Abstract
Bakgrunn
tykktarmskreft (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødelighet over hele verden. MicroRNAs (mirnas, Mirs) spiller viktige roller i kreftutvikling. MiR-126 har vist seg å være nedregulert i CRC. I denne studien har vi identifisert de potensielle effektene av MIR-126 på noen viktige biologiske egenskaper CRC celler og avklart regulering av insulinreseptoren substrat 1 (IRS-1) og dens mulige signalveien ved MIR-126.
Metoder
effekten av MIR-126 på IRS-1, AKT, og ERK1 /2 uttrykk ble undersøkt i CRC cellelinjer HT-29 og HCT-116 med en MIR-126 etterligne eller inhibitor for å øke eller redusere MIR-126 uttrykk. Videre ble rollene til Mir-126 i regulering av de biologiske egenskapene til CRC celler analysert med Mir-126 etterligne eller hemmer-transfekterte celler. 3′-utranslatert region (3′-UTR) av IRS-1 reguleres av MIR-126 ble analysert ved hjelp av en dual-luciferase reporter analysen.
Resultater
Vi fant at IRS- 1 er den funksjonelle nedstrøms målet på MIR-126 ved direkte rettet mot 3′-UTR av IRS-1. Endogen MIR-126 og eksogene Mir-126 etterligne hemmet IRS-1 uttrykk. Videre får-of-funksjon eller tap-av-funksjon studier viste at over-uttrykk for MIR-126 nedregulert IRS-1, undertrykt AKT og ERK1 /2 aktivisering, CRC celler spredning, migrasjon, invasjon, og forårsaket cellesyklus arrest, men hadde ingen effekt på celle apoptose. Knockdown av MIR-126 forfremmet disse prosessene i HCT-116 celler og fremmet AKT og ERK1 /2 aktivering av opp-regulerer uttrykket av IRS-1 protein.
Konklusjoner
MiR-126 kan spille roller i regulering av den biologiske oppførsel av CRC-celler, i det minste delvis, ved å målrette IRS-1 via AKT og ERK1 /2 signalveier
relasjon:. Zhou Y, Feng X, yl Liu Ye Sc, Wang H, Tan Wk, et al. (2013) nedregulering av MIR-126 er forbundet med kolorektal kreft celler spredning, migrasjon og invasjon av målretting IRS-en via AKT og ERK1 /2 signalveier. PLoS ONE 8 (11): e81203. doi: 10,1371 /journal.pone.0081203
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 31 august 2013; Godkjent: 14 oktober 2013; Publisert: 29.11.2013
Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av stiftelsen for Distinguished Unge Talenter i høyere utdanning i Guangdong, Kina (tilskudd nummer LYM11103). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste menneskelige gastrointestinale maligniteter i verden med en årlig økende forekomst og dødelighet [1], [2]. Det er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i både menn og kvinner i Kina [3]. Patogenesen av CRC er ennå ikke fullt ut forstått. Det er for tiden foreslått at tykktarmskreft involverer flere trinn molekylære prosesser med aktivering av onkogener, mutasjon av mismatch repair gener eller inaktivering av tumorsuppressorgener, som påvirker proliferasjon, migrering, invasjon, apoptose, eller andre aspekter av kreftceller. I tillegg til genet aktivering og inaktivering, økende bevis tyder på at microRNAs (mirnas, Mirs) kan spille roller i utviklingen av CRC [4].
Moden mirnas er en klasse av små, ikke-kodende RNA-molekyler med en lengde på 20-25 nukleotider. De vanligvis samhandle med miRNA-anerkjennelse elementer i 3′-utranslaterte område (3′-UTR) av målet mRNA, regulere mRNA degradering, eller undertrykke deres oversettelse som viktige post-transcriptional regulatorer. Mirnas har vist seg å spille viktige roller i mange biologiske prosesser som celle-differensiering, proliferasjon, apoptose, inflammatoriske og immunresponser [5], [6]. Økende bevis har vist at mirnas er kritisk involvert i tumorigenesis. Avhengig av mobilnettet kontekst og målgener at de regulerer, kan mirnas fungere som tumor suppressors eller onkogener [7], [8]. MiR-200 og MIR-155 kan være involvert i kreftcelle migrering og invasjon ved å regulere epithelial-til-mesenchymale overgang eller cellulær adhesjon [9], [10]. Zhang et al. rapporterte en invers korrelasjon mellom metastase-forbundet i tykktarm kreft-en (MACC1) og Mir-143 uttrykk i tykktarmskreft cellelinjer og viste at den direkte hemming av metastase-forbundet i tykktarm kreft-1 mRNA oversettelse ble formidlet av MIR-143 [ ,,,0],11]. Over-uttrykk for MIR-211 i HCT-116 celler endret p53 pathway-forbundet regulatoriske proteiner, f.eks MDM2, BCL-2, Bcl-xL og Bax [12]. Tallrike studier har funnet at MIR-126 er betydelig redusert i flere krefttyper, og dermed kan spille en rolle som tumor suppressor. For eksempel ble lav MIR-126 ekspresjon observert i ikke-småcellet lungekreft og identifisert som ugunstig prognostisk faktor i ikke-småcellet lungecancerpasienter [13]; MIR-126-ekspresjon ble også redusert i human brystcancer, og kan spille roller i tumordannelse og vekst ved regulering av vaskulær endotelial vekstfaktor /fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT signalveien [14]. Ekspresjonen av MIR-126 i CRC vev var signifikant lavere enn i ikke-tumorvev, og MIR-126 over-ekspresjon hemmet veksten av CRC-celler [15]. Guo C et al. bemerket tap av Mir-126 uttrykk i tykktarm kreft cellelinjer i forhold til normal menneskelig kolon epitel og avslørte at MIR-126 regulerer PI3K signale dels rettet mot p85β [16]. Men funksjonen av MIR-126 og dens mulige signalveien i CRC er ikke fullstendig klarlagt.
Insulin reseptor substrat-1 (IRS-1) er et familiemedlem av insulin receptor substrater, som ble først karakterisert som typiske cytosoliske adapter proteiner i både insulin reseptor (IR) og insulin-lignende vekstfaktor i reseptor (IGF1R) signalering. Nyere studier fastslått at IRS-1 spiller også roller i å fremme mitose og apoptoseresistens, malign transformasjon og spredning [17]. Chang et al. [18] fant at IRS-en var over-uttrykt i ulike typer solide tumorer, inkludert brystkreft, leiomyomas, Wilms svulster, rhabdomyosarcomas, liposarcomas, leiomyosarcomas og adrenal cortical karsinomer. Videre er IRS-1 assosiert med CRC [19] og oppregulert i cancercellelinjer [20]. Bio har vist at 3′-UTR av IRS-1 inneholder en antatt bindingssete for MIR-126. Imidlertid har reguleringen av MIR-126 i CRC og sin tilknytning til IRS-1 ikke blitt rapportert ennå.
I denne studien ønsket vi å karakterisere rollene til MIR-126 og dens mulige signalveien i patogenesen av CRC celler. I gain-of-funksjon studier, fant vi at overuttrykk av MIR-126 nedregulert IRS-1 uttrykk, undertrykt AKT og ERK1 /2 aktivisering, CRC celler spredning, migrasjon, invasjon, og resulterte i cellesyklus arrest, men hadde ingen effekt på celle apoptose. Knockdown av MIR-126 fremmet disse prosessene i CRC celler og oppregulert uttrykk for IRS-1 protein. Ved å bruke luciferase-reporter genkonstruksjoner, identifiserte vi IRS-1 som funksjonell nedstrøms mål av MIR-126.
Materialer og metoder
Cell kultur
CRC cellelinjer HT -29, ble HCT-116, SW480 og SW620 kjøpt fra cellen bank av svulst sykehuset av den kinesiske Academy of Medical Sciences /biologisk Detection senter (Beijing, Kina). Alle celler ble opprettholdt i RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
miRNA etterligne eller inhibitor transfeksjon
Alle celler ble sådd inn i 6-brønners, 12-brønners, 24-brønners, eller 96-brønners plater ved 90% konfluens og holdt i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 over natten. MiR-126 etterligne, MIR-126 negativ kontroll ligne (NC ligne), MIR-126 hemmer og MIR-126 negativ kontroll inhibitor (NC-hemmer) ble kjøpt fra Ribobio (RiboBio, Guangzhou, Kina) .Varying mengder Mir-126 etterligne eller NC etterligner (RiBoBio) ble transfektert inn i HT-29 celler, mens MIR-126-inhibitor eller NC-inhibitor (RiBoBio) ble transfektert inn i HCT-116 celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). De transfekterte celler ble inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i 24 eller 48 timer. Totalt cellulært RNA og protein ble høstet separat og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Identifisering av potensielle nedstrøms mål for Mir-126
Å forutsi potensielle mål av MIR-126, tre i silikoaluminofosfater analyseprogrammer ble brukt for mikroRNA target prediksjon, dvs. mikrokosmos Targets (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/), Targetscan (http: //www.targetscan .org /), og PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/). 3′-UTR av IRS-1 mRNA (RefSeq NM_005544) har en antatt miRNA-126 bindingsstedet.
IRS-en 3′-UTR villtype og mutant konstruerer
For å teste effekten av MIR-126 på uttrykk for IRS-1, opprettet vi to-luciferase reporter konstruksjoner. 3′-UTR av IRS-1 mRNA som inneholder den antatte MIR-126 bindende sekvens ble syntetisert ved Sangon Biotech (Shanghai, Kina). Fragmentene tilsvarende 1-298 nukleotider av 3′-UTR av IRS-1 mRNA (298 bp) ble deretter subklonet inn
Xho
jeg og
Ikke
Jeg områder nedstrøms Renilla luciferase i psiCheck-2 vektor (Promega). For å generere en konstruksjon som inneholder MIR-126 bindingssetet mutant, vi byttet to nukleotider som tilsvarer 5′-seeding region av MIR-126 bindingssetet på villtypen fragment.
villtype og mutant konstruerer var betegnet som psi-IRS-1 og psi-mutIRS-1, henholdsvis. Sekvensene til de konstruksjoner ble verifisert ved DNA-sekvensering. Konstruksjonene ble forvandlet til DH5a celler og plasmid DNA ble renset ved hjelp TIANpure MidiPrep kit (Tiangen Biotech, Beijing, Kina).
Konstruer transfeksjon og luciferase reporter analysen
For å finne den spesifikke effekten av MIR-126 på 3′-UTR av IRS-1, Mir-126 etterligne og psi-IRS-1 luciferase konstruksjon (500 ng /brønn) ble ko-transfektert inn i HT-29 celler ved hjelp Lipofectamine 2000. Renilla og Firefly luciferasepreparater nivåene ble målt i 48 timer etter transfeksjon med Dual luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega Corporation, Madison, WI). Forsøk ble utført i kvadruplikat-brønner og data representerte gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
Isolering av totalt RNA
Dyrkede celler ble hurtig overført til 1,0 ml TRIzol reagens (Invitrogen) og total RNA ble hentet i henhold til produsentens instruksjoner og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Sanntids kvantitativ revers transkriptase-polymerase chain reaction (QRT-PCR)
The One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit og DRR036A (Takara Bio, Inc., Tokyo, Japan) ble brukt til å reversere-transkribere miRNA og mRNA, henholdsvis. For QRT-PCR på transfekterte celler, ble 500 ng av total RNA omdannet til cDNA. Deretter ble 2 mL av cDNA fra hver prøve forsterkes av sanntid fluorescerende qPCR, ved hjelp SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Perfect Real Time) (Takara Bio, Inc.). Ekspresjonen av MIR-126 i hver gruppe ble beregnet i forhold til det av U6B, et ubikvitært uttrykt liten kjerne RNA anvendt som intern kontroll. Ekspresjon av beta-aktin ble benyttet som kontroll normalisering i mRNA qPCR. For miRNA qPCR, revers primer var den universelle qPCR primer for miRNA (Takara Bio, Inc.). Forward miRNA og mRNA primere ble syntetisert ved Sangon Biotech, og de respektive sekvensene ble oppført i tabell 1. En komparativ terskel syklus metoden ble brukt til å sammenligne hver tilstand med de respektive kontrollene. Reaksjonene ble utført på en LightCycler® (Roche Diagnostics, Basel, Sveits). PCR-betingelsene var 30 s ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 5 s ved 95 ° C og 20 s ved 60 ° C. De 2
– △ Ct (2
– [(Ct av genet) – (Ct av U6)]). Metoden ble brukt for analyse
Western blot
Western blot ble utført i henhold til standardprotokollen. Kort sagt ble 20 ug protein per prøve separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese og deretter overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Membranene ble probet med kanin-anti-humant IRS-1 primære antistoff (1:1000 fortynning, CST), kanin anti-humant p-AKT primære antistoff (1:500 fortynning, CST), kanin anti-humant total-AKT primære antistoff (1:500 fortynning, CST), kanin anti-humant p-ERK1 /2 primære antistoff (1:500 fortynning, CST) eller kanin-anti-human total-ERK1 /2 primære antistoff (1:500 fortynning; CST) over natten ved 4 ° C. Membranene ble deretter inkubert med pepperrot peroksidase-merket geite-anti-kanin-IgG (1:1000; Beyotime, Jiangsu, Kina) ved romtemperatur (RT) i 1 time. Glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase ble anvendt som kontroll lasting og et muse anti-human glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-antistoffet ble anvendt for dens deteksjon. Integralet av den optiske tetthet av proteinbåndene ble målt ved anvendelse av Mengde En programvare for bildeanalyse (Bio-Rad, Hercules, CA).
Immunofluorescence
Immunofluorescens-farging ble utført i henhold til en standard protokoll (Santa Cruz Biotechnology). Kort sagt ble HCT-116-cellene på dekkglass fiksert i aceton ved 4 ° C i 10 minutter og blokkert med 10% geiteserum albumin ved RT i 1 time. Cellene ble inkubert med kanin anti-humant IRS-1 primære antistoff (1:200) (Santa Cruz Biotechnology) over natten ved 4 ° C. Etter skylling i fosfat-bufret saltvann (PBS) 3 ganger, ble cellene inkubert med sekundær polyklonalt Cy3-merket geit-anti-kanin-IgG 594 (1:400) (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing, Kina) i 1 time ved RT i mørke, og deretter vasket med PBS. Den anti-IRS-1-antistoff ble erstattet med PBS i den negative kontrollprøven. 4 «, ble 6-diamidino-2-fenylindol brukt til å kontra flekken kjernene (5 min ved romtemperatur). Fargingen ble evaluert, og fluorescensintensiteten ble målt på en Leica omdannet fluorescens mikroskop. Vi kvantifisert den totale Cy3 fluorescens-intensitet (som vist i rødt) som representasjon av protein ekspresjonsnivået av IRS-1. Intensiteten av 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol-farging (blå) ble anvendt som intern normalisering kontroll for justering av fluorescens-signaler mellom ulike sider.
cellesyklusanalyse
cellesyklus-analyse var utføres ved hjelp av Cellesyklus og apoptose Analyse Kits (Beyotime). HT-29 celler ble sådd ut ved en tetthet på ca. 5 x 10
5-celler /brønn inn i 12-brønners plater, dyrket i 48 timer etter transfeksjon som nevnt ovenfor, høstet, vasket med PBS, og deretter fiksert med 70% etanol over natten ved 4 ° C. Celler ble behandlet med 20 pg /ml RNase, farget med 20 ug /ml propidiumjodid i 30 minutter ved 37 ° C i mørke, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. (FACScan, BD Biosciences, San Diego, CA, USA)
apoptose analysen
målingen av apoptose ble gjennomført i henhold til produsentens instruksjoner for annexin V-fluoresceinisotiocyanat apoptose deteksjon kit (Beyotime). Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellene høstet suspendert i 500 ul annexin V bindingsbuffer. Deretter ble 5 ul annexin V-fluorescein-isotiocyanat og 10 mL propidium jodid tilsatt til brønnene og cellene ble inkubert i 5 min i mørke. Prøvene ble analysert i løpet av 1 time etter farging med flowcytometri (FACScan; BD Biosciences). Celler ble diskriminert som levedyktige celler, nekrotiske celler, og apoptotiske celler ved hjelp av celle Quest Software (BD Biosciences); deretter, ble prosentandelen av apoptotiske celler fra hver gruppe sammenlignet. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Cell vekstanalyse
Celleviabilitet ble undersøkt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 analysen (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). HT-29 celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
3 per brønn i en 96-brønns plate og dyrket som beskrevet ovenfor i 48 timer etter transfeksjon. Ved fullføring av inkuberingen, ble cellenes levedyktighet bestemt ved anvendelse av celletellingsleder-8 i henhold til produsentens instruksjoner. Mediet ble fjernet og erstattet med 100 ul friskt medium supplert med celletelling leder-8-reagens (10 ul) i hver brønn og inkubert i 1 time ved 37 ° C. Absorbans (A) av hver brønn ble avlest ved 450 nm ved bruk av en enzymbundet immunosorbent assay leser (Thermo, USA). Cellen levedyktighet (% av kontroll) ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: Overlevelse (%) = (A
sample – A
blank) /(A
control – A
blank), hvor Et
prøven var den optiske tetthet av MIR-126-transfekterte celler, A
kontroll ble den optiske densitet for NC-transfekterte celler, og A
blank ble den optiske densitet av brønner uten celler. Alle forsøk ble utført in triplo.
In vitro transwell migrering og invasjon assay
Transwell membraner (polycarbonic membran, diameter 6,5 mm, porestørrelse 8 pm) (Corning Costar, NewYork, USA) belagt uten eller med Matrigel (BD Biosciences) ble anvendt for å bestemme migrering eller invasjon av celler in vitro, respektivt. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble HT-29 eller HCT-116-celler løsnet ved behandling med 0,25% trypsin-EDTA (Gibco), sentrifugert og resuspendert i serumfritt medium. Transfekterte celler (10 × 10
4 i 200 mL serumfritt medium) ble reseeded i det øvre kammeret. Deretter, 600 ul medium supplert med 20% føtalt bovint serum ble tilsatt til det nedre kammer som kjemotiltrekkende. Etter 48 timers inkubering, ble ikke-migrerende eller ikke-invaderende celler på den øvre overflaten av membranen fjernes med en bomullsdott. De migrerte eller invaderte celler, som penetrerte til den nedre overflaten av membranen ble fiksert med 4% para-formaldehyd og beiset med 0,1% krystallfiolett (Beyotime). Antallet celler som migrerer eller invaderer membranen ble tellet fra 5 tilfeldig valgte synsfelt, med et invertert mikroskop ved 200 x forstørrelse. Resultater ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter.
Statistisk analyse
Eksperimentelle resultater er uttrykt som middelverdier ± standardfeil. Statistiske analyser ble utført med t-test for 2 grupper som bruker SPSS programvare, v13.0 (International Business Machines Corporation).
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Uttrykk av MIR-126 i CRC cellelinjer
Vi analyserte uttrykket nivået av speil 126 i et panel av CRC-cellelinjer med forskjellig grad av differensiering og metastatiske egenskaper, inkludert HT-29, HCT-116, SW480 og SW620-celler. Det ble observert at den MIR-126 ekspresjon var forholdsvis høyere i HCT-116-celler enn i de andre tre cellelinjer. Resultatene er vist i Figur 1 antyder at MIR-126 ekspresjon kan være forbundet med graden av CRC-celler differensiering og metastatisk evne. Basert på dette uttrykket mønster, valgte vi HT-29 og HCT-116 celler for følgende henholdsvis gevinst-av-funksjon og tap-av-funksjon studier,.
uttrykk for MIR-126 var relativt høyere i HCT-116-celler og lavere i HT-29, SW620 og SW480-celler blant de 4 forskjellige CRC-cellelinjer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Valg av potensielle nedstrøms mål for Mir-126
MiR-126 ble funnet å være nedregulert i CRC [15 ]. For å identifisere nedstrøms mål av MIR-126, brukte vi tre miRNA mål prediksjon programmer, dvs. mikrokosmos Targets, Targetscan, og PicTar, for å identifisere potensielle mål. Interessant, IRS-1, som er sterkt uttrykt i CRC-celler [21], er en av de forutsagte målene for MIR-126. En antatt MIR-126 bindingssete som omfatter 6 perfekt tilpasset nukleotider ble definert ved 3′-UTR av IRS-1 (figur 2A).
(A) Plassering av MIR-126 målområde i tre «-UTR av IRS-1 mRNA spådd av TargetScan. HT-29-celler ble transfektert med enten det opprinnelige dual luciferase reporter-vektor (psi-vektor) eller en IRS-1 3′-UTR konstruere med villtype MIR-126 bindingssetet (psi-IRS-1) eller den muterte speil 126 bindingssetet (psi-IRS-1-mut). Relativ Renilla luciferase-aktivitet (normalisert til ildflueluciferase aktivitet) ble målt 24 timer etter transfeksjon. (B) Relative Renilla luciferaseaktivitet ble redusert i celler transfektert med villtype IRS-1 3»-UTR konstruere (psi-IRS-1) sammenlignet med de som er transfektert med psi-vektoren (500 ng /brønn av en 24-brønners -tallerken). Relativ Renilla luciferase aktivitet ble restaurert i celler transfektert med mutant konstruksjon (psi-IRS-1mut). (*
P
0,05, sammenlignet med den i psi-vektor). (C) Co-transfeksjon av HT-29 celler med 50 nm Mir-126 etterligne og ulike luciferaserapportørplasmid konstruksjoner (500 ng /brønn) reduserte den relative Renilla luciferase aktivitet. (*
P
0,05, sammenlignet med den i psi-vektor). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
I et forsøk på å avgrense potensielle nedstrøms mål og videre forstå mekanismene for MIR-126 nedregulering i patogenesen av CRC, transfektert vi HT -29 celler med en IRS-en 3′-UTR luciferase reporter konstruksjon inneholdende en villtype MIR-126 mulige bindingsseter (psi-IRS-1) eller en mutant konstruksjon som bærer mutasjoner i MIR-126 bindingssteder (pSI-mutIRS-1 ). Den relative luciferase aktiviteten av villtype-psi-IRS-1-konstruksjon viste 45% reduksjon i forhold til den psi-mutIRS-en-konstruksjon (
P
0,05) (figur 2B). Disse resultatene indikerer at endogent MIR-126 kan regulere IRS-1 uttrykk ved direkte rettet mot sin 3′-UTR.
For ytterligere å bekrefte disse funnene, Mir-126 etterligne ble ko-transfektert med de oven luciferaserapportørplasmid konstruksjoner i HT-29 celler. MIR-126 etterligne dramatisk redusert (mer enn 60%) luciferase-aktivitet av villtype IRS-1 3′-UTR reporter-konstruksjonen psi-IRS-1, mens den NC mimic hadde ingen effekt på luciferaseaktiviteten i en hvilken som helst gruppe ( Figur 2C).
Men Mir-126 etterligne ikke redusere luciferase aktiviteten i mutant konstruere psi-mutIRS-en (figur 2C), som angir innpassing effekt. Disse resultatene indikerer videre at MIR-126 kan regulere IRS-1 uttrykk ved direkte rettet mot sin 3′-UTR.
Endring av Mir-126 uttrykk endret IRS-1 protein uttrykket nivå, men ikke skattemyndighetene-1 mRNA nivå
For å teste om MIR-126 regulerer endogene IRS-1 uttrykk, Mir-126 etterligne og inhibitor ble transient transfektert inn i HT-29 og HCT-116 celler, henholdsvis. MiR-126 og IRS-1 mRNA uttrykket nivåer ble vurdert. Sammenlignet med NC etterligne, transfeksjon med 50 nM av Mir-126 etterligne i HT-29 celler førte til en ca 48-dobling i Mir-126 uttrykk nivå, som oppdaget av QRT-PCR (figur 3A). Selv om det var en fallende trend i IRS-1 mRNA uttrykk nivå i celler transfektert med Mir-126 etterligne, det var ikke statistisk signifikans mellom de to gruppene testet (
P
0,05) (figur 3B) . Samtidig, har vi funnet at transfeksjon med 100 nM av den MIR-126 inhibitor i HCT-116-celler kunne redusere den modne MIR-126 nivå merkbart (figur 3C), mens IRS-1 mRNA-nivå forble uforandret (figur 3D) .
(A, B) HT-29-celler ble transfektert med 50 nM av MIR-126 etterligne eller negativ kontroll ligne i 48 timer. Ekspresjon av MIR-126 og IRS-1 mRNA i total RNA fra disse cellene ble påvist ved kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon analyse. (C, D) HCT-116-celler ble transfektert med 100 nM av MIR-126-inhibitor eller negativ kontroll-inhibitor i 48 timer. Ekspresjon av MIR-126 og IRS-1 mRNA i total RNA fra disse cellene ble påvist ved QRT-PCR-analyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk (*
P
0,05, sammenlignet med negativ kontroll ligne behandling).
Neste, vi avgjort om uttrykket av IRS-1 protein ble endret i HT-29 celler transfektert med Mir-126 etterligne eller NC ligne og HCT-116 celler transfektert med MIR-126-hemmer eller NC-hemmer. Økningen i MIR-126 nivåer også betydelig redusert de IRS-1 protein uttrykk nivåer som bestemmes av western blot (
P
0,05) (4A, B), mens mRNA nivåer forble uendret (
P
0,05) (figur 3B). I kontrast, for å gjennomføre tap-av-funksjon eksperimenter, 100 nM MIR-126-inhibitor ble transfektert inn i HCT-116-celler og sammenlignet med NC-gruppen. Resultatene viste en nedgang i Mir-126 uttrykk (figur 3C) og en økning i IRS-1 protein uttrykk (
P
0,05). (Tall 4C, D)
(A ) HT-29-celler ble transfektert med MIR-126 etterligne eller negativ kontroll (NC) ligner, og de totale proteiner fra cellene ble brukt til å påvise IRS-1, p-AKT, total-AKT, p-ERK1 /2, total- ERK1 /2, og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ekspresjon ved western blotting. (B) Relative proteinnivåer ble normalisert til de av GAPDH, og representeres som gjennomsnitt ± SD fra tre eksperimenter. * Indikerer at uttrykket nivåer av IRS-1, p-AKT, og p-ERK1 /2 var signifikant lavere i MIR-126 etterligner transfekterte celler enn den for den negative kontroll (NC) etterligner gruppe (
P
0,05). (C) HCT-116-celler ble transfektert med MIR-126-inhibitor eller negativ kontroll (NC) inhibitor, og de ovennevnte proteiner ble påvist ved western blotting. (D) Relative proteinnivåer ble normalisert til de av GAPDH, og representeres som gjennomsnitt ± SD fra tre eksperimenter. * Indikerer at uttrykket nivåer av IRS-1, p-AKT, og p-ERK1 /2 var signifikant økt i den MIR-126 hemmer gruppe i forhold til NC inhibitoren gruppen (
P
0,05 ). (E) HCT-116 celler farget for IRS-1 av immunfluorescens. IRS-1 ble uttrykt i cytoplasma og nivåene var signifikant økt i MIR-126 hemmer-transfekterte celler. Rød, IRS-1; blå, 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol nukleær farging. Bildene ble fotografert på 630 × forstørrelse på en Leica konvertert fluorescens mikroskop. (F) fluorescensintensiteten av IRS-1 i hver gruppe ble deretter beregnet. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk (*
P
0,05 sammenlignet med NC-hemmer)
Endring av Mir-126 uttrykk påvirket AKT og ERK1. /2 aktivisering
for ytterligere å forstå den molekylære mekanismen av MIR-126 i å hemme tumordannelse, fant vi at IRS-1 er en potensiell ny direkte mål på MIR-126 med et bindingssete i sin 3′-UTR region . IRS-1 kan bli rekruttert og fosforylert med insulin-lignende vekstfaktor I ved binding til sin reseptor, insulin-lignende vekstfaktor I reseptor, og således aktivering nedstrøms signalveier som PI3K /AKT [22]. I denne studien fant vi at skattemyndighetene-1 protein uttrykk i HT-29 celler transfektert med 50 nM av MIR-126 ligne ble betydelig hemmet (med 47%) som oppdaget av western blot analyse (4A, B). I samsvar med nedgangen i IRS-1 nivå, over-uttrykk for MIR-126 i HT-29 celler også hemmet p-AKT og p-ERK1 /2 uttrykk nivåer (4A, B). Videre transfeksjon av HCT-116-celler med 100 nM av MIR-126-inhibitor kan oppregulerer IRS-1, p-AKT, og p-ERK1 /2-protein ekspresjonsnivåer, men hadde ingen effekt på total AKT og ERK1 /2 uttrykk nivåer (Tall 4C, D). Disse resultater antyder at MIR-126 regulerer molekylære via målretting IRS-1. I tillegg har vi ytterligere utført immunfluorescens flekker på HCT-116 celler transfektert med MIR-126-hemmer. De farge Resultatene viste at skattemyndighetene-1 protein ble klart uttrykt i cytoplasma av HCT-116 celler (Figur 4E). Nivået ble markert økt i MIR-126 hemmer gruppe i forhold til NC-hemmer gruppe (
P
0,05). (Figur 4F), som er i overensstemmelse med resultatene oppnådd ved western blotting
MiR-126 indusert G0 /G1 fase arrest i CRC celler
Vi har undersøkt om anti-proliferativ aktivitet av MIR-126 i HT-29 celler korrelerte med cellesyklus arrest. Som vist i figur 5A, cellesyklusanalyse viste at transfeksjon med MIR-126 etterligne økte antall CRC celler i G0 /G1 fase, sammenlignet med den etterligne NC (
P
0,05).
(A) MiR-126 etterligne og NC ligne transfekterte celler ble farget med propidiumjodid (PI) og DNA-innholdet ble analysert ved flowcytometri. Antall celler i hver fase ble beregnet ved bruk av ModFit programvare. Resultatene er vist i den nedre kurve som var representative for tre uavhengige eksperimenter (*
P
0,05). (B) HT-29-celler ble transfektert med 50 nM MIR-126 etterligne eller negativ kontroll ligne i 48 timer. Prosentandelen av apoptotiske celler (Annexin V positiv) i forhold til det totale målte cellepopulasjon er vist i den nedre høyre kvadrant av det øvre panelet. Resultatene ble uttrykt som ganger endring i forhold til tilsvarende NC ligne (nederst graf). (
P
0,05, sammenlignet med NC etterligner). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
MiR-126 hadde ingen effekt på apoptose i CRC celler
For å måle effekten av MIR-126 på CRC celler apoptose , apoptose ble målt ved 48 timer etter MIR-126 etterligner transfeksjon ved hjelp av strømningscytometri. Det var ingen signifikant forskjell i antallet annexin V-fluoresceinisotiocyanat (+) apoptotiske celler i en MIR-126 mimic-transfektert gruppen sammenlignet med den NC mimic-transfektert gruppe (figur 5B,
P
0,05 ). Disse funnene tyder på at Mir-126 ikke kan spille en anti-apoptotiske rolle i CRC celler.
MiR-126 hemmet CRC celler spredning
MiR-126 har blitt rapportert å være nedregulert i CRC [23], impliserer dens potensielle rolle i de biologiske egenskapene til CRC-celler. For ytterligere å karakterisere den funksjonelle betydningen av MIR-126 i CRC tumorgenese, undersøkte vi effekten av MIR-126 på proliferasjon av HT-29 celler ved hjelp Celletelling leder-8-analyse. Vi observerte at overuttrykk av MIR-126 undertrykte betydelig spredning av HT-29 celler på 48 timer etter transfeksjon (
P
0,05). (Figur 6A)
(A) HT-29 celler ble transfektert med ulike mengder av Mir-126 etterligne eller negativ kontroll (NC) ligne og celleproliferasjon ble analysert ved hjelp av Cell Counting Kit-8. MIR-126 etterligne viste doseavhengige effekter på inhibering av celleproliferasjon etter transfeksjon i 48 timer. (*
P
0,05, sammenlignet med NC etterligner). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
