med sperre antistoffene, noe som antyder at NRP-2-mediert signalisering i disse cellene er uavhengig ligand (data ikke vist).
β-catenin er kjent for å utøve sin funksjon ved translocating fra cytoplasma til kjernen, hvor det binder til transkripsjonsfaktorer slik som T-celle-faktor (TCF) /lymfoid enhancer-bindende faktor og derved stimulerer transkripsjon av mål-gener. Vi analyserte derfor den relative overflod av β-catenin protein i cytosol og kjernefysiske avdelinger i CNDT2.5 shNRP-2 og shcntr celler etter cellefraksjonering. Som vist i figur 2F, NRP-2 knockdown førte til en betydelig reduksjon i steady-state nivå av β-catenin protein i både den cytosoliske og atomfraksjoner av cellene.
Effekt av NRP-2 knockdown på funksjon av β-catenin
for å finne ut om NRP-to knockdown påvirket også signal aktiviteten av β-catenin, transfektert vi CNDT 2,5 shcntr og shNRP-2-celler med TCF reporter plasmid TOPflash eller kontroll plasmid FOPflash. TOPflash inneholder et luciferase reporter under kontroll av tre eksemplarer av villtype-TCF-bindende element oppstrøms av tymidinkinase minimal promoter og er spesifikt regulert ved β-catenin signalering. I FOPflash er TCF-bindende element mutert. Den luciferase assay viste at reporteren aktiviteten ble redusert to ganger i shNRP-2-celler sammenlignet med aktivitet i shcntr celler (figur 3A).
(A) Taksering av TCF reporter aktivitet ved hjelp av β-catenin- responsive TOPflash eller mutante FOPflash journalister. Luciferase-aktivitet ble målt etter forbigående transfeksjon av rapportør plasmider inn i shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5-celler (B) Økt proteasom-mediert nedbrytning av β-catenin i shNRP-2-celler. shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5-celler ble behandlet med 30 uM MG132 eller like stort volum av DMSO (et oppløsningsmiddel for MG132) i 2 timer. Cellelysater ble analysert ved immunoblotting ved anvendelse av anti-β-catenin antistoff ( «φ», ingen behandling; «UB», ubiquitinated β-catenin). (C) Immunoblot-analyse som viser restaureringen av β-catenin nivå i de cytoplasmiske og kjernefraksjoner etter behandling med 30 uM MG132 i 2 timer. (D) Redusert nivåer av fosforylert GSK3p i NRP-2 knockdown celler. Immunoblot-analyse av fosforylert GSK3P (ved Ser-9) og GSK3p. (E) Restaurering av β-catenin nivå etter blokkering GSK3p aktivitet i NRP-2 knockdown celler. shcntr eller shNRP-2 CNDT 2,5 knockdown-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av LiCl i 24 timer og høstet for immunoblotanalyse å detektere β-catenin.
Effekt av NRP-2 knockdown på stabiliteten av β- catenin
Intracellulær β-catenin protein nivåer blir vedlikeholdt av en multiprotein «ødeleggelse kompleks» som inneholder APC, Axin, og GSK3p. I et aktivt kompleks, phosphorylates GSK3p β-catenin, den merkes for anerkjennelse av β-trCP, polyubiquitinylation, og påfølgende nedbrytning av proteasome kompleks. Vi utførte inhibitor studier for å vurdere stabiliteten av β-catenin i NRP-2 knockdown-celler. Behandling med MG132, en proteasominhibitor, førte til gjenopprettelse av den totale β-catenin proteinnivået i NRP-2 knockdown-celler til nivået i shcntr celler (figur 3B). Videre behandling med MG132 også gjenopprettet den totale β-catenin proteinnivået i både den cytosoliske og nukleære kamrene i NRP-2 knockdown-celler (figur 3C).
posttranslasjonelle modifikasjoner er kjent for å spille en avgjørende rolle i regulering av β-catenin omsetning, og β-catenin sekvensielt bli fosforylert av GSK3p. For å undersøke hvorvidt GSK3p-aktivering var involvert i nedregulering av β-catenin, undersøkte vi fosforyleringen status av GSK3P ved anvendelse av et antistoff mot Ser-9 fosforylerte form av GSK3p. Ser-9 fosforyleringen har blitt rapportert å gjengi GSK3p inaktiv. Som vist i figur 3D, ble Ser-9 fosforylering av GSK3P signifikant redusert i de shNRP-2-celler, noe som viser at i disse celler ble det økte nivåer av aktiv GSK3P protein, noe som fremmer β-catenin degradering. For ytterligere å bekrefte involvering av GSK3P aktivering i reguleringen av β-catenin, effekten av litiumklorid (LiCl)
, en kjent inhibitor av GSK3p-aktivitet, ble analysert. LiCl har blitt rapportert å indusere den hemmende Ser-9 fosforylering av GSK3P samtidig som de har ingen effekt på andre proteinkinaser. Som vist i figur 3E, behandling med LiCl stabilisert β-catenin protein i shNRP-2-celler på en doseavhengig måte.
Effekt av NRP-2 knockdown på kjemosensitivitet av gastrointestinale kreftceller in vitro
Gitt den kjente rollen til β-catenin som formidler celleoverlevelse, hypotese vi at en redusert β-catenin nivå i NRP-2 knockdown-celler ville føre til øket kjemosensitivitet av disse cellene. For å teste denne hypotese, vi først utført en in vitro-analyse kjemosensitivitet med 5-fluoruracil (5FU), som brukes som standard terapi for gastrointestinal kreft. I samsvar med vår hypotese, ved hjelp av annexin V-farging, CNDT 2,5 shNRP-2-celler som ble behandlet med en klinisk relevant dose av 5-FU viste en betydelig høyere prosentandel av apoptotiske celler enn gjorde shcntr celler (25,5% vs. 12,5%, respektivt; p 0,05; fig. 4A)
(A) Annexin V-assay på shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5-celler etter behandling uten eller med 5-FU i 48 timer. (B) Western blot analyse av apoptotiske markører i celleekstrakter fra shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5 celler behandlet uten eller med 5FU. Vinculin og aktin fungerte som lasting kontroller.
For å bekrefte mekanismen for 5-FU-indusert celledød, vi sammenlignet aktivering av apoptotiske meklere i CNDT 2,5 shcntr og shNRP-2-celler behandlet med 5-FU. Aktivering av kaspase-3 og -7, effektorcellene kaspasene i den apoptotiske kaskade, og spaltning av caspase substratet PARP, som utøver proapoptotiske aktivitet, ble vurdert ved immunoblotting ved bruk av antistoffer som spesifikt gjenkjenner de spaltede produkter. I samsvar med den økte apoptose i 5-FU-behandlede NRP-2 knockdown-celler, ble det observert en markert økning i nivåene av aktiv caspase-3 og -7 i disse cellene, men ikke i shcntr celler (figur 4B). Videre observerte vi PARP spalting i 5-FU-behandlede shNRP-2-celler, men ikke i 5-FU-behandlede shcntr celler (figur 4B). I tillegg observerte vi betydelig ekspresjon av det protein antiapoptotic BCL2 i CNDT 2,5 shcntr celler; BCL2 uttrykk var fraværende i shNRP-2 celler.
Effekt av NRP-to knockdown på in vivo vekst av gastrointestinale kreftceller
For å undersøke effekten av NRP-to knockdown på veksten av gastrointestinale kreftceller in vivo, injisert vi CNDT 2,5 shcntr eller shNRP-2 kloner i leveren (et felles nettsted for gastrointestinal kreft metastase) mus (10 dyr per gruppe) og vurderes svulst forekomst og tumor volum. Alle mus som var av omtrent samme vekt når ofret. Tumor forekomsten var signifikant lavere i mus injisert med shNRP-2 kloner enn i mus injisert med shcntr celler (30% for shNRP-2 C6 og 10% for shNRP-to C10 vs. 80% for shcntr; p 0,05, Fishers Exact Test, figur 5A). Videre tumorer som er produsert av CNDT 2,5 shNRP-2-cellene var betydelig mindre (Midlere levertumorvolum på 38 ± 24 mm
3 og 14 ± 10 mm
3 for de to kloner, henholdsvis) enn det som var tumorer som produseres av styre celler (Mean levertumor volum av 1,797 ± 880 mm
3; p 0,05, figur 5B). Den plottede data omfatter alle de 10 mus i hver gruppe, inkludert de som ikke utvikler noen svulst (dvs. 7/10 og 9/10 henholdsvis i de to shNRP2 grupper Vs 2/10 i kontrollgruppen). Representant bilde av hele leveren med svulst fra hver gruppe vises i nedre panel. Knockdown av NRP2 i svulstene ble bekreftet av immunoblot analyse av NRP-2 i leveren tumorvev fra mus injisert med CNDT 2,5 shcntr eller shNRP-2 C6 celler (figur 5C).
(A) Redusert svulst forekomst og mener tumor volum etter NRP-to knockdown. Tumor forekomst (10 mus) etter lever injeksjon med CNDT 2,5 shcntr celler eller en av to shNRP-2 kloner. (B) Top: Avsluttende leversvulstene volumer i mus injisert med shcntr og shNRP-2 kloner. Bunn: Representative bilder av svulster. (C) Immunoblot-analyse av NRP-2 i tumorer fra mus injisert med CNDT 2,5 shcntr eller shNRP-2-C6-celler [ «T1»; Tumor # 1; «T2»; Tumor # 2]. β-Actin fungert som en lasting kontroll.
Effekt av in vivo målretting av NRP-2 på veksten av gastrointestinale kreftceller
Deretter undersøkte vi effekten av in vivo administrasjon av NRP-2 målrettet siRNA anvendelse av 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfatidylcholin (NRP-2 siRNA-DOPC) nøytrale nanoliposomes [10], [14] på veksten av gastrointestinale krefttransplantater i mus. CNDT 2,5-celler ble dyrket som s.c. xenograft, og NRP-2 siRNA-DOPC behandlingen ble startet på dag 7 i mus med synlige svulster (15 ± 1,5 mm
3). Behandling besto av to ganger ukentlig intraperitoneal injeksjon med 5 mikrogram cntr siRNA-DOPC eller NRP-2 siRNA-DOPC. Det gjennomsnittlige volum av svulster i mus behandlet med NRP-2 siRNA-DOPC var mindre enn den for mus behandlet med Cntr siRNA-DOPC sekvenser (264,4 ± 19,4 mm
3 vs. 751.3 ± 150,6 mm
3, henholdsvis; p = 0,01; figur 6A). Videre mus behandlet med NRP-2 siRNA-DOPC oppviste en signifikant reduksjon i tumormasse sammenlignet med tumormasse hos mus behandlet med Cntr siRNA-DOPC sekvenser (160 ± 18 mg vs. 459 ± 102 mg, henholdsvis; p 0,05; figur 6B). Immunhistokjemisk farging av tumorvev bekreftet at NRP-2 uttrykk ble redusert i svulster fra mus behandlet med NRP-2 siRNA-DOPC sekvenser sammenlignet med svulster fra mus behandlet med Cntr siRNA-DOPC sekvenser (figur 6C).
(A) Tumor volum etter administrasjon av sicntr og siNRP-2 liposomer. Nude mus (7 per gruppe) var subkutant injisert med 1 × 10
6 CNDT 2,5 celler. Mus med synlige svulster var stratifisert og behandlet med 5 ug liposom-konjugert siRNA (i.p. injeksjoner) to ganger ukentlig. NRP-2-siRNA DOPC-behandling førte til en signifikant reduksjon i tumorvekst sammenlignet med cntr siRNA DOPC-behandling (264,4 mm
3 sammenlignet med 751.3 mm
3, henholdsvis; *
p =
0,01). (B) Topp: Ved slutten av eksperimentet, s.c. Tumorene ble skåret ut og veiet. Tumor vekt var betydelig lavere i NRP-to-siRNA-DOPC behandlet mus (gjennomsnitt, 160 mg) sammenlignet med Cntr siRNA DOPC-behandlede mus (gjennomsnitt, 459 mg; *
p
= 0,01). Bunn: Representative bilder av svulster (C) immunoblotanalyse av NRP-2 i svulster fra mus behandlet med cntr-siRNA DOPC eller NRP-to-siRNA DOPC
Diskusjoner
Neuropilin. -2 (NRP-2) er tradisjonelt kjent for å fungere som en nonsignaling coreceptor for klasse 3 semaphorins og medlemmer av VEGF-familien [1], [2]. Selv om ekspresjonen av NRP-2 ble opprinnelig tenkt å være begrenset til neuroner, har studier vist at NRP-2 uttrykkes på VSMCs, endoteliale celler og tumorceller. NRP-2 er rapportert å samhandle med VEGFR2 og VEGFR3 og øke overlevelse og migrering av vaskulær og lymfatiske endotelceller [15]. Nyere funksjonelle studier av Caunt og medarbeidere har vist at blokkering av NRP-2 i en preklinisk lungemetastase modell forhindret tumormetastase ved å blokkere dannelsen av tumor-assosierte lymfekar [16].
ekspresjon av NRP-2 har vært oppdaget på kreftcellene av pasientprøver av mange krefttyper, inkludert glioblastom, neuroblastom, og melanom. Vårt laboratorium og andre har vist at tumorcelle-avledet NRP-2 spiller en rolle ved tumorvekst [10], [11]. Vi har søkt å ytterligere klargjøre den funksjonelle rolle av NRP-2 og signaleringsmekanismer som medierer funksjonen av NRP-2 i GI kreftceller, inkludert gastrisk og karsinoide celler. Vi viser i denne studien som NRP-2 er sterkt uttrykt ved tumorceller i gastrisk karsinom vev og ved gastrointestinal kreft-cellelinjer, men det er ikke påvisbart ved immunhistokjemi i normal gastrisk mucosa. Mekanismer som NRP-2 nivåer er oppregulert i gastrointestinale kreft fortsatt uklare. Interessant, Tsukamoto og medarbeidere [17] fant at 40% av magekreftpasienter analysert hadde en gevinst ved 2q33 (regionen der den NRP-2-genet er lokalisert) av matrisen komparativ genomisk hybridisering (CGH) analyse, noe som tyder på kopiantall aberrasjon ( CNA) for denne regionen.
Vi utnyttet en shRNA-mediert RNA interferens tilnærming til å undertrykke NRP-2 uttrykk i magekreftceller til å undersøke de resulterende fenotypiske endringer, inkludert proliferativ, vandrende, og invasive aktiviteter. Knockdown av NRP-2 påvirket ikke proliferasjon av CNDT 2,5-celler in vitro; Men tapet av NRP-2 reduserte veksten av tumorxenotransplantater
in vivo
. Avviket mellom
in vitro Hotell og
in vivo
veksthemming kan skyldes NRP-2-medierte reaksjoner fra celler i svulsten mikromiljøet på svulststedet
in vivo
som ikke er nevneverdig i en
in vitro
system.
In vitro-studier
videre vist at det var en markert hemming av både migrering og invasjon av cellene. Ved hjelp av metastaseassosierte gener i et cDNA microarray analyse identifiserte vi S100A4, en nøkkel metastase mekler genet, å bli betydelig nedregulert etter NRP-2 demping. S100A4 tidligere har vært forbundet med metastase i en rekke eksperimentelle systemer [18], [19]. Nyere studier har vist at S100A4 kan også bidra til progresjon av kreft ved å øke celleoverlevelses funksjoner. Mahon og kolleger [20] har vist at S100A4 knockdown sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til gemcitabin behandling, i tillegg til å aktivisere caspases og PARP, noe som resulterer i økt apoptose og cellesyklus arrest. Vi observerte at nedregulering av NRP-2 i magekreftceller chemosensitized cellene til 5FU-behandling. Videre studier er nødvendig for å fastslå om NRP-2 formidler prosurvival funksjoner i mage kreftcellene via S100A4.
Videre undersøkelse av NRP-2-mediert S100A4 regulering viste at steady-state nivåer og funksjon av β-catenin, en direkte transcriptional regulator av S100A4, ble kompromittert i NRP-2 knockdown celler. En stor mengde data støtter bidraget av aktivering av β-catenin signalveien i utvikling og progresjon av kreft. Aktiveringen av Wnt /β-catenin signalering er funnet i omtrent 30% av gastrisk kreft [21]. I en fersk undersøkelse, Wang og kolleger [22] har foreslått β-catenin stabilisering som et virknings for ATDC-mediert onkogene funksjon i bukspyttkjertelkreft. Ved hjelp av en transgen musemodell, Oshima og kolleger [23] har vist at samarbeid av Wnt signal og prostaglandin E
2 (PGE
2) sti fører magekreft utvikling. Den vedvarende β-catenin bane aktivering observert i NCI-N87-celler må være uavhengig av mutasjoner i APC og β-catenin gener, fordi denne cellelinjen ikke harbor noen iboende mutasjoner i noen av disse gener. Den mekanismen som NRP-to stanse påvirker denne veien er fortsatt uklart.
En mulig begrensning av vår studie er at vi analysert veksten av NRP-to knockdown mage kreftceller som primære svulster, men ikke evaluere metastasering av svulster. Gitt vår observasjon at disse cellene har redusert migrasjon og invasjon etter NRP-to knockdown,
in vivo
metastatisk potensialet i disse cellene behov utforskes i fremtiden. Videre studier er også klart behov for å klargjøre det mulig mekanisme ligger til grunn for demping av β-catenin pathway by NRP-2 demping. Dette er fortsatt en stor uløst problem og er gjenstand for en pågående etterforskning i vårt laboratorium.
NRP-2 fremstår som en roman terapeutisk mål. Med den rollen NRP-2 i tumorcellemigrering og invasjon, målretting NRP-2 gir en potensiell ny tilnærming for å hemme vekst og overlevelse av kreftceller hos pasienter med metastatisk sykdom. Også fordi NRP-2 synes å ha roller forskjellige fra den til VEGF familien av reseptorer, målretting NRP-2 er usannsynlig å ha det samme resultat som rettet mot VEGF. Det er funnet at behandling av gastrointestinale kreftceller med bevacizumab har ingen effekt på β-catenin uttrykket (data ikke vist). Målrette NRP-2 kan derfor utfylle og utvide de antitumor effekten av behandlinger som er rettet mot VEGF, for eksempel bevacizumab.
Vi fant at NRP-2-mediert β-catenin uttrykk observert i denne studien er ligand uavhengig. Dette ligand-uavhengig NRP2 signale er romanen imidlertid; mekanismen (e) å mediere dette fenomen gjenstår å bli forstått. På det nåværende tidspunkt, kan vi bare spekulere på mekanismen (e) som er involvert, på grunnlag av de dokumentert for andre membranreseptorer. (I) Det kan tenkes at det i tumorceller øket ekspresjon av NRP2 på celleoverflaten resulterer i ligand-uavhengig aktivering av NRP2 mediert signalisering gjennom spontan NRP2 binding til VEGFR /plexin. (Ii) Alternativt kan ligand-uavhengig NRP2 signalering kan også aktiveres ved homo-dimerisering (eller heterodimerisering med NRP1) som i tilfellet med mange andre membranreseptorer. NRPS er kjent for å danne homo- eller hetero-multimerer selv i fravær av ligand gjennom membranen-proksimale c domene. (Iii) En tredje mulighet påkaller aktivering via sti crosstalk med andre membranreseptorer, men dette reiser spørsmålet om hvordan de postulerte reseptorene er aktivert. I alle tilfelle, proteiner som forbinder med NRP2, inkludert neuropilin samspill protein (NIP) /synectin, sannsynligvis vil være nøkkelen til ligand-uavhengig signalering.
