Abstract
Mål
tetramerisk α
2-makroglobulin (α
2M), en plasma panproteinase hemmer, aktiveres ved interaksjon med en proteinase, og gjennomgår en større konformasjonsendring utsette en reseptor-gjenkjenningssete i hver av sine subenheter. Aktivert α
2 M (α
2 M *) binder seg til kreftcelleoverflaten GRP78 og utløser proliferativ og antiapoptotic signalering. Vi har studert hvilken rolle α
2 M * i reguleringen av mTORC1 og TORC2 signalering i veksten av menneskelige prostata kreft celler.
Metoder
Ansette immunoutfellingsstudier teknikker og Western blotting i tillegg som kinase analyser, aktivering av mTORC1 og mTORC2 komplekser, så vel som nedover strømmen mål ble undersøkt. RNAi ble også benyttet til taushet uttrykk for Raptor, Rictor, eller GRP78 i parallelle studier.
Resultater
Stimulering av celler med α
2 M * fremmer fosforylering av mTOR, TSC2, S6- kinase, 4EBP, Akt
T308, og Akt
S473 i en konsentrasjon og tidsavhengig måte. Rheb, Raptor, og Rictor også økt. α
2 M * behandling av celler forhøyede mTORC1 kinase aktivitet som bestemmes av kinase analyser av mTOR eller Raptor immunpresipitatene. mTORC1 aktivitet var følsom for LY294002 og rapamycin eller transfeksjon av celler med GRP78 dsRNA. Nedregulering av Raptor uttrykk ved RNAi betydelig redusert α
2 M * indusert S6-kinasefosforylasjon på T389 og kinase aktivitet i Raptor immunutfelninger. α
2 M * behandlede celler demonstrere om en dobling mTORC2 kinase aktivitet som bestemmes av kinase analyse av Akt
S473 fosforylering og nivåer av p-Akt
S473 i mTOR og Rictor immunpresipitatene. mTORC2 aktivitet var følsom overfor LY294002 og transfeksjon av celler med GRP78 dsRNA, men ufølsom for rapamycin. Nedregulering av Rictor uttrykk ved RNAi reduserer α
2 M * indusert fosforylering av Akt
S473 fosforylering i Rictor immunutfelninger.
Konklusjon
Binding av α
2 M * til prostatakreft celleoverflaten GRP78 oppregulerer mTORC1 og mTORC2 aktivisering og fremmer proteinsyntesen i prostatakreftceller
Citation. Misra Storbritannia, Pizzo SV (2012) Receptor-Anerkjent α
2-makroglobulin Binder to Cell Surface-Associated GRP78 og aktiverer mTORC1 og mTORC2 signale i prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (12): e51735. doi: 10,1371 /journal.pone.0051735
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 19 juni 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: 14.12.2012
Copyright: © 2012 Misra, Pizzo. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
evnen til kreftceller til å trives
in vivo
avhenger av mange faktorer, blant disse er repertoaret av proteiner moduler deres miljø. Mens leveren produserer store mengder av proteinaseinhibitor α
2-makroglobulin (α
2M) det er produsert av cancerceller og er forbundet med tumorvekst [1]. α
2M blir også produsert lokalt i tumor stromale vev, slik som i forbindelse med prostatakreft [2]. Det er en pan-proteinase-inhibitor som reagerer med tumor-avledede matriksmetalloproteinaser og prostataspesifikt antigen (PSA). Mens PSA er mest nært identifisert med prostatakreft, er det også produsert av andre tumorer inkludert bryst [3]. Når proteinaser angripe «agn region» i hver av de fire α
2M-underenheter, tiol- estere briste og proteinet undergår en meget stor konformasjonsendring eksponere reseptor-gjenkjenningsseter i hver subenhet [4]. I tillegg til proteinases, eksponering av α
2M til små primære aminer eller ammoniakk, ved direkte angrep på tiol estere, induserer også en stor konformasjonsendring utsette disse reseptor gjenkjenningsseter [4]. Disse aktiverte former betegnes α
2 M *. Selv om GRP78 (glukose regulerte protein med Mr ~78000) er først og fremst kjent som en person bosatt endoplasmatiske retikulum anstand, vises det på celleoverflaten av mange typer av maligne celler [5] – [10]. Binding av α
2 M * til tumorcelleoverflaten GRP78 fører sin autofosforylerings [11], [12] aktivering ned strømmen pro-proliferativ og anti-apoptotisk signalering kaskader inkludert RAS /MAPK og PI 3-kinase /Akt [5] – [10]. Det har derfor blitt foreslått at oppregulering av celleoverflate GRP78 er en del av aggressiv fenotype i forskjellige krefttyper, inkludert prostata og melanom [8]. I overensstemmelse med denne hypotesen, autoantistoffer mot NH
2-terminale domene av GPR78 vises i sera av prostatakreft og melanomapasienter hvor de er en biomarkør av aggressiv adferd [13], [14]. Disse antistoffene er agonister som binder til den samme region av GRP78 hvor α
2M * bindes [15]. I motsetning til dette, monoklonale antistoffer rettet mot den karboksyl-terminale domene av GRP78 er antagonister av α
2M * og anti-GRP78-NH
2-terminale domene antistoffer i cellekultur og mus [10], [12], [16] – [20]. Basert på disse og andre observasjoner, hypoteser vi at aktiverte α
2M fungerer som en vekstfaktor og celleoverflaten-forbundet GRP78 som en vekstfaktor-like receptor [5] -. [10]
Panel A . α
2 M * konsentrasjonsavhengig proteinsyntesen. Panel B. Modulering av α
2M * -indusert-proteinsyntese i en-LN-celler. Stolpene er: (1) buffer; (2) α
2 M * (50 pM); (3) Wortmannin 30 nM /20 min da α
2 M * (50 pM); (4) LY294002 (20 uM /20 min) og deretter α
2M *; (5) Rapamycin (100 nM /20 min), deretter α
2 M *; (6) Actinomycin D (5 ug /ml /15 min) og deretter α
2M *. Verdiene i panel A og B er gjennomsnitt ± SE fra fire uavhengige forsøk. Verdier vesentlig forskjellige på 5% nivå for α
2M * behandlede celler merket med en stjerne (*).
Akt er en Ser /Thr kinase uttrykt som isoformer, akt1, akt2, og akt3, kodet for av tre forskjellige gener [21]. Disse isoformene er nesten identisk i aminosyresekvens; men deres relative uttrykk er forskjellig i forskjellige pattedyr vev [21]. Akt er den viktigste nedstrøms effektor i PI 3-kinase pathway og den regulerer celleoverlevelse, proliferasjon og metabolisme. PI 3-kinase fosforylerer PIP2 å generere PIP3 som binder til Akt dermed fremme dens translokasjon til plasmamembranen hvor det er fosforylert ved Thr308 i det katalytiske domene av PDK1 og Ser473 i det hydrofobe motivet domene av mTORC2 [21] – [24]. Fosforylering ved begge disse posisjonene er nødvendig for full aktivering av akt1. Akt1 er også fosforylert co-translocationally på Thr450 i «snu» motiv av mTORC2 [25] – [27]. Turn motiv fosforylering av Akt er avgjørende for nylig syntetisert Akt å anta sin rette folding og stabilitet. Mutasjoner av RAS som aktiverer Akt, forekommer i ~ 30% av epiteltumorer og Akt genamplifisering også forekommer i en undergruppe av kreft hos mennesker. I tillegg, er tilstrekkelig til å hemme utviklingen av svulster i PTEN +/- mus [28], [29] partiell ablasjon av Akt. I kliniske prøver av prostatakreft overekspresjon og aktivering av akt1 er forbundet med høye preoperative PSA nivåer, høyere Gleason karakterer, og kortere sykdom tilbakefall ganger [29] – [32]. Immunhistokjemiske studier viser en sterkt forbedret farging av p-Akt
S473 i dårlig differensiert prostatakreft [29], [32].
I panel A er vist virkningen av tiden for inkubasjon av celler med α
2M * (50 pM) og Panel B er vist effekten av varierende konsentrasjoner av α
2 M * i 25 minutter på uttrykk: p-mTOR
T2481 (O); Raptor (▵); Rictor (▴); GβL (□); p-TSC (•); og rheb (▪) som bestemmes av Western blotting. En representant immunoblot fra tre til fem eksperimenter er vist for hvert protein i panel A og panel B. ekspresjon av disse proteinene er vist i vilkårlige enheter, og fluorescens er uttrykt som gjennomsnitt ± SE fra tre til fem uavhengige eksperimenter. Protein lasting kontroller, enten ufosforylerte target proteiner eller aktin, ble utført for både Panel A og panel B er vist nedenfor de respektive immunoblotter.
mammalian target of rapamycin (mTOR), en evolusjonært konservert Ser /Thr kinase, er en viktig regulator av Akt-fosforylering (se vurderinger [33] – [37], og referanser deri). Det er økende interesse for målretting mTOR i behandlingen av kreftformer slik som prostata [28], [33], [34], [36], [37]. Dette målet kan være komplisert ved det faktum at mTOR er til stede i to fysisk og funksjonelt distinkte proteinkomplekser betegnet som mTORC1 og mTORC2, henholdsvis (se vurderinger 33-37, og referanser deri). Disse to kompleksene varierer i deres regulering, nedstrøms mål, og følsomhet overfor inhibitoren rapamycin. mTORC1 er en homodimer inneholder mTOR Raptor, og GβL; det er følsomt for rapamycin. Aktivert mTORC1 fremmer cellevekst delvis ved direkte fosforylering de translasjonelle regulatorer S6-kinase og eIF4E bindende protein (4EBP) (35). Akt-indusert fosforylering av PRAS40 og Deptor fører deres dissosiasjon fra Raptor og fremmer rekruttering av nedstrøms underlag S6-Kinase1 og 2, 4EBP1, og 4EBP2 (se vurderinger [33] – [37] og referanser deri). Binding av rheb • GTP til mTORC1 resultater i mTORC1 aktivisering, mens binding til rheb • BNP i sin hemming. Fosforylering av TSC2 av akt1 hemmer sin GTPase aktivitet fører til økt GTP lasting på rheb og påfølgende økning i mTORC1 aktivitet (se vurderinger [33] – [37] og referanser deri). S6-kinase regulerer mTORC1 gjennom en negativ feedback signalveien som fosforylerer IRS og hemmer PI 3-kinase og Akt aktivering. Den mTORC2 kompleks, i tillegg til mTOR, inneholder Rictor, GβL, Deptor, Protor, og mSIN1 og er ufølsom for akutt rapamycin inhibering (se [33] – [37] og referanser deri). Imidlertid langvarig mTORC2 eksponering for rapamycin inhiberer mTORC2 i visse celletyper [24], [33] – [35]. Protor binder seg tett til Rictor, men er ikke nødvendig for mTORC2 aktivitet [33] – [35]. Både mTORC1 og mTORC2 aktiveres av vekstfaktorer inkludert insulin og insulinlignende vekstfaktor [33] – [35]. Imidlertid er de mekanismer som vekstfaktorer aktiverer mTORC2 ikke klart forstått [33] – [37]. mTORC2 forbinder med ribosomer og dette kan tjene som et oppstrømsreguleringsmekanisme [38], [39]. Insulin stimulering av normale celler og kreftceller fremmer mTORC2 binding til ribosomer og PI 3-kinase signalering [38], [39]. GβL binder mTORC1 og mTORC2 nær kinase domene og er nødvendig for mTORC2 integritet. Deptor også binder seg til både mTORC1 og mTORC2 nær kinase domene og negativt regulerer både mTORC1 og mTORC2 aktivitet [33] -. [37]
I våre tidligere studier viste vi at α
2 M * NH
2 binding til celleoverflaten-forbundet GRP78 i prostatakreftceller utløser spredning og anti-apoptotisk signalering. Forbehandling av celler med inhibitorer av disse signalveier, forbehandling med antistoffer mot den karboksy-terminale domene av GRP78, eller transfeksjon av celler med dsGRP78 RNA, inhiberer dypt disse signalveier [10], [12], [16] – [20] . Stimulering av prostata kreft celler med α
2 M * induserer også syntese av GRP78 som delvis er mediert av transkripsjonsfaktoren TFII-jeg siden celle transfeksjon med dsTFII-I RNA betydelig undertrykker GRP78 oppregulering [40]. Denne behandlingen hemmer også celleoverflaten translokasjon av TFII-I, fremmet kalsium oppføring, og apoptotisk signalering [40]. Stimulering av prostatacancerceller med α
2M * fører også til transkripsjonelle og translasjonelle oppregulering av PSA-syntese [10], som skilles ut og komplekser med α
2M. Behandling av celler med α
2M-PSA kompleks fremmer DNA og proteinsyntese og oppregulerer RAS /MAPK og PI 3-kinase /Akt signalveier som ligner på de som ble observert i α
2 M-NH
2 stimulerte celler [10 ]. Som α
2M-NH
2, α
2M-PSA, fører til en økt uttrykk av p-S6-kinase, p-Akt
T308 og p-Akt
S473, effektor signale komponenter aktivert mTORC1 og mTORC2 [10]. På bakgrunn av den viktige rollen av mTOR signalering i tumorvekst og metastase, og våre observasjoner på α
2M * -indusert prostatakreftceller vekst, celleproliferasjon og oppregulering av PI 3-kinase /Akt signale [6], [7 ], [9], [10], [12], [16], [17], [18], vi har vurdert rollen mTORC1 og mTORC2 signalveier i prostata kreft celler stimulert med α
2 M *. For å vurdere spesifisiteten av celleoverflate GRP78 i α
2M * -indusert signaleringshendelser, vi har stilnet ekspresjon av GRP78 av RNAi i tillegg til forbehandling av celler med antistoffer mot den carboxyl-terminale domene av GRP78. For å bestemme spesifisiteten av mTORC1 i aktivere sin nedstrøms underlaget S6-kinase og mTORC2 i fosforylere Akt
S473, har vi ansatt Raptor og Rictor RNAi behandling, henholdsvis. Her viser vi at α
2 M * aktiverer mTORC1 kinase som bestemmes av S6-kinase og 4EBP1 fosforylering og mTORC2 kinase som bestemmes av Akt
S473 fosforylering. Dempe GRP78 genuttrykk av RNAi eller behandling med grp78 antistoffer sterkt undertrykte α
2 M * indusert aktivering av mTORC1 og mTORC2 i disse cellene. Disse studiene demonstrerer videre rollen til sirkulerende α
2M, en panne proteinase-inhibitor, som en vekstfaktor og i anstand GRP78 som en vekstfaktorreseptor viktig for cellulær vekst i patofysiologiske miljøer.
En representativ immunoblot p-S6-kinase (O) og p-4EBP1 (•) fra tre til fem eksperimenter er vist for hvert protein i Panelene A og B. p-S6-kinase (O) og p-4EBP1 (•) er uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter som gjennomsnitt ± SE fra tre til fire uavhengige forsøk. Proteinet lasting kontroll for Panel A og panel B er vist nedenfor de respektive immunoblotter.
Materialer og metoder
Materialer
Dyrkingsmedier ble kjøpt fra Invitrogen. Reseptor-gjenkjent α
2M * ble fremstilt ved omsetning av α
2M med metylamin som beskrevet tidligere [9). Antistoffer mot mTOR, p-mTOR
S2481, GβL, p-TSC2
T1462, rheb, S6-kinase, p-S6-kinase
T235 /236, p-S6-kinase
T389, p-S6-kinase
T229, 4EBP1, p-4EBP1
T37 /46, akt1, p-Akt
T308, p-Akt
S473 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) . Antistoffer mot Raptor, Rictor, Protor var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Anti-mSIN1 antistoff var fra Bethyl Laboratories, Inc (Montgomery, Texas). Anti-aktin antistoff var fra Sigma (St. Louis, MO). PHAS-en (4EBP1) var fra Stratgene. GST-S6-kinase-konstruksjonen ble uttrykt og renset i henhold til protokollen gitt av professor Blenis (Harvard University Medical School). Antistoffer mot den karboksyl-terminale domene av GRP78 var fra Aventa biofarmasøytisk Corp (San Diego, CA). [
3 H] leucine (spesifikk aktivitet 115,4 Ci /mmol) og [
33P] -γ-ATP (spesifikk aktivitet 3000Ci /mmol) var fra Perkin-Elmer miljø- og biovitenskap. Rapamycin og LY294002 var fra Biomol (Plymouth, PA). Alle andre materialer var av analytisk kvalitet og ble anskaffet lokalt.
•) som bestemmes av Western blotting. En representant immunoblot p-Akt
T308 og p-Akt
S473 fra tre til fire forsøk er vist under grafen. Ekspresjonen av disse proteinene er vist i vilkårlige enheter, og fluorescens er uttrykt som gjennomsnitt ± SE fra tre til fire eksperimenter. De protein lasting kontroller for Panel A og panel B er vist nedenfor de respektive immunoblotter.
Prostate Cancer Cell Lines
I en tidligere rapport, vi studerte to prostatakreft linjer 1-LN og DU-145, som uttrykker GRP78 på deres celleoverflate og PC-3 prostata cancer linje, som uttrykker lite GRP78 på sin celleoverflate [10], [12]. Den svært metastatisk 1-LN cellelinjen er avledet fra PC-3 linje og var en slags gave av Dr. Phillip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). PC-3 og DU-cellelinjene 145 ble erholdt fra American Type Culture Collection. Den 1-LN-cellelinjen ble avledet fra en flanke tumormodell hvor PC-3-celler ble implantert i nakne mus. Cellene ble erholdt fra en lymfeknutemetastase hos disse mus. Fordi denne cellelinje uttrykker GRP78 på celleoverflaten, og ingen eller meget lite LRP, har vi i utstrakt bruk av denne linje for å studere rollen til celleoverflaten GRP78 i kreftcellevekst. Denne cellelinjen er tilgjengelig for enhver etterforsker som ønsker å bruke dem. Avhengig av eksperimentene, ble disse celler dyrket enten i 6, 12, 24- eller 48-brønners plater til konfluens i RPMI-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 12,5 enheter /ml penicillin, 6,5 ug /ml streptomycin og 10 nM insulin (RPMI-S) i en fuktet CO
2 (5%) inkubator. Ved 90% konfluens ble mediet aspirert. Monolagene vasket med iskald HHBSS, et friskt volum av medium tilsatt og cellene anvendt for eksperimentene som er beskrevet nedenfor.
En representant immunoblot fra tre til fire eksperimenter av mTOR, Raptor, GβL, mSIN1, og Rictor Protor tilstedeværelse i disse respektive immunutfelninger er vist. Cellene ble behandlet med: (1) buffer og (2) 50 pM av α
2 M * i 25 min
Fastsettelse av effekten av α
2 M * på proteinsyntesen. i 1-LN-celler
1-LN-celler (300 x 10
3 celler /brønn) i 48 brønners plater ble dyrket i RPMI-S-medium i en fuktet CO
2 (5%) inkubator ved 37 ° C. Ved omtrent 90% konfluens, ble mediet suget av et volum av RPMI-S ble tilsatt, fulgt av tilsetning av enten buffer eller α
2M * (50 pM). Til hver brønn ble det tilsatt [
3H] leucin (2 pCi /ml) og cellene ble inkubert over natten. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet, og monolagene ble vasket tre ganger to ganger med is-kald 5% TCA, etterfulgt av tre vaskinger med iskald PBS. Celler ble lysert i et volum på 1 NaOH (40 ° C /2 h), protein ble estimert, og lysatene ble tellet i en væske-scintillasjonsteller. I forsøk hvor modulering av α
2M *-indusert protein syntese ble undersøkt, ble cellene forbehandlet med PI 3-kinase-inhibitor LY294002 (20 uM /20 min), mTOR inhibitor rapamycin (100 nM /15 min) eller actinomycin D (5 mikrogram /ml /20 min), før du legger α
2 M * (50 pM /natten). Andre detaljer om kvantifisering [
3 H] leucine innlemmelse i cellulære proteiner som beskrevet [41].
fosforylering av S6-kinase og 4EBP1 ble bestemt etter [
33P] -γ-ATP innlemmelse og autoradiografi (AR) og ved immunoblotting (IB). Panel A. et søylediagram som viser α
2 M * indusert aktivering av mTORC1 og dens modulering av LY294002 og rapamycin i mTOR immunutfelninger som bestemmes av autoradiografi. Barene og baner i autoradiografer er: (1) buffer; (2) α
2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /20 min) og deretter α
2M * (50 pM /25 min); og (4) rapamycin (100 nM /15 min) og deretter α
2M * (50 pM /25 min). En representant autoradiogram (AR) av tre individuelle eksperimenter vises under søylediagram. Fosforyleringen av S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) er uttrykt i vilkårlige enheter, og fluorescens er middelverdien ± fra tre uavhengige eksperimenter. Det er også vist nedenfor AR er et representativt immunoblot (IB) av tre eksperimenter av p-S6-kinase og p-4EBP1 oppnådd fra mTOR immunopresipitater av celler behandlet som i autoradiografisk analyse i panel A. Panel B. et søylediagram som viser effekten av å stanse GRP78 uttrykk ved RNAi på α
2 M * indusert aktivering av mTORC1 i mTOR immunopreciptates i en-LN celler som bestemt ved autoradiografi. Barene og baner i autoradiogram (AR) er: (1) lipofektamin + buffer; (2) lipfectamine + α
2 M (50 PM /25 min); (3) GRP78 dsRNA (100 nM /48h) da α
2 M * (til PM /25 min); og (4) kryptert dsRNA (100 nM /48h) enn α
2M * (for å pM /25 min). En representant autoradiogram av S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) av tre forsøk er vist under søylediagram. Fosforyleringen av S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) er uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter som gjennomsnitt ± SE fra tre uavhengige eksperimenter. Også vist under autoradiogram (AR) er et representativt immunoblot (IB) p-S6-kinase og p-4EBP1 oppnådd fra mTOR immunopresipitater av 1-LN-celler behandlet som i autoradiografisk analyse i panel B. En immunoblot representativt av tre eksperimenter viser ekspresjonen av GRP78 i celler transfektert med GRP78 dsRNA er også vist. Banene i immunoblot er: (1) lipofektamin + buffer; (2) lipofektamin + α
2M * (50 pm /25 min); (3) GRP78 dsRNA (100 nM /48h) + α
2 M *; og (4) kryptert dsRNAi (100 nM /48h) + α
2M *. Panel C. et søylediagram som viser effekten av å stanse GRP78 ekspresjon av RNAi på α
2M *-indusert fosforylering av S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) i Raptor immunutfelninger av 1-LN-celler som bestemt ved autoradiografi. Barene og kjørefelt i autoradiogram (AR) er identisk med søylediagram og autoradiogram i panel B. En representant autoradiogram (AR) i S6-kinase og 4EBP1 av tre forsøk er vist under søylediagram. Fosforyleringen av S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) er uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter som gjennomsnitt ± SE fra tre eksperimenter. Også vist under autoradiogram (AR) er en representant immunoblot (IB) av tre eksperimenter av p-S6-kinase og p-4EBP1 hentet fra Raptor immunpresipitatene av 1-LN celler behandlet som i autoradiografisk analyse i Panel C. Panel D. autoradiogram som viser α
2 M * indusert fosforylering av S6-kinase og 4EBP1 i DU-145 prostatakreftceller, men ikke i PC-3 prostatakreftceller. Baner i autoradiogram er: (1) buffer; (2) α
2 M *. For mer informasjon se «Eksperimentelle metoder» -delen. Den autoradiogram er vist er representative for fire eksperimenter. Panel E. et søylediagram som viser at antistoffer mot karboksyl-terminal domene av GRP78 sperre α
2 M * indusert fosforylering av S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) i mTOR immunutfelninger av 1-LN celler. Stolpene er: (1) buffer; (2) α
2M * (50 pM /25 min); (3) antistoffer mot den carboxyl-terminale domenet av GRP78 (3 ug /ml /1 time) og deretter α
2M *. Fosforyleringen av S6-kinase og 4EBP1 ble bestemt ved autoradiografisk analyse, og er uttrykt i vilkårlige enheter, og er gjennomsnitt ± SE fra tre eksperimenter. Verdiene signifikant forskjellige på 5% for α
2 M * og egge dsRNA-behandlede celler er merket med en stjerne (*) i alle paneler A til E.
Effekter av 1-LN Cell Inkubasjon med α
2 M * på p-mTOR
S2481, p-TSC2
T1462, rheb, Raptor, Rictor, GβL, p-S6-kinase, p-4EBP1, p-Akt
T308, og p-Akt
S473
1-LN-celler (300 x 10
3 celler /brønn) i RPMI-S-medium i 6 brønners plater ble inkubert som ovenfor. Ved 90% konfluens ble mediet aspirert, et volum av RPMI-S-medium tilsatt til hver brønn. I ett sett av eksperimenter ble celler stimulert med varierende konsentrasjoner av α
2M * og inkubert i 30 min. I et annet sett av undersøkelser ble celler stimulert med 50 pM av α
2M * og inkubert i forskjellige tidsrom ved 37 ° C i en fuktet CO
2 (5%) inkubator. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet, et volum av lysis buffer A inneholdende 50 mM Tris • HCl (pH 7,5), 120 mM NaOH, 0,1% NP40, 25 mM natriumfluorid, 1 mM natriumpyrofosfat, 0,1 mM natrium ortovanadat, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidin, og leupeptin (10 ug /ml) tilsatt og plasseres over is i 15 min. Lysatene ble overført til Eppendorf-rør og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for å fjerne celleavfall. Supernatantene ble fjernet til nye rør og deres proteininnholdet bestemmes [42]. Til en lik mengde protein, et volum på 4 x prøvebuffer tilsatt, rørene kokt i 5 minutter og sentrifugert. Prøvene ble underkastet elektroforese i polyakrylamidgeler (12,5%, 10% eller 4-20% gradient-geler etter behov). Proteinbåndene i gels ble overført til Hybond-P membraner og i egne eksperimenter membraner immunoblottet med antistoffer mot p-mTOR
S2481, p-TSC2
T1462, Raptor, Rictor, GβL, rheb, p-S6-kinase
S235 /236, p-4EBP1
T37 /46, p-Akt
T308 eller p-Akt
S473 i 16 timer ved 4 ° C med rotasjon. Påvisning og kvantifisering av immunoblotter for de respektive antigener ble utført av ECF og Storm 860 phosphorimager. De respektive membraner ble reprobed for protein lasting kontroller, ufosforylerte målproteinet eller actin, i dette og de følgende studier. Spesifisiteten av antistoffene som anvendes her og i forsøkene beskrevet nedenfor, ble bestemt ved å behandle cellene med ikke-immun antistoffer og cellelysatene er behandlet som ovenfor. Under de eksperimentelle betingelser, ble det ikke observert noen reaktivitet av disse kontrollene [10], [43], [44].
apparat A. Søylediagram som viser nivåene av Raptor i celler transfektert med Raptor dsRNA og stimulert med α
2M * eller insulin. Stolpene er: (1) lipofektamin + buffer; (2) lipofektamin + α
2M * (50 pM /25 min); (3) lipofektamin + insulin (200 nM /20 min); (4) kryptert dsRNA (100 nM /48 t) + insulin; (5) Raptor dsRNA (100 nM /48 t); (6) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) og deretter α
2M *; (7) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) og deretter insulin (200 nM /20 min); (8) rapamycin (100 nM /20 min) og deretter insulin. Verdier er gjennomsnitt ± SE fra tre til fire uavhengige forsøk og er uttrykt som vilkårlige fluorescensenheter. Verdier vesentlig forskjellige på 5% nivå for α
2 M *, insulin og egge dsRNA behandlede celler er merket med en stjerne (*). En representant immunoblot av Raptor fra tre til fire eksperimenter sammen med sin protein lasting kontroll aktin vises under søylediagram. Panel B. et søylediagram som viser mTORC1 aktivering i celler behandlet med α
2 M * og insulin og effekten av transfeksjon med Raptor dsRNA på sin aktivering som måles ved å analysere fosforylering av S6-kinase ved autoradiografi. Barene og stier i autoradiogram er: (1) lipofektamin + buffer; (2) lipofektamin + α
2M * (50 pM /25 min); (3) Raptor dsRNA (100 nM /48 t); (4) Raptor dsRNA + α
2 M *; (5) lipofektamin + insulin (200 nM /20 min); (6) kryptert dsRNA (100 nM /48 t) + insulin; (7) Raptor dsRNA (100 nM /20 min) og deretter insulin; (8) rapamycin (100 nM /20 min) og deretter α
2M *; (9) LY294002 (20 mM /20 min) og deretter insulin; (10) rapamycin (100 nM /20 min) og deretter insulin. En representant autoradiogram av tre eksperimenter av S6-kinasefosforylasjon vises under søylediagram. Verdier er gjennomsnitt ± SE fra tre eksperimenter og uttrykt i vilkårlige enheter. Verdier vesentlig forskjellige på 5% nivå for α
2 M *, insulin og egge dsRNA behandlede celler er merket med en stjerne (*). Panel C. et søylediagram som viser nivåer av S6-kinase fosforylert på T389 (▪); T229 (se grå firkant) og T 235/236 (□) i celler stimulert med α
2 M * eller insulin og transfektert med Raptor dsRNA. Stolpene er som i Panel A. Representative immunoblotter av p-S6-kinase
T389, p-S6-kinase
T229 og p-S6-kinase
T235 /236 av tre eksperimenter sammen med sin protein lasting kontroll vises under søylediagram. Verdier er gjennomsnitt ± SE fra tre eksperimenter og uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter. Verdier vesentlig forskjellige på 5% nivå for α
2 M *, insulin eller egge dsRNA er markert med en stjerne (*). Panel D. et søylediagram som viser fosforylering nivåer av 4EBP1, i celler behandlet med α
2 M * og insulin eller transfektert med Raptor dsRNA. Stolpene er som i panel A. En representant immunoblot av p-4EBP1 av tre eksperimenter sammen med sin protein lasting kontroll vises under søylediagram. Verdier er gjennomsnitt ± SE fra tre eksperimenter og uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter. Verdier vesentlig forskjellige på 5% nivå for α
2 M *, insulin og egge dsRNA-behandlede celler er merket med en stjerne (*).
Karakterisering av komponentene i mTORC1 og mTORC2 Komplekser i 1-LN Prostate Cancer celler stimulert med α
2M *
1-LN-celler (3 x 10
6 per brønn i 6-brønners plater) inkubert over natten i RPMI-S-medium ble vasket to ganger med iskald HHBSS og et volum av RPMI-S-medium tilsatt til hver brønn. Etter stabilisering av temperaturen, ble cellen i brønnene utsatt for enten buffer eller α
2M * (50 pM /25 min) og inkubert som ovenfor. Reaksjoner ble stoppet ved å aspirere mediet og et volum av CHAPS lyseringsbuffer (buffer B) inneholdende 40 mM Hepe (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrofosfat, 10 mM β-glycerofosfat, 0,5 mM natriumortovanadat , 0,3% CHAPS og et Roche protease inhibitor cocktail tabletter (en tablett /10 ml) ble tilsatt, og cellene lysert over is i 15 min. Lysatene ble overført for å skille Eppendorf-rør, sentrifugert (1000 opm /5 min /4 ° C) og supernatantene anvendt for protein estimering og immunopresipitering. Like mengder av lysat protein (200-250 ug) i separate forsøk ble anvendt for immunopresipitering med Raptor antistoffer (1:50, Santa Cruz Cat # sc81537), eller Rictor antistoffer (1:50, Santa Cruz cat # 81 538), etterfulgt av tilsetning av 40 ul protein A agarose og innholdet inkubert med rotasjon over natten ved 4 ° C. Raptor og Rictor immunopresipitatene ble gjenvunnet ved mikrosentrifugering (2000 opm /5 min /4 ° C) og vasket to ganger med kald lyseringsbuffer B. Til Raptor og Rictor immunopresipitater et volum på 4 x prøvebuffer ble tilsatt, rørene kokt i 5 min , sentrifugert, underkastet elektroforese (4-20%, 12,5% eller 10% akrylamidgeler), overført til Hybond-P-membraner og membraner immunoblottet med antistoffer som er spesifikke for mTOR, Raptor, Rictor, GβL, mSIN1 og Protor. Proteinbåndene på membranene ble kvantifisert som ovenfor [43], [44].
Panel A. et søylediagram som viser α
2 M * indusert fosforylering av Akt på T308 (▪) og S473 ( □) i kinase analyser av mTOR immunpresipitatene. Stolpene og baner i immunoblot er: (1) buffer; (2) α
2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 mikrometer /25 min) deretter α
2 M *; (4) rapamycin (100 nM /20 min) og deretter α
2M *. Verdier er gjennomsnitt ± SE fra fire uavhengige forsøk og er uttrykt som fmol [
33P] -γ-ATP innlemmet /mg celleprotein. Verdier vesentlig forskjellige på 5% nivå for α
2 M * behandlede celler er merket med en stjerne (*). Panel B. et søylediagram som viser α
2 M * indusert fosforylering av Akt på T308 (▪) og S473 (□) i kinase analyser av Rictor immunpresipitatene. Barene og stier i immunoblot er: (1) buffer; (2) α
2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 mM /25 min) og deretter α
2M * og (4) Rapamycin (100 nM /20 min).
