Abstract
Formål
Brain metastase (BM) fra ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er relativt vanlig, men å identifisere hvilke pasienter som vil utvikle hjernemetastaser har vært problematisk. Vi antok at genotypen varianter i TGF-β signalveien kan være en prediktiv biomarkør av hjernemetastaser.
Pasienter og metoder
Vi genotypede 33 SNPs fra 13 gener i TGF-β signalveien og evaluert sine assosiasjoner med hjernemetastaser risikoen ved hjelp av DNA fra blodprøver fra 161 pasienter med NSCLC. Kaplan-Meier-analysen ble brukt til å vurdere risiko hjernemetastaser; Cox fare analyser ble brukt for å evaluere effekten av ulike pasient- og sykdomskarakteristikk på risikoen for hjernemetastaser.
Resultater
Median alder for de 116 menn og 45 kvinner i studien var 58 år; 62 (39%) hadde stadium IIIB eller IV sykdom. Innen 24 måneder etter første diagnose av lungekreft, ble hjernemetastaser funnet i 60 pasienter (37%). Av disse 60 pasienter, 16 hadde presentert med BM ved diagnose. Multivariat analyse viste GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 å være forbundet med en betydelig høyere risiko for hjernemetastaser ved 24 måneders oppfølging (hazard ratio [ ,,,0],HR] 2,540, 95% konfidensintervall [CI] 1,204 til 5,359,
P
= 0,014, og HR 1,885, 95% KI 1,086 til 3,273,
P
= 0,024), sammenlignet med GA eller CT /CC genotyper, henholdsvis. Når vi analyserte kombinert undergrupper, disse prisene viste høyere for de som har både GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 (HR 2,353, 95% KI 1.390- 3,985,
P
= 0,001)
Konklusjoner
Vi fant GG genotype av
SMAD6
. rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 å være forbundet med risiko for hjernemetastaser hos pasienter med NSCLC. Dette funnet, hvis bekreftet, kan bidra til å identifisere pasienter med høy risiko for hjernemetastaser
Citation. Li Q, Wu H, Chen B, Hu G, Huang L, Qin K, et al. (2012) SNPs i TGF-β signalveien er assosiert med økt risiko for hjernemetastaser hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (12): e51713. doi: 10,1371 /journal.pone.0051713
Redaktør: Todd W. Miller, Dartmouth, USA
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: 17.12.2012
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation (tilskudd 81071832), et viktig prosjekt av Hubei Provincial Health Office stipend (JX5A01), og en Wuhan Planning Project of Science and Technology stipend (201161038339-07). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Flere 150.000 pasienter med kreft er diagnostisert med hjernemetastaser hvert år [1], med lungene er den vanligste primære stedet for sekundær BM [2], [3]. Bedre RT teknikker og økt bruk av kombinert-modalitet terapi har redusert fjernmetastaser og betydelig forbedret overlevelse. Det har imidlertid vist seg å være assosiert med økt forekomst av total hjerne svikt [4]. Utfallet av diagnosen hjernemetastaser er dystert. Selv for unge pasienter med god allmenntilstand og kontrollert ekstra hjernesykdom, er median overlevelse for pasienter etter utviklingen av BM bare ca 7 måneder [5]. Midler for å hindre utviklingen av BM derfor snarest søkt. For eksempel profylaktisk kranial bestråling (PCI) har en klart definert rolle i behandlingen av høyrisikopasienter med akutt lymfatisk leukemi og pasienter med småcellet lungekreft (SCLC) [6]. Dette er radiosensitive svulster der moderate doser av stråling kan benyttes, og føre til betydelige forbedringer i hjernekontroll i tillegg til total overlevelse, og derfor PCI anses standard vare. Kanskje pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) også. Tidligere randomiserte, kontrollerte studier og flere prospektive studier uten hjerne primære endepunktene og retrospektive studier som evaluerte PCI for NSCLC har konsekvent vist en nedgang og /eller forsinkelse i BM med PCI [4], [7], [8], [9]. Men PCI har ikke blitt en del av standard styring for LA-NSCLC på grunn av bekymring for langsiktig giftighet og mangel på en velprøvd overlevelsesgevinst. Det er uklart om dette er sekundært til svikt i å identifisere kohorten best egnet for forebygging. Forfatterne av denne artikkelen hypotese at blant NSCLC pasienter i stadium I-IV kan eksistere en gruppe pasienter med høy risiko for å presentere BM. Denne gruppen bør identifiseres for å tjene som mål for fremtidige studier av PCI-programmet i NSCLC og unngå bivirkninger for de som lav risiko for å presentere BM.
Definere kohort av høyrisikopasienter er vanskelig, fordi det er avhengig av rapporter som ofte har motstridende resultater. Forbehandling faktorer som forutsier for høye priser av BM inkluderer histologi, omfanget av sykdom, og ung alder. Men ikke alle studier har vist en signifikant korrelasjon [10], [11], [12]. Uttrykket nivåer av tre gener,
CDH2 product: (N-cadherin),
KIFC1
, og
FALZ
, ble funnet i en studie for å være svært forutsigbare for BM tidlig og avansert lungekreft [13]. Uttrykket nivåer av gener kan være effekten av andre faktorer, og ikke så presis som alvorlig begrenser denne tilnærmingen for risiko prediksjon. Sjelden studere adressering spørsmålet om sammenhengen mellom polymorfismer og hjernesvikt. Videre er heterogeniteten og genetiske kompleksitet av NSCLC gjør det usannsynlig at noen enkelt SNP ville være tilstrekkelig til å gi risiko for BM. Snarere studere flere SNP’er i signalveier som regulerer celleproliferering og migrering kan være en mer effektiv måte til å identifisere områder genene og polymorfismer som er involvert i givende risiko for BM. En slik reaksjonsvei er at av transformerende vekstfaktor-β (TGF-β).
TGF-β omfatter superfamilien TGF-B, benmorfogene proteiner, aktiviner og relaterte proteiner. TGF-β signalbaner som har forskjellige effekter på celleproliferasjon, morfogenese, migrasjon, ekstracellulær matriksproduksjon, og apoptose. Spesielt undertrykker TGF-β tidlig stadium tumorutvikling på grunn av dens potente veksthemmende virkning, men blir en pro-onkogen faktor som stimulerer tumorcellevekst og invasivitet ved senere stadier av tumorigenesis [14], [15]. Tumorceller kan unnslippe antiproliferative effekter av TGF-β ved erverv av mutasjoner i deler av signalveier eller ved selektivt å forstyrre TGF-β signalering. Den epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er assosiert med mobilnettet oppkjøp av motilitet og invasive egenskaper som fremmer dannelsen av fjernmetastaser [16]. En rekke andre mekanismer, herunder endringer i ekspresjon av celle-celle adhesjon molekyler og sekresjon av metalloproteinaser, bidrar også til den metastatiske prosess [17].
Gitt fremtredende rolle av TGF-β reaksjonsvei for å opprettholde cellulær funksjonen og virkningen av sin avbrudd på fjern metastase, kan felles genetiske variasjoner i denne reaksjonsveien fremstå som potensielle prediktor for BM risiko. I denne studien, testet vi hypotesen om at vanlige genetiske varianter i TGF-β veien er forbundet med BM risiko, og vi forsøkt å identifisere undergrupper av pasienter med NSCLC som er spesielt høy risiko for å utvikle BM.
pasienter og metoder
pasient
pasientene i denne studien ble valgt ut fra totalt 201 pasienter med lungekreft som hadde vært behandlet på enten Tongji Hospital Cancer Center eller Hubei Provincial Tumor Hospital i 2008-2009 som også hadde blodprøver tilgjengelig for analyse. Alle deltakerne i studien gitt skriftlig informert samtykke før blodprøver ble innsamlet. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Tongji Medical College. Av disse 201 pasienter, 190 hadde dokumentasjon har gjennomgått komplett sykdom iscenesettelse, og 161 hadde patologisk bekreftet NSCLC. Disse 161 pasienter var grunnlaget for denne analysen. Kliniske data ble hentet fra pasientenes filer. Sykdommen hadde blitt iscenesatt i form av svulst /node /metastaser system i den sjette (2002) utgaven av det amerikanske Joint Committee on Cancer staging manualen. Diagnosen BM var basert på computertomografi eller magnetisk resonans imaging poster. Den røykestatus inkluderer strøm, tidligere, eller aldri røyker. Tidligere røykere ble definert som personer som hadde hell sluttet å røyke i minst ett år på tidspunktet for undersøkelsen registrering. Aldri røykerne ble definert som personer som hadde totalt 20 sigaretter i løpet av livet [18]. Tiden til BM var intervallet fra datoen for NSCLC diagnose til datoen for BM diagnose. Oppfølgingstiden var intervallet fra NSCLC diagnose til død eller til den siste sykehusbesøk.
genotyping Metoder
De prosedyrer som brukes for å velge SNPs i TGF-β veien har blitt beskrevet tidligere [19]. Kort fortalt har vi brukt databaser på Gene Oncology (https://www.geneontology.org) og Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI) s Gene database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) og beslektede litteratur for å identifisere alle funksjonelle enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) av genene i TGF-β signalveier med en mindre allel frekvens på mer enn 0,05 i et kinesisk befolkning. Vi valgte 33 SNP’er i 13 gener relatert til TGF-β veier som enten ble plassert i promotor utranslaterte region eller kodende region av genet eller hadde tidligere blitt rapportert å være assosiert med overlevelse, lungekreft, eller generell metastaser (tabell 1). Genomisk DNA ble isolert fra perifere blod-lymfocytter ved hjelp av QuickGene DNA helblod sett S (Fuji Film) og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Trettito av SNPs ble genotypet ved hjelp av MALDI-TOF massespektrofotometri å oppdage allel-spesifikk primerforlengelsesprodukter med MassARRAY plattform (Sequenom, Inc.). Analysedata ble analysert ved hjelp av Sequenom Typer programvare (versjon 4.0). Den enkelte anropsfrekvens terskel var minst 95%. Den 33
rd SNP (
TGFB1:
rs1800470) ble genotypet ved hjelp av TaqMan analysen [20]
Statistical Analysis
Denne analysen ble foretatt. etter at alle pasientene var blitt potensielt observert i minst 24 måneder. Pasientene ble gruppert etter genotype. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av SPSS (versjon 16.0) programvare. Cox-modellen ble brukt til å beregne hazard ratio (HR) og 95% konfidensintervall (CIS) for multivariate overlevelsesanalyser, mens justert for kjønn, alder, sykdom scenen, tumorhistologi, Karnofsky funksjonstilstand (KPS), og røykestatus. Kaplan-Meier plott og logge rang tester ble brukt for å estimere effekten av genotype på BM risiko. Likelihood ratio tester ble brukt for hver multivariat Cox regresjon for å vurdere godhet-of-fit. En
P
verdien av ≤0.05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans i tosidig
t
tester.
Resultater
Pasient Kjennetegn
Kjennetegn på de 161 pasienter (116 menn og 45 kvinner) er vist i tabell 2. median alder var 58 år (range, 32 til 80 år); 61% hadde stadium ≤IIIA sykdom; 60% hadde adenokarsinom, og 54% hadde røykt tobakk (71,6% hos mannlige og 8,9% i kvinnelig).
hjernemetastaser og genotyper
Median tid fra NSCLC diagnose til deteksjon av BM var 7,5 måneder (range, 0 til 23 måneder). Median tid var 10 måneder når pasienter som hadde hatt BM ble ekskludert. Sammenhenger mellom pasient- og kreftrelaterte egenskaper og BM ved univariate og multivariate analysene er vist i tabell 2. Som ventet ble sykdom scenen forbundet med BM, med pasienter med stadium IIIB eller stadium IV sykdom har høyere risiko for BM (
P
0,010). Og pasienter med adenokarsinom var assosiert med høyere risiko for BM av Cox fareanalyser (
P
= 0,032). Imidlertid har røykestatus ingen sammenheng med BM risiko i denne populasjonen.
Figur 1 viser kumulative BM-frie overlevelse for alle pasienter i henhold til genotype. Disse prisene holdt seg lavere for de med enten GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 (
P
= 0,024, figur 1A) eller TT genotypen av
INHBC
: rs4760259 (
P
= 0,045, figur 1B). Når vi analyserer kombinert undergrupper, disse prisene viste lavere for de som har både GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 (
P
= 0,003, figur 1C). Andre 31 SNPs i TGF-β sti i tabell 1 ble også analysert, men ingen signifikant korrelasjon ble funnet (
P
= 0,877, figur 1D for
TGFB1
: rs4803455; ankomst annen 30 utvalgte SNPs ikke vist).
Pasientene ble fordelt etter genotyper. (A)
SMAD6
: rs12913975; (B)
INHBC
: rs4760259; (C) i kombinasjon; (D)
TGFB1
: rs4803455. GG genotype for rs12913975 og TT genotype for rs4760259 var assosiert med signifikant lavere kumulative hjernemetastaser overlevelse sammenlignet med de andre genotypene.
Tabell 3 og 4 lister resultatene av Kaplan-Meier analyser av BM forekomsten i henhold til genotype på 24 måneder fra diagnose. Generelt BM utviklet oftere hos pasienter med GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 (43%) eller TT genotypen av
INHBC
: rs4760259 (44%) sammenlignet med GA ( 21%) eller CT /CC genotyper (27%). Disse assosiasjoner mellom genotype og BM var statistisk signifikant for begge undergrupper. Når vi analyserer kombinert undergrupper, kan vi se å ha både GG (rs12913975) og TT (rs4760259) viser en høyere sannsynlighet for BM (52% vs. 28%,
P
= 0,003, Tabell 4). Multivariat Cox proporsjonal hazard analyser viste GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 å være forbundet med en betydelig høyere risiko for hjernemetastaser (HR 2,540, 95% KI 1,204 til 5,359,
P
= 0,014, og HR 1,885, 95% KI 1,086 til 3,273,
P
= 0,024, henholdsvis), etter justering for scene, histologi, alder og røykestatus . Når analysere kombinert undergrupper, disse prisene viste høyere for de som har både GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 (HR 2,353, 95% KI 1,390 til 3,985
P
= 0,001). Videre, når vi gjentatt analyse med unntak av de pasientene som hadde presentert med BM ved diagnostisering av NSCLC, forble sammenhengen mellom BM og begge genotyper signifikant (Tabell 3 og 4). Lignende analyser av de andre 31 utvalgte SNPs viste ingen sammenheng mellom hvilken som helst annen genotype og forekomsten av BM (tabell 5 og 6).
Diskusjoner
i denne studien har vi undersøkt systematisk assosiasjoner mellom et omfattende panel av genetiske varianter i TGF-β signalveien gener og BM risiko. Vi fant ut at SNPs i
SMAD6
: rs12913975 GG eller
INHBC
: rs4760259 TT var assosiert med forekomsten av BM. Så langt vi kjenner til, er dette den første bevis som viser denne foreningen i pasienter med lungekreft. Med validering, kan denne testen brukes som en prediktiv biomarkør for å identifisere pasienter med høy risiko for å utvikle hjernemetastaser i løpet av de første 24 år etter diagnose.
En av de polymorfismer vi har funnet å være assosiert med BM risiko var i
SMAD6
, som koder for et protein som lokaliserer til begge kjerner og cytoplasma. Smad6 og Smad7 fungere som «hemmende» Smads, hemmer TGF-β familie signale [21]. Induksjon av Smad6 og Smad7 ekspresjon ved benmorfogent protein og TGF-β signale representerer en auto-hemmende feedback mekanisme i TGF-β veien [21].
SMAD6
er uttrykt i de fleste menneskelige vev, inkludert lungene, men dens funksjon i tumorigenesis er ennå ikke etablert. En tidligere retrospektiv studie viste at
SMAD7
overekspresjon er forbundet med en redusert forekomst av skjelettmetastaser fra melanom og brystkreft [22]. Den strukturelle likhet mellom SMAD6 og SMAD7 proteiner antyder at begge proteiner kan være involvert i metastaser via tilsvarende mekanismer. Varianter i
SMAD6
har vært knyttet til prognosen i eggstokkreft [23], brystkreft og bukspyttkjertelkreft; polymorfisme i
SMAD6
har også vært knyttet til overlevelse i NSCLC [24]. Metastaser, særlig hjernemetastaser, er en viktig faktor assosiert med dårlig prognose, og SNPs i
SMAD6
kan bidra til metastaser, inkludere CNS-metastaser.
Vi har også funnet
INHBC
: rs4760259 polymorfismer å bli assosiert med BM risiko.
INHBC
genet ligger på menneskelig kromosom 12, region q13.1, og koder for et protein som heter βC, som tilhører inhibin gruppen. Inhibin og aktivin proteiner, sammen med ulike vekst og differensieringsfaktorer, Muellerian inhiberende substans, og andre proteiner, hører til TGF-β superfamilien. Aktiviner ha mange effekter på mesoderm formasjon [25], celleproliferasjon og apoptose [26], forgrening morphogenesis [27], betennelse [28] og reproduksjon [29]. En α-subenhet og p-subenheten fire isoformer (βA, βB, βCand βE) er blitt funnet i pattedyr og mennesker [30]. Den activin α, βA, og βB underenheter og deres homo- /heterodimerer har blitt godt preget; aktivin A (βAβA), for eksempel, er en pleiotropisk protein som påvirker apoptose, cellesykluskontroll, angiogenese og immunsuppresjon [31]. Den nøyaktige rollen til βC subenheten, er imidlertid uklart. Activin βC subenhet mRNA påvist i rotter og mus lunge, bitestikkel, testis, livmor, milt, bakre hypofysen og binyrene, og i menneskelig eggstokk, testis, morkake, og prostata [31]. Den activin βC subenheten eller dets dimer kan motsette seg handlingen av activin A. I en in vitro studie, den activin βC subenheten hadde en pro-apoptotisk effekt i levercellelinjer. Videre ble activin βC subenheten nedregulert i prostata og lever tumorcellelinjer [32]. Transfeksjon av activin βC subenheten inn i PC3 prostata kreft cellelinje resulterer i redusert activin A nivåer [33]. En fersk studie viste polymorfismer i
INHBC
er forbundet med risiko for kreft i eggstokkene [34]. En annen studie viste det å være sterkt assosiert med overlevelse i NSCLC [24]. Det kan sees at activin βC subenhet er førsteamanuensis med tumorigenesis og fremgang, og metastaser er et viktig skritt i tumorprogresjon som sterkt assosiert med dårlig prognose, derfor kan vi tro SNPs i
INHBC
kan contribut til BM.
en enkelt SNP gir ofte en beskjeden eller ikke målbare effekt, mens de forsterkede effekter av kombinert SNPs i samme bane kan forbedre prediktiv kraft. Vi analyserte sammenhengen med BM hos pasienter med begge to genotyper. En klar og betydelig trend var tydelig for høyere risiko med den kombinerte undergrupper. Disse resultatene tyder på en kumulativ påvirkning av flere genetiske varianter innenfor TGF-β signalveien var i stand til å ytterligere forbedre prediktiv kraft.
Men ingen av de SNP vi identifisert som å være knyttet til BM er lokalisert i den kodende regionen som tyder på at disse SNPs ikke kan påvirke
SMAD6
eller
INHBC
funksjonen direkte, men heller kan forandre nivåer av genekspresjon gjennom å være lokalisert i regulatoriske regioner eller gjennom kobling til andre SNPs som påvirker genaktivitet . Videre in vitro og in vivo funksjonelle studier er nødvendig for å bekrefte den funksjonelle betydningen av de identifiserte
SMAD6 Hotell og
INHBC
SNPs.
Videre fant vi at 48% av pasientene med både høy risiko lene har hjernemetastaser (tabell 4), og 1,7% (1/60) av pasientene med hjernemetastaser ikke bære noen av de to høyrisiko genotyper. Som heterogen og genetiske kompleksitet NSCLC, spekulere vi at noen andre faktorer og SNP’er på andre signalveier som regulerer celleproliferering og migrering kan også forbundet med fare for BM. Fremtidig forskning er nødvendig for å ytterligere forbedre prediktiv kraft.
PCI regnes som en del av standard behandling for begrenset-scenen SCLC, som opptil 80% av disse pasientene utvikler BM [35], [36]. Slotman et al. gjennomført en studie av 286 pasienter med omfattende-scenen SCLC som ble randomisert til enten PCI eller ingen PCI. Overlevelse ved 1 år forbedret 13,3 til 27,1% [6]. På denne tiden, til nesten alle pasienter med SCLC bør tilbys PCI redusere sjansen for BM og bedre total overlevelse. For tiden er intensiteten av profylaktisk terapi for akutt lymfatisk leukemi justert til risikoen for sentralnervesystemet (CNS) tilbakefall [37]. Tidligere randomiserte, kontrollerte studier [7], [8], [9] og flere prospektive studier som evaluerte PCI for NSCLC har blitt publisert. Studier har betydelig viser at PCI gis til pasienter forbedrer intrakraniell sykdomskontroll. Imidlertid har ingen av disse studiene har stadig vist en overlevelsesfordel med anvendelse av PCI. Den siste RTOG studie (0214) vurdere rollen til PCI i LA-NSCLC dessverre stengt tidlig på grunn av dårlig opptjening. Mens det var en lovende resultat i redusert intrakraniale metastaser i behandlingsgruppen, er dette ikke klarte å resultere i en overlevelsesfordel [4]. Joseph A et al. analyserer det er uklart om denne er sekundært til svikt for identifisering av kullet best egnet for forebygging, den manglende evne av stråling for å bevirke tilstrekkelig intrakraniell sykdomsforebygging på grunn av en forholdsvis radio-resistent tumor, eller behovet for mer effektive systemiske behandlinger for å kontrollere ekstrakraniell sykdom, slik at pasientenes overlevelse er lang nok til å se nytten av PCI [1]. Fordi det ikke er noen logisk test for å identifisere pasienter med høy risiko for hjernemetastatisk har PCI blitt gitt unselectively for alle pasienter. PCI kan negativt påvirke nevrokognitiv funksjon og livskvalitet hos pasienter som ikke trenger PCI [4]. Dersom funnene fra studien er validert i en studie med tilstrekkelig statistisk styrke prospektivt, kunne vi bruke SNPs identifisert i denne studien som en forbehandling test for å velge pasienter som vil ha nytte av PCI, og samtidig unngå PCI hos pasienter som ikke trenger det.
Vår studie hadde noen begrensninger. Den lite antall pasienter øker muligheten for at noen av våre funn var skyldes tilfeldigheter. Fremtidige studier er nødvendig for identitets funksjonelle betydningen av genetiske varianter vi har identifisert, samt å bekrefte eller eksternt evaluere foreninger i uavhengige populasjoner.
Konklusjoner
Vi fant at GG genotype av
SMAD6
: rs12913975 og TT genotype av
INHBC
: rs4760259 var assosiert med forekomsten av BM hos pasienter med NSCLC. Disse funn ble bekreftet i begge Kaplan-Meier og multivariat Cox proporsjonal fare analyser, den sistnevnte justert for sykdomsstadiet, tumorhistologi, alder, og røyking status for pasienten. Disse funnene kan være nyttig i det videre arbeidet for å identifisere pasienter med høy risiko for hjernemetastaser.
