Abstract
mirnas er spådd til å kontrollere aktiviteten til ca 60% av alle proteinkodende gener som deltar i reguleringen av flere mobilnettet prosesser og sykdommer, inkludert kreft. Nylig har vi vist at MIR-187 er betydelig nedregulert i prostatakreft (PCA) og her foreslår vi en proteomikk tilnærming for å identifisere sine potensielle mål. For dette formål ble PC-3-celler transient transfektert med MIR-187-forløper og miRNA ligne negativ kontroll. Proteiner ble analysert ved hjelp av en to-dimensjonal forskjell gelelektroforese (2D-DIGE) og definert som differensielt regulert om den observerte ganger endring var ± 1,06. Deretter ble utført MALDI-TOF-MS-analyse etter proteinfordøyelsen og lav overflod proteiner ble identifisert ved LC-MS /MS. Peptider ble identifisert ved å søke mot Expasy SWISS PROT database, og målet validering ble utført både in vitro av western blot og QRT-PCR og i kliniske prøver ved QRT-PCR, immunhistokjemi og ELISA. DIGE analyse viste 9 forskjellig uttrykt flekker (p 0,05) og 7 viste en nedregulert uttrykk på MIR-187 re-introduksjon. Blant disse målene vi identifisert aldehyd dehydrogenase 1A3 (ALDH1A3). ALDH1A3 uttrykk var signifikant nedregulert i PC3, LNCaP og DU-145 celler etter MIR-187 re-introduksjon. Støtte disse dataene, ble uttrykket av ALDH1A3 funnet signifikant (p 0,0001) oppregulert i PCA prøver og negativt korrelert (p 0,0001) med Mir-187 uttrykk, dens uttrykk er direkte forbundet med Gleason score (p = 0,05). Ekspresjon av ALDH1A3 ble målt i urinprøver for å evaluere den prediktive evnen til denne biomarkør for tilstedeværelsen av PCa og, ved et betydning nivå på 10%, PSA og også ALDH1A3 var signifikant assosiert med en positiv biopsi av PCa. I konklusjonen, våre data viser for første gang rollen som ALDH1A3 som MIR-187 mål ved PCA og gi innsikt i nytten av å bruke dette proteinet som en ny biomarkør for PCa
Citation. Casanova-Salas jeg, Masiá E, Armiñán A, Calatrava A, Mancarella C, Rubio-Briones J et al. (2015) MiR-187 Targets androgen-regulert Gene
ALDH1A3
i prostatakreft. PLoS ONE 10 (5): e0125576. doi: 10,1371 /journal.pone.0125576
Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 20 oktober 2014; Godkjent: 25 mars 2015; Publisert: 13. mai 2015
Copyright: © 2015 Casanova-Salas et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data fra microarray analysen er tilgjengelig på NCBI Gene Expression Omnibus database sjonsnummer GSE45604
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Instituto de Salud Carlos III PI10 /01206, FPI11 /00505, Madrid, FPI (CTQ2007-60601; CTQ2011-18195) fra spanske departementet for vitenskap og utdanning, og fra det italienske departementet for forskning og Instruction (FIRB prosjektnummer: RBAP11884 M_005), den italienske foreningen for Cancer Research (Katia Scotlandi-AIRC prosjekt N.14049). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftdød i menn [1]. Omtrent en av tre menn over en alder av 50 år viser histologiske tegn på PCa. Imidlertid vil bare 10% av disse være riktig diagnostisert med klinisk signifikant PCa [2]. PSA nivåer kombinert med digital rektal undersøkelse (DRE) er de viktigste kriteriene for PCa diagnose, men ofte føre til over diagnostisering og overbehandling [3]. Følgelig er identifisering av nye biomarkører, i stand til å forbedre diagnostikk og påvisning av potensielt aggressive PCA for å bedre støtte kliniske avgjørelser.
mirnas er en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler som består av 19-22 nukleotider; de er involvert i en rekke biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, apoptose og celleproliferasjon. mirnas regulere genekspresjon gjennom translasjonelle undertrykkelse og mRNA spalting av mer enn 60% av protein-kodende gener [4, 5]. Flere studier tyder på at en person miRNA kan regulere flere hundre mål [6] og kan fungere enten som en tumor suppressor eller onkogen, avhengig av målgener [7], så vel som å bidra til initiering og utvikling av forskjellige typer kreft, inkludert PCa [5].
Ved hjelp av miRNA microarray analyse (NCBI Gene Expression Omnibus database sjonsnummer GSE45604), vår gruppe identifisert MIR-187 som en tumor suppressor miRNA ved PCA [8]. Selv om verktøyet har blitt vist i den diagnostiske innstillingen, til dags dato ikke eksperimentelt bekreftet mål for Mir-187 har blitt identifisert ved PCA. De fleste beregningsalgoritmer forutsi miRNA som er basert primært på sekvens komplementaritet mellom 5′-enden av det modne miRNA og den 3′-utranslaterte region (3′-UTR) av mål-mRNA; Men disse algoritmene gir relativt høy forekomst av både falske positive og falske negative [6]. Videre er det kjent at mer enn 25% av eksperimentelt validerte mål ikke kan forutsies ved en hvilken som helst av de mest vanlige miRNA target forutsigelse programvare [9]. Derfor er genuttrykk og proteomikk screening tilnærminger sterkt behov for å eksperimentelt identifisere miRNA mål.
Denne studien benyttet en proteomikk tilnærming basert på to-dimensjonal elektroforese (2D-DIGE) etterfulgt av matrise-assistert laser desorpsjon-ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse og, for første gang, identifisert
ALDH1A3
som MIR-187 mål ved PCA. I tillegg ble den potensielle nytten av ALDH1A3 som en svulst biomarkør evaluert.
Materiale og metode
2.1. Kliniske prostata prøver
Formalin-fiksert og parafininnstøpte (FFPE) blokker som tilsvarer 195 PCA pasienter ble hentet fra arkivene til Biobank av
Fundación Instituto Valenciano de Oncologia
utføre følgende inkludering kriterier: prøver hentet fra radikale retropubic prostatectomies mellom 1996 og 2002, og ingen historie med tidligere behandling for PCa (inkludert androgen deprivasjon eller kjemoterapi før operasjonen). Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke for vev donasjon for forskningsformål før vev samling, og studien ble godkjent av etikkomiteen av Fundación Instituto Valenciano de Oncologia (ref. Nummer. 2010-19). Eksklusjonskriterier inkluderte tidligere behandling eller tilstedeværelse av andre svulster sammen med unacceptance for donasjon samtykke. De kliniske data ble gjennomgått fra de kliniske poster og lagret i PCA-spesifikk database. Pasientkarakteristikker og demografisk informasjon er vist i tabell 1. Gleason score ble jevnt vurdert ved den samme patologen (AC). For sammenlignings og kalibrering, 8 prøver av normal prostata vev hentet fra pasienter som gjennomgår radikale cystectomies uten patologiske tegn på prostata sykdom ble også analysert.
Ti ferske vevsprøver fra histologisk bekreftet PCa ble hentet fra arkivet av biobanken fra Hospital Clínico Universitario de Valencia (INCLIVA) for valideringsformål. Totalt urinprøver ble oppnådd etter DRE og umiddelbart før diagnostisk nålebiopsi fra en uavhengig kohort av 123 menn med mistanke om PCA fra hvem bly 63 til en positiv biopsi.
2,2. Cellelinjer og miRNA transfeksjon
PC-3, LNCaP, DU-145, og 22RV1 ble dyrket i RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) mens Vcap PCA- avledet celler ble dyrket i DMEM (ATCC, Middlesex, UK) medium med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml Penincillin og 0.1ug /ml streptomycin ved standard cellekulturbetingelser (37 ° C i 5% CO
2 i en fuktet inkubator). MIR-187, som tidligere har blitt funnet å bli nedregulert i PCa [8], ble analysert i disse cellelinjer ved QRT-PCR som beskrevet nedenfor.
PC-3, LnCap og DU-145-celler ble forbigående transfektert ved hjelp SIPORT NeoFX Transfeksjon Agent (Applied Biosystems, Life Technologies, California, USA), med 40nm forløpere for Mir-187 (HSA-MIR-187-3p miRNA etterligne) og miRNA etterligne negativ kontroll 1 #, i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems, Rednings Technologies, California, USA). Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon og celle levedyktighet ble målt til å evaluere sin giftighet bruker CellTiter 96 vandig ikke-radioaktivt celleproliferasjonsanalyse (Promega, Wisconsin, USA) i henhold til produsentens anvisninger.
2,3. Identifisering av målgener for MIR-187
Proteiner fra Mir-187 etterligne versus miRNA etterligne negativ kontroll 1 # transfekterte PC-3 celler ble analysert ved todimensjonal forskjell gelelektroforese (2D-DIGE). Kort fortalt ble proteiner av de to sammenlignet gruppene utfelt med 2-D Clean-Up kit (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Prøvene ble deretter resuspendert i buffer DIGE farging DIGE (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris) og kvantifisert ved hjelp av Bradford-proteinanalysen (BioRad, Hercules, CA, USA). Prøvene ble merket med 400 pmol /50 mikrogram av protein med CyDye DIGE Fluor fluorophors Cy3 og Cy5 (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) som anbefalt av produsenten. Et basseng inneholdende like mengder av alle prøvene ble også fremstilt og merket med Cy2 å bli brukt som en intern standard på alle geler for å hjelpe bilde matchende og kryss-gel statistisk analyse. Seks biologiske ganger i hver transfektert prøve ble utført, og seks geler ble samlet totalt. Proteinseparasjon ble utført ved todimensjonale elektroforese. I den første dimensjonen, ble proteinene separert i henhold til deres isoelektriske punkt på immobilisert 24 cm lineær pH-gradient (IPG) strimler (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA), rehydratiserte i rehydratisering buffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 0,5% IPG Buffer, 50 mM DTT) over natten. I den andre dimensjon, ble proteinene separert i henhold til molekylvekten på 25 cm x 21 cm x 1 mm 12.5% akrylamidgeler. De geler ble skannet med en Typhoon 9400 Variable Mode Imager (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) og den påfølgende gel bildene ble importert til DeCyder Differential Analysis Software. Proteiner ble definert som ulikt regulert om den observerte ganger endring var ± 1,06 (
p
0,05) mellom miRNA etterligne negativ kontroll 1 # transfektert PC-3 og miRNA-187 ligne transfektert PC-3. Protein fordøyelse ble utført med sekvensering karakter trypsin (Promega, Wisconsin, USA) som beskrevet andre steder [10]. MALDI-TOF MS analyse ble deretter utført ved hjelp av 0,5 mL av fordøyelsen blanding oppdaget på MALDI sikteplate. Etter luft-tørking av dråpene ved romtemperatur, 0,5 ul av matrisen [5 mg /mL, CHCA (Sigma, St.Louis, MO, USA) i 0,1% TFA-ACN /H2O (1: 1, v /v)] var tilsatt og fikk lufttørke ved romtemperatur. En kjent prøve ble behandlet likt som kvalitetskontroll. De resulterende fraksjonene ble analysert i en 4700 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, USA) i positiv reflectron modus (2000 skudd hver posisjon). Lav overflod proteiner ble identifisert ved LC-MS /MS ved anvendelse av en felle-kolonne (NanoLC Kolonne, 3μ C18-CL, 75 μ x 15 cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) gjennom en isokratisk fluks av 0,1% TFA i 2 μ L /min under 10 min. Når peptider ble konsentrert i pre-kolonne de ble eluert inn i analytisk kolonne (LC kolonne, 3 μ C18-CL, 75um x 25 cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) for å separere. Peptider ble til slutt eluert ved anvendelse av en 5a 40% B-gradient i løpet av 30 minutter, inn i en nanoESI qQTOF massespektrometer (5600 TripleTOF, ABSciex, Framingham, MA, USA). Informasjonen fra MS og MS /MS ble analysert med Paragon algoritmen, Protein Pilot programvare (ABSciex, Framingham, MA, USA). Peptidene ble identifisert ved hjelp av informasjonen i tandem massespektra ved å søke mot Expasy SWISS PROT database.
2,4. Western blotting av ALDH1A3
For in vitro valideringsformål, transfektert PC-3, LNCaP og DU-145 celler med Mir-187 etterligne eller miRNA etterligne negativ kontroll (72 h) ble høstet, vasket med PBS og deretter lysert med iskald lyseringsbuffer (50 mM TrisHCl pH = 8, 150 mM NaCl, 0,02% NaN
3, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40 (NP40), 0,5% deoksykolsyre (DOC), proteaseinhibitor cocktail tabletter (1 x). Cellelysater ble sentrifugert ved 10000 rpm i 10 min ved 4 ° C, supernatanten ble deretter blandet med 5 x SDS-prøvebuffer, kokt i 5 minutter og separert ved 12% SDS . siders geler etter elektroforese ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner ved elektroforetisk overføring membranene ble blokkert i 5% skummet melk i 1 time, skylt og inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer. ALDH1A3 (Novus Biologicals, Littleton , CO, USA; 1: 500 fortynning) og β-aktin (Millipore, Billerica, MA, USA;. 1: 200 000 fortynning) Overskudd antistoff ble deretter fjernet ved vasking av membranen i PBS /0,1% Tween 20, og ble membranene inkubert i 1 time med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff: geit-anti-mus IgG eller esel-anti-kanin-IgG (1: 10000) (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Etter vasker i PBS /0,1% Tween 20, ble immun-påvisning utføres ved hjelp av forsterket kjemiluminescerende (ECL) Western blotting deteksjonssystem (Euroclone, Milano, Italia), i henhold til produsentens instruksjoner.
2,5. miRNA mål reporter analysen
PC-tre Mir-187 etterligne eller negativ kontroll celler ble transfektert med 3’UTR Go Clone Reporter (50 ng) (Bryter Genomics, La Hulpe, Belgia) inneholder 3’UTR sekvens av ALDH1A3 klonet nedstrøms for RenSP luciferase reporter eller tom vektor inneholdende bare den luciferase-rapportør ved hjelp Dharmafect 2-reagens (Dharmacon, GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Cellene ble lysert og reporter aktivitet ble målt 24 timer etter transfeksjon hjelp Lights Luciferase Assay Reagent (Bryter Genomics).
2,6. RNA isolering og QRT-PCR
Isolering av RNA fra begge cellelinjer og kliniske prøver ble utført ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Technologies, CA, USA). Total RNA ble revers transkribert ved bruk av TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit og miRNA-spesifikke stilk-løkke primere (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) og High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) i henhold til produsentens angivelser. Deretter ble 2 ul av dette cDNA, som tilsvarer 96 PCA tumorprøver, ble amplifisert ved sanntids-PCR i et sluttvolum på 10 ul per reaksjon på en ABI 7500-hurtig thermocycler ved hjelp av mRNA-assays (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). For miRNA evaluering, ble 1,33 ul miRcDNA amplifisert i et endelig volum på 20 ul. miRNA analyser for RU44 (001 094), RU48 (001 006) og Mir-187 (001 193), og mRNA-analyse for
ALDH1A3
(Hs00167476_m1) ble benyttet (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). Alle reaksjoner ble utført in triplo. Den relative ekspresjon av mRNA eller miRNA ble bestemt ved anvendelse av middelverdien for kontrollprøvene som kalibrator, og etter 2
-ΔΔCt metoden [11]. For cellelinje evalueringer, ble Mir-187 uttrykk analysert ved QRT-PCR ved hjelp av en universell menneskelig RNA basseng (Cat # 740000 Stratagene, La Jolla, CA) som normalisering kontroll.
2,7. Immunhistokjemi av ALDH1A3
De samme FFPE PCA blokker som brukes for RNA-analyse ble innlemmet i 11 microarray (TMA). To eller tre representative områder (1 mm i diameter) av hver tumor ble valgt for TMA produksjonen ved først å undersøke hematoxylin eosin-farget prostatektomi svulst sklie og prøvetaking vev fra de tilsvarende parafinblokker. En vev microarray instrument (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) ble brukt for TMA montering. Fra TMA blokker, ble 3-mikrometer tykke seksjoner utsatt for immunhistokjemisk farging hjelp kanin anti-human ALDH1A3 polyklonale-Ab (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; 1:50 fortynning). Humant prostatavev ble anvendt som positiv kontroll som anbefalt av produsenten. Prosentandelen av ALDH1A3-positive celler og cytoplasmatisk fargeintensiteten ble bedømt semikvantitativt som danner fire grupper (fra 0 til 3). Tilfeller ble scoret så lavt uttrykkere når fargeintensitet var mellom 0 og 1, og høye uttrykkere når intensiteten var to og oppover.
2,8. ALDH1A3 ELISA
Urinprøver fra 123 pasienter med mistanke om PCa ble sentrifugert ved 1000 x g for å fjerne rusk. Urinen Supernatanten ble brukt for å estimere den ALDH1A3 proteinnivået ved hjelp av en kvantitativ human sandwich-ELISA-sett (Blue Gene Biotech Co Ltd, Shanghai, Kina). Standardreferanse var mellom 0 og 50 ng /ml, med intra og inter-assay CV mindre enn 10%. Den optiske tetthet (O.D.) ble bestemt ved 450 nm ved hjelp av en Victor Multilabel Plate Reader (PerkinElmer Life Sciences, Massachusetts, USA).
2,9. Statistisk analyse
For å studere den prognostiske verdien av
ALDH1A3
genet vi brukte binære variabler som gjenspeiler den positive status for tiltak. Sammenhengen mellom
ALDH1A3
uttrykk og clinicopathological parametre (kategoriske) ble vurdert ved hjelp av Spearman med betydning vurdert på 5%. Virkningen av biologiske faktorer på BPFS og klinisk PFS ble bestemt av Kaplan-Meier proporsjonal risiko log rank test [12]. Biokjemisk progresjon ble definert som serum PSA større enn 0,4 ng /ml under oppfølging og klinisk progresjon ble definert som lokale (prostata fossa), regionale (lymfeknuter) eller fjernt (metastase) progresjon. BPFS og kliniske PFS ble vurdert individuelt fra dato for operasjonen til datoen for arrangementet. Statistisk analyse ble utført med SPSS, versjon 20.0. The Student t test aplying FDR, p-verdi, PCA og hierarkisk clustering ble brukt til prøver av proteomikk studien. Alle resultater er gitt som gjennomsnitt ± SEM (GraphPad Prism 4.0 Programvare, Graph Pad Software, Inc.)
Resultater
3,1. miRNA uttrykket i PCA cellelinjer
Analyse av miRNA nivåer ved QRT-PCR bekreftet redusert uttrykk av MIR-187 i PCA cellelinjer: PC-3, LNCaP, DU-145 og 22RV1 (fig 1A). I PC-3 Mir-187 uttrykk nivået var tilsvarende den som ble observert tidligere i PCA pasienter [8], og av denne grunn denne cellelinjen ble valgt for nærmere analyse.
A) Uttrykk for MIR-187 ble analysert ved QRT-PCR ved hjelp av en universell menneskelig RNA basseng som kalibrator for å normalisere den relative uttrykk for de analyserte mirnas følgende 2
-ΔΔCt metode. Som det vil forstås, alle cellelinjer, men VCap viste nedregulering av MIR-187. B) MIR-187 miRNA etterligne og miRNA etterligne negativ kontroll ble transfektert inn i PC-3, LNCaP og DU-145 celler for 72h. Den gjeninnføring av MIR-187 i PC-3, ble LNCaP og DU-145 bekreftet av real-time PCR. Histogrammet viser økningen i MIR-187 mRNA nivå i MIR-187 miRNA etterligne transfekterte celler sammenlignet med celler transfektert med miRNA etterligne negativ kontroll og ikke-transfekterte celler.
3,2. Identifisering av ALDH1A3 som antatt Mir-187 mål
For å identifisere potensielle mål av MIR-187 en serie av proteomikk analyse og validering eksperimenter ble utført. MIR-187 miRNA etterligne ble gjeninnført i PC-3, LNCaP og DU-145 og viste at Mir-187 uttrykk ble gjenfunnet i PC-3, LNCaP og DU-145 celler (fig 1b). En global proteomikk tilnærming ved hjelp DIGE og LC-MS /MS ble utført med prøver fra PC-3 celler transfektert med en negativ kontroll og PC-tre transfektert med MIR-187 miRNA etterligne. Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon, lysert og separert ved elektroforese todimensjonale. Etter skille proteinekstrakter og fluorescens skanning, ble 9 forskjellig uttrykt flekker oppdaget (Fig 2A). Disse 9 protein flekker (p 0,05) vises minst 1,06 ganger regulering over seks uavhengige forsøk. Syv av disse 9 flekker viste en ned-regulert ekspresjon ved MIR-187 gjeninnføring, som var i overensstemmelse med den forventede inhiberende effekt av miRNA på de fleste av sine mål (S1 Table). Blant disse målene aldehyd dehydrogenase 1A3 (ALDH1A3) ble identifisert (figur 2B).
PC-3 celler ble transfektert med enten miRNA etterligne negativ kontroll eller MIR-187 miRNA etterligne, høstet etter 72h, og proteinlysatene ble merket med Cy3 eller Cy5 (MIR-187 og kontroll) og Cy2 for den interne standarden. A) 2D-DIGE gel bildet innhentet ved pH 3-10 og 12,5% SDS-polyacrilamide. Tallene refererer til identifisering gitt til stedene forskjellig uttrykt. Flekk 655 ble ytterligere identifisert ved LC-MS /MS som ALDH1A3. B) Sammenligning av ekspresjonen av ett av stedene (655 eller ALDH1A3), i de seks gelene ble analysert, mellom cellene transfektert med MIR-187 eller med den negative kontroll. Den gjennomsnittlige ganger endring mellom de to forholdene var -1,06 med en p-verdi på 0,003. ALDH1A3, aldehyd dehydrogenase familie 1 medlem A3
3,3. Validering av
ALDH1A3
som antatt Mir-187 mål
For å vise at
ALDH1A3
er et mål på MIR-187, bioinformatikk target screening; bruker den vanligste miRNA mål prediksjon programvare (Targetscan, Pictar og Miranda) ble utført. Men ingen av disse programmene matchet 3′-UTR regionen
ALDH1A3
med MIR-187 sekvens. Ikke desto mindre omfatter påføring av RNA22 verktøyet, som ikke er avhengig av på tvers av arter bevaring, er motstandsdyktige mot støy og tillater G: U sammenkobling av mål-mRNA til miRNA frø sekvens [13], bekreftet en kamp mellom
ALDH1A3
og Mir-187 frø sekvens (fig 3A).
A) RNA22 spådd mRNA-miRNA heteroduplekser. RNA22 v1.0 programvare spådd tre forskjellige MIR-187 bindingssteder innenfor ALDH1A3 mRNA sekvens. Antatte MIR-187 bindingsseter ble funnet i ALDH1A3 5’UTR region (i), koding region (CDS) (ii og iii) og 3’UTR (iv). Alle av dem oppnå kriteriene for en basepar-verdi på minimum 14 og maksimum folding energi på -25. B) Western blot-analyse viser en reduksjon i ekspresjon av proteinet ALDH1A3 ved gjeninnføring av MIR-187 (MIR-187 miRNA ligne transfekterte celler), noe som bekrefter den hemmende effekten av miRNA gjennom dens antatte mål. Cellene ble transfektert med MIR-187 miRNA etterligne eller negativ kontroll og høstet etter 72 timer. Totale celleekstrakter ble fremstilt og underkastet elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE, etterfulgt av immunblotting med anti-ALDH1A3 antistoff. For å sikre lik protein lasting membranen ble immunoblottet med anti β-actin antistoff. C) Luciferase reporter-målingen ble utført med ildflue luciferase under kontroll av den ALDH1A3 3 «UTR bekrefte inhibering av ALDH1A3 mRNA ekspresjon (20% nedsettelse av luciferase-signal) ved MIR-187 gjeninnføring. Data er presentert i forhold til vektorstyre tildelt en verdi på 100. gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter er vist. D) Overuttrykte ALDH1A3 mRNA ble bekreftet i en kohort av menneskelige prostatakreft (n = 96). Det var en invers korrelasjon (ikke statistisk signifikant) mellom nedregulering av MIR-187 finnes i disse prøvene og oppregulering av ALDH1A3.
For å validere disse funnene, fikk vi bekreftet den sterke ned -regulation av ALDH1A3 på MIR-187 re-introduksjon av western blot analyse i PC-3, LNCaP og DU-145 celler (figur 3B).
for ytterligere å bekrefte rollen som
ALDH1A3
som en MIR-187 målrette en luciferase reporter plasmid som inneholder 3’UTR sekvens av
ALDH1A3
ble klonet inn PC-3 celler transfektert med Mir-187 etterligne. Forbedret uttrykk for MIR-187 (PC-3 Mir-187 etterligne) betydelig redusert reporter aktivitet 3’UTR
ALDH1A3
konstruerer til ca 20% sammenlignet med kontrollgruppen (PC-3 NC etterligne) (Fig 3C) .
QRT-PCR data viste en høyere uttrykk for
ALDH1A3 plakater (1,2 ganger) sammenlignet med prøvene gjen uttrykker Mir-187 (data ikke vist). Videre, sammenlignet vi uttrykket for
ALDH1A3
mRNA-ekspresjon ved nedregulering av MIR-187 i to uavhengige kullene av primære tumorer PCA fra FFPE (n = 96) (figur 3D) og friskt vev (n = 10) (S1 fig). Men ingen sammenheng mellom
ALDH1A3 Hotell og clinicopathological parametre ble funnet, og deretter som forventet,
ALDH1A3
ikke utgjorde en prognostisk indikator for enten BPFS (p = 0,773) eller PFS (p = 0,430 ) i denne serien.
ALDH1A3 protein uttrykk ble videre undersøkt ved immunhistokjemi (IHC) i de 195 sakene som inngår i TMA (fig 4). Vi fant ut at ALDH1A3 var signifikant (p 0,0001) oppregulert i PCA prøver (middels intensitet = 1,42) sammenlignet med normal prostata vev (middels intensitet = 0,12). Videre, for å undersøke hvilken rolle
ALDH1A3
som MIR-187 mål, studerte vi sammenhengen med Mir-187 uttrykk. Interessant, fant vi at Mir-187 uttrykk var signifikant negativt korrelert (p 0,0001) med ALDH1A3 protein uttrykk. Vi studerte videre korrelasjonen av
ALDH1A3
med clinicopathological parametre og prognose. Selv ALDH1A3 uttrykk ikke utgjorde en prognostisk indikator, fant vi en statistisk signifikant direkte sammenheng med Gleason score (p = 0,05). Derfor er 37% av tilfellene med en Gleason ballen 7 viste høy ALDH1A3 intensitet av farging sammenlignet med 56% av PCa med Gleason≥7
Immunohistokjemisk farging for ALDH1A3 er signifikant høyere (p 0,0001). I tumor prøver (til høyre) enn i normale kontroller (venstre). Beising mellom ulike tumor karakterer (Gleason scorer lavere enn 7, lik eller høyere enn 7) sammenlignet med å finne en direkte sammenheng mellom Gleason ballen og ALDH1A3 uttrykket (p = 0,05). Immunhistokjemisk farging er vist for ALDH1A3 (høyre kolonne) i hver prøve sammen med den hematoksylin eosin-farget vev (venstre kolonne).
For å undersøke hvilken rolle videre
ALDH1A3
i den diagnostiske innstillingen vi utført en ELISA-analyse for å måle ALDH1A3 uttrykk i urin (n = 123 ). En univariat logistisk regresjonsmodell ble utført for å evaluere den prediktive evnen til denne biomarkør, sammen med PSA, for tilstedeværelsen av PCa i diagnostiske biopsier. På et signifikansnivå på 10%, Ptil og ALDH1A3 ble begge signifikant assosiert med en positiv biopsi av PCa (fig 5).
ROC-kurver fra PSA og ALDH1A3 for å forutsi PCa i urinprøver. Arealene under kurven er 0,610 (95% KI 0,509 til 0,710; p = 0,036 og 0,591 (95% KI 0,490 til 0,692, p. = 0,083) henholdsvis På et signifikansnivå på 10%, både Ptil og ALDH1A3 var signifikant assosiert med en positiv biopsi av PCa.
Diskusjoner
mirnas er spådd til å kontrollere aktiviteten til ca 60% av alle proteinkodende gener, og har vist seg å delta i reguleringen av flere cellulære prosesser. Ved baseparing til mRNA, microRNAs megle translasjonsforskning undertrykkelse eller mRNA degradering [4]. Har tidligere demonstrert rollen MIR-187 ved PCA progresjon og diagnose [8], bestemte vi oss for ytterligere å undersøke potensielle mål i denne miRNA som kan også være av interesse som biomarkører. for dette formålet vi gjeninnføres MIR-187 forløper i PC-3 celler og utført en proteomikk tilnærming.
Sekvenser anerkjent av miRNA frø finnes i mange gener, noe som gjør det vanskelig å identifisere fysiologisk relevante miRNA-målet relasjoner fra sekvensanalyse alene [14]. Videre har tidligere resultater erholdt ved Yang et al. [6] og Schramedei et al. [15] bekreftet at mindre enn 10% av proteiner identifisert av en proteomikk tilnærming ble spådd av brukte algoritmer som Pictar, Targetscan og Miranda. I tråd med disse funnene, ble ingen av proteiner identifisert av proteomikk screening i denne studien spådd
i silico
av de ovennevnte algoritmer. Likevel bruker RNA22 verktøyet det var mulig å finne en match mellom MIR-187 og vår potensielt mål i
ALDH1A3
koding region (CDS). Denne algoritmen er forskjellig fra tidligere rapporterte metoder i at den ikke bruker en cross-arter sekvenskonservering filter, og dermed gir oppdagelsen av mikroRNA bindingssteder som kanskje ikke er til stede i nært beslektede arter [13]. Videre tar RNA22 hensyn til den hypotese at i tillegg til 3’UTRs, mange bindingsseter sannsynligvis vil eksistere i 5’UTRs og CDS tillater identifikasjon av tidligere ukjente miRNA /mRNA-heteroduplekser.
I denne studien , 9 antatte mål av MIR-187 ble identifisert ved 2D-DIGE og MS-analyse (S1 tabell). Fra disse har vi valgt aldehyd dehydrogenase 1A3 (
ALDH1A3
) for videre evaluering fordi det har blitt beskrevet å være regulert av androgener [16]. Western blot analyse, QRT-PCR og IHC bekreftet direkte regulering av
ALDH1A3
av MIR-187. Først ble invers korrelasjon mellom ALDH1A3 og MIR-187 bekreftet ved å utvinne Mir-187 uttrykk i PC-3, LNCaP og DU-145 celler, noe som førte til en nedregulering av ALDH1A3 protein nivåer. For det andre, den hemmende effekten av MIR-187 på ALDH1A3 ekspresjon ble ytterligere bekreftet ved et luciferase reporter analyse som viste en reduksjon i ALDH1A3 uttrykket (~ 20% reduksjon i luciferase-signal) ved MIR-187 etterligner transfeksjon. Tredje, hemming av
ALDH1A3
ble observert ved analyse av en kohort av PCA menneskelig pasientprøver, både fersk og FFPE- vev. I disse kohorten ble kraftig nedregulering av MIR-187 ledsaget av en økt
ALDH1A3
mRNA uttrykk. Forth, rollen
ALDH1A3
som Mir-187 mål ble bekreftet av IHC analyse. Derfor ALDH1A3 ble funnet å være oppregulert i prostata tumorer og ekspresjon av dette protein er inverst korrelert med ekspresjonen av miRNA. I tillegg potensielle rolle
ALDH1A3
som kandidat prognostisk biomarkør for PCa ble evaluert, men i kohort av prøvene analysert det ikke gi noen ytterligere informasjon. Likevel, foreningen av
ALDH1A3
uttrykk med Gleason score tilsier en økning i
ALDH1A3
uttrykk med svulst iscenesettelse. Vi har tidligere hevdet at tap av MIR-187 under PCa progresjon kan indikere en rolle som tumor suppressor [8]. I tillegg ALDH1A3 ble funnet å samvirke med PSA i prediksjonen av biopsi resultat. Bortsett fra sin tilknytning til tilstedeværelsen av svulst i IHC av FFPE- lysbilder, var vi i stand til å måle ALDH1A3 i urinprøver, å finne en positiv sammenheng med svulst utseende.
