Abstract
Høyverdig serøs karsinom (HGSC) er den vanligste og farligste formen for eggstokkreft kreft. Likevel er det i stor grad asymptomatisk i sin innledende stadier. Studerer opprinnelse og tidlige utviklingen av sykdommen er derfor avgjørende for å identifisere markører for tidlig oppdagelse og screening formål. Tissue basert massespektrometri imaging (MSI) kan benyttes som en objektiv måte å undersøke lokaliserte metabolske endringer mellom sunt og kreftvev direkte, ved utbruddet av sykdommen. I denne studien beskriver vi MSI resultater fra
dicer-PTEN
dobbel-knockout (DKO) mus, en musemodell gjengir den kliniske natur menneskelig HGSC. Ved bruk av ikke-negative matrise faktorisering (NMF) for uovervåket analyse av desorpsjon electrospray ionisering (DESI) datasett, vev regioner segregerte basert på spektrale komponenter på en objektiv måte, med endringer knyttet til HGSC uthevet. Resultatene som oppnås ved å kombinere NMF med Desi-MSI avdekket flere metabolske arter forhøyet i svulstvev og /eller omkringliggende blodfylt cyste inkludert ceramider, sfingomyeliner, bilirubin, kolesterol sulfat, og ulike lysophospholipids. Flere metabolitter identifisert innen bildebehandling studien ble også påvist ved endrede nivåer i serum i en tidligere metabolomic studie av samme mus modell. Som et eksempel arbeidsflyt, funksjoner identifisert i denne studien ble brukt til å bygge en OPLS-DA-modellen er i stand til å skille mellom DKO mus med tidlig stadium svulster og kontroller med opptil 88% nøyaktighet
Citation. Paine MRL, Kim J, Bennett RV, Parry RM, Gallia DA, Wang MD, et al. (2016) Hele Reproductive System Non-Negative Matrix Faktorisering massespektrometri Imaging av et tidlig stadium Eggstokkreft Mouse Model. PLoS ONE 11 (5): e0154837. doi: 10,1371 /journal.pone.0154837
Redaktør: Shengtao Zhou, West Kina Second Hospital, Sichuan University, KINA
mottatt: 28 desember 2015; Godkjent: 20 april 2016; Publisert: 09.05.2016
Copyright: © 2016 Paine et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Alle bilde datafiler er tilgjengelig fra figshare database (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3171715.v1)
Finansiering:. Ovarian Cancer Research Fund (OCRF) Program Project Development stipend ( http: //http: //www.ocrf.org) og en Challenge Grant fra Marsha Rivkin Foundation (http: //http: //www.marsharivkin.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
høyverdig serøs karsinom (HGSC), er en undertype av eggstokkreft også kjent som høyverdig serøs eggstokkreft, ansvarlig for 70% av alle eggstokkreft dødsfall og likevel opprinnelse og tidlige utviklingen av denne dødelige sykdommen er fortsatt dårlig forstått. [1-4] Pålitelige screeningtester i klinisk praksis er for tiden utilgjengelig, og asymptomatisk kurs gjennom tidlige stadier av sykdommen gjør tidlig deteksjon av HGSC ekstremt vanskelig. Følgelig fleste HGSC tilfeller ( 95%), og i forlengelsen flertallet av eggstokkreft tilfeller er diagnostisert på avanserte stadier fører til fattige fem-års overlevelse-ca 44,6% for alle tilfeller diagnostisert i løpet av 2004-2010 [1. , 5-7] Men når kreften er diagnostisert tidlig og er begrenset til den primære svulsten nettstedet, 5-års overlevelse øker til over 90%. [8] det er derfor viktig at tidlig påvisning metoder er utviklet for å bekjempe eggstokkreft kreftdødelighet.
Identifiseringen av biokjemiske endringer i vev fra tidlig til sent stadium HGSC kan være et middel for å velge markører som kan bli overvåket i blod eller urin for tidlig oppdagelse og diagnose. En hovedutfordring i forbindelse med denne tilnærmingen er imidlertid vanskeligheter med å finne pasienter med tidlig stadium eggstokkreft, som tidlige stadier er asymptomatiske. Nyere musemodeller av eggstokkreft, med HGSC opprinnelse i egglederen eller eggstokk, presentere en unik mulighet til å overvinne denne utfordringen. [9-11] Når to kritiske gener betinget deaktivert (
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX
Amhr2
CRE /+), disse dobbel-knockout (DKO) mus utvikler egglederen-stammer HGSCs, som deretter spredte seg til eggstokk før metastasizing gjennom bukhulen, forårsaker ascites og fører til døden. [9] Alternativt dobbel-mutant mus som bærer mutant p53 og
PTEN
sletting produsere eggstokk-stammer HGSCs så vel som ikke-HGSCs i eggstokken med normale egglederne. [10] I tillegg, tre-mutante mus, (
p53
LSL-R172H /+
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX
Amhr2
CRE /+) som omfatter mutant p53, det oftest sett mutasjoner i menneskelig HGSC (~ 97%), også utvikle egglederen-stammer HGSC med identisk mønster av metastaser som DKO mus. Selv om både DKO og TKO modeller duplisere like godt klinisk natur menneskelig HGSC har DKO modellen også blitt karakterisert på molekylært nivå, med DKO HGSC stille molekylær likhet med menneskelig HGSC. Derfor, i denne studien DKO mus ble valgt for videre undersøkelser ved hjelp av massespektrometri-baserte bildeanalyser.
I massespektrometri imaging (MSI), er massespektra registrert ved diskrete romlige punkter over vevsprøve, som fører til en Datacube med et massespektrum for hver (x, y) piksel. To-dimensjonale falske fargebilder som kartlegger den romlige fordelingen av spesifikke analytter er opprettet fra disse dataene. [12] To veletablerte MSI metoder som er brukt til kreftstudier er matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering (MALDI), [ ,,,0],13-18] og desorpsjon electrospray ionisering (Desi). [19-25] Spesielt for eggstokkreft, flere MALDI MSI studier har blitt publisert fokus på både protein og peptid biomarkør identifikasjon. [26-29] Det er bare en rapport fra Liu et al har undersøkt hvilken rolle metabolitter ved hjelp av MSI. [30] i denne studien ble MALDI eksperimenter regissert av transcriptomic analyse og fokusert spesielt på påvisning av sulfatides, en underklasse av glykosfingolipider. Desi MSI, derimot, har bare blitt brukt til studiet av molekylære nivå observerte endringene mellom før og etter eggløsning, men ikke for tidlig kreft biomarkør oppdagelse. [31]
Gitt den enorme mengden av kjemisk informasjon som genereres i MSI, trekke ut det mest biologisk relevant informasjon knyttet til en bestemt faktor kan ikke være grei, krever visuell inspeksjon og sammenligning av hundrevis til tusenvis av bilder for hvert forsøk. For å forenkle MSI dataanalyse, er sammenligning av spektra fra flere regioner eller flere prøver er mulig ved hjelp av region-of-interesse (ROI) utvalg. [32] ROI sammenligninger er grei, gjennomsnitt spektra på hver piksel fra en valgt region, og er best egnet for analyser hvor histologiske grensene er godt definert. Men i tilfeller hvor histologiske grenser er mindre klart, eller når ny biologisk hypotese blir generert, kan manuelt definere ROI oss være utfordrende. I etterforskningen av sykdomsutvikling i store vevssnitt, for eksempel kjemiske markører kan bli tynt fordelt, og ved lave hopetall, noe som gjør sin oppdagelse av ROI valg vanskelig.
Semi-overvåket metoder syssels clustering algoritmer som automatisk tildeler segmentering kartene etter mønstre samlokalisert molekyler kan anvendes i slike scenarier. Men disse metoder fremdeles dele dataene inn i adskilte romlige segmenter og krever at brukeren må inspisere mange individuelle ion-bilder for å bekrefte at de stemmer overens med det tilsvarende segment. [33] Unsupervised metoder basert på statistiske algoritmer er derfor foretrukket for data mining av stor, heterogen vevsprøver, som krever minimal menneskelig inngripen. [34, 35] Slike algoritmer har blitt undersøkt for analyse av MSI datasett inkludert Principal Component Analysis (PCA) [36], Maksimal Autokorrelasjon faktorisering [37], K-Means [38] og Fuzzy C en anordning [39] clustering, Probabilistic Latent semantisk analyse [40], og ikke-negativ Matrix faktorisering (NMF) [41]. Sammenligning av Pearson korrelasjon av utgangskomponent bilder mot sanne eksempler på bilder viste at av alle disse metodene, NMF hadde den høyeste midlere bilde korrelasjon. [35] Også, på grunn av den innebygde ikke-negativitet begrensninger, er NMF komponentbilder lette å tolke og bedre egnet for massespektrometri data enn andre multivariate statistiske metoder, for eksempel PCA. [42, 43]
Heri vi følge opp våre serum metabolomics studie av
dicer-PTEN
DKO mus med en DESI MSI studie av den komplette reproduktive system av samme musemodell. [44] DESI MSI multivariat dataanalyse ble utført med en ny versjon av omniSpect [45], nå er i stand til å håndtere store (~ TB) MSI datasett. Ved å skille MSI data i flere NMF komponenter via omniSpect, ble funksjoner som representerer metabolomic endringer mellom sunt og kreftvev lett visualisert. Den tilsvarende NMF «komponent spektra» beskriver disse bildene ble deretter undersøkt, identifisere kjemiske stoffer endret i HGSC svulstens mikromiljø, flere av dem hadde også tidligere blitt oppdaget på serumnivået. [44]
Materialer og metoder
dicer-PTEN Dobbelt Knockout (dicer-PTEN DKO) Mus
dicer-PTEN
DKO (
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX
Amhr2
Cre /+) mus ble generert ved å parre hanner (
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX
Amhr2
CRE /+) med kvinner (
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX). Kvinne
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX (en genotype ikke bærer
Amhr2
cre /+) mus ble brukt som kontroller. Alle mus ble hentet fra in-house avl på Baylor College of Medicine og ble plassert i et vivarium med en kontrollert temperatur på 21 ° C. De ble matet 5053 bestrålt PicoLab Rodent Diet 20 og hadde tilgang til drikkevann leveres i flasker.
dicer
FLOX /FLOX
PTEN
FLOX /FLOX
Amhr2
cre /+ DKO mus brukt i denne studien utvikle ascites som svulster metastaserer . Når mus begynt å vise tegn på ascites, ble de overvåket daglig. Mus ble anbefalt for eutanasi når ascites volumet nådde 10% av dyrets kroppsvekt. Alle mus brukt i denne studien (10 i alt) ble avlivet før den når grensen for eutanasi via en overdose inhalering av karbondioksyd for å hindre unødig smerte og ubehag i henhold til dyret av protokollen (AN716) godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Baylor College of Medicine.
Prøvepreparering
hele reproduktive system av DKO mus (inkludert livmor, eggledere og eggstokker) ble skåret ut og flash fryst ved -80 ° C. Det intakte skåret vev ble innleiret i en vandig løsning av gelatin (10% w /v) og karboksymetylcellulose (5% vekt /volum) og frosset ved -80 ° C. Innebygde vevsblokker ble plassert i kammeret av en Cryostar NX70 kryostat (Thermo Scientific Inc., San Jose, CA, USA) i 30 minutter og deretter seksjonert ved 20 mikrometer tykkelse med både skjæreblokken og prøveblokk holdt ved -20 ° C . Vevssnitt ble tøvær montert på Superfrost Plus Micro Slides (VWR International LLC., Radnor, PA, USA) og holdt ved -80 ° C inntil analyse.
desorpsjon electrospray ionisering-massespektrometri Imaging
Desi-MS-bildene ble anskaffet ved hjelp av en spesialbygd ion kilde som består av et Omni Spray Desi sprøyta (Prosolia Inc., Indianapolis, IN) i stand til finjusteringer ved bruk av manuelle trinn og multiaksede plattformer (Thorlabs, Inc., Newton, NJ). De følgende DESI-MS geometriske og eksperimentelle variabler ble optimalisert for avbildnings eksperiment: høyden av sprøytespiss ovenfor flaten (5 mm), innfallende vinkel (55 °), sprøyter-tip avstand fra MS innløp (15 mm), innløp høyde over flate (mindre enn 1 mm), spray løsningsmiddel (metanol), oppløsningsmiddel strømningshastighet (5 mL min
-1), forstøvning av gass (nitrogen), forstøvning av gasstrykket (100 psi), og spray spenning (kV -5) . Den massespektrometer innløp brukt var spesielt designet for Desi-MS bildebehandling og stikker 18 cm fra fronten av instrumentet, noe som gir tilgang til større prøveflater.
Mens Desi sprøyta og MS-inntak ble holdt i ro, prøven å bli fotografert ble flyttet i en «kam» formet sti, slik at Desi sprøyta til raster hele prøven overflaten i 2-dimensjoner ved hjelp av en Optiscan II motorisert mikroskop scenen (Før Scientific Inc., Rockland, MA) styrt av en LabVIEW VI program . beskrevet tidligere [19, 45] scenen hastighet ble satt til 160 mikrometer s
-1 i
x
-dimension med en linje trinn på 200 mikrometer i
y Anmeldelser – dimensjon. Negative-ion massespektra ble kjøpt på en Exactive Plus Orbitrap massespektrometer (Thermo Scientific, San Jose, California) over området
m /z
400-1000 i Tyngdepunktet modus etter å optimalisere de følgende eksperimentelle variabler: masse oppløsning (17500 på
m /z
200), automatisk styrkekontroll mål (1e
6 ioner), microscans per skanning (2), s-linse spenning (75 V), maksimal injeksjon tid (100 ms), og kapillær temperatur (250 ° C).
data Processing
MS bilde datafil som en enkelt, kontinuerlig oppkjøp, sammen med LabVIEW tid og utgang posisjons filer ble lastet opp til omniSpect web-basert server (https://cs.appstate.edu/omnispect).[45] fra LabVIEW-genererte scenen posisjon og tidsinformasjon, skaper omniSpect et bilde kube linje for linje ved hjelp av massespektra samlet på den første passere langs kammen-formet bane. De opprinnelige massespektra er lineært interpolert på en jevnlig fordelt rutenett langs x-aksen. [46]
For innsamlede spektra, omniSpect første anslår en full profil ved hjelp av et felles logaritmisk linjeavstand
m /z
målestokk for alle skanninger og bruke en liten Gaussian vindu rundt hver topp. Vi brukte et standardavvik på
m /z
0,001 og en bin-bredde på
m /
z 0,0005 på
m /z
850 for disse dataene. Generelt redusere bin-bredde gjør at Gaussian sentrum til mer nøyaktig representerer tyngdepunktet data peak sentrum (
i
.
e
., Den eksperimentelle
m /z
verdi) med omliggende hyllene blir fylt for å få plass til masseskift i løpet av forsøket. Standardavviket tilsvarer derfor den tolerert varians denne massen skift og representerer de forventede toppbredden hvis dataene ble samlet inn i profilen. Presisjonen for centroided data er konfigurerbart i den nyeste versjonen av omniSpect (https://cs.appstate.edu/omnispect/) med tre forhåndsinnstillinger:
m /z
± 0,1, 0,01 og 0,001. På det høyeste presisjon, genererer denne tilnærmingen datakuber med svært store dimensjoner, men svært sparsommelig data. For eksempel, typisk mus MSI data produsert et bilde kube av størrelse [805 × 59 × 2556741] som ville kreve 904 GB hvis lagret som dobbel presisjon verdier. Fordi bare 0,06% av elementene er ikke-null, ved hjelp av en glissen matriserepresentasjonen resulterer i filer som krever mindre enn 2 GB minne.
Gitt en MSI datakuben, NMF modeller hver komponent spektrum som den ikke-negative lineær kombinasjon av kilde-spektra og hver komponent ion bilde som den ikke-negative lineær kombinasjon av kildebilder. For eksempel kan kilden spektra i en gitt vevsprøve hører til forskjellige ioner kombinasjoner eller «komponenter», som fremstilles ved forskjellige vevstyper, som hver opptar forskjellig, men muligens korrelerte romlige fordelinger. NMF gjenoppretter de ikke-negative komponent spektrene og romlige fordelinger ved å minimalisere differansen mellom det modellerte og de observerte data.
Først blir 3-D datakuben omdannet til en 2-D matrise av vectorizing pikselkoordinater i en enkelt dimensjon. Brukeren velger antall komponenter for å trekke ut og NMF anslår dem. Blant de mange algoritmer for NMF, bruker vi den vekslende Least Squares (ALS) tilnærming for å minimalisere den Frobeus normen [47]: hvor V representerer datamatrise, W betegner komponentbilder, og H representerer komponenten massespektra. Hver kolonne av W og tilsvarende raden av H representerer den romlige fordeling og massespektra fra en komponent, henholdsvis. Deres produkt, WH, representerer lineær kombinasjon av komponenter som er omtrent dataene. Algoritmen starter ved initialisere H med positive verdier. Deretter løser det for W som minimerer
D
for fast H ved hjelp av minste kvadraters løsning: der # representerer Moore-Penrose pseudoinverse. Noen negative verdier i W er erstattet med nuller, og prosessen gjentas for H. Spesielt
D
blir minimalisert for den nye verdien av W:
Igjen negative verdier er erstattet med nuller, og prosessen gjentas, alternerende mellom W og H til konvergens. Etter estimering, er komponentbilder representert som to-dimensjonale falsk-fargeplottene og den relative overflod av ioner innenfor spektrene er normalisert til basetopp innenfor settet av NMF komponenter. [47]
Data Analysis
Masse spektrale egenskaper fra fjerde NMF komponenten ble kryss-referert med ut og kuratert liste over spektrale egenskaper oppnådd følgende UPLC-MS analyse av serum fra 14 tidlig stadium svulst (ET) DKO mus og 11 kontroller. [ ,,,0],44] UPLC-MS spektrale features ble hentet fra data ved hjelp MZmine 2.0-programvare [48] og involvert kromatogram justering, peak identifikasjon og integrering, toppareal utvinning, og normaliseringen etter konservering av datamatrise. Konservering av data besto av fjerning av signaler som var til stede i de blanke prøvene, oppløsningsmidlet, eller var ikke til stede i minst 50% av serumprøvene. Masse spektrale egenskaper overlappende mellom den valgte NMF komponenten og kuratert UPLC-MS liste ble brukt til å bygge en modell for prøve klasse diskriminering via ortogonale Partial Least Squares diskriminant analyse (OPLS-DA) ved hjelp av MATLAB (MATLAB versjon 7.13.0, The MathWorks, Natick, MA med PLS_Toolbox v.6.71, egenvektor Research, Wenatchee, WA).
Resultater
Fire
dicer-PTEN
DKO mus i en alder av 8 måneder ble avlivet, og intakte reproduktive organer ble samlet. vist en mus en stor primær tumor med et blodfylt cyste ved enden av en livmorhorn og et sunt eggstokk med en pre- eller ikke-kreft cyste i den andre livmorhorn (figur 1A). Denne prøven ble valgt for MSI analyse som det ble antatt at ved å avbilde den sunne eggstokk, pre-eller ikke-kreft cyste, og moden svulst sammen, kan direkte spektrale sammenligninger gjøres mellom de ulike vev regioner. Ulik spektrale komponenter detekteres, spesielt de som er lokalisert inne i svulsten /cyste region, kan deretter bli karakterisert og testet for deres biologiske rolle eller som potensielle markører for sykdom.
(a) Fotografi av en tynn vev seksjon av en DKO muse reproduktive systemet tine-montert på en glassplate. (B) En-komponent-NMF bilde som representerer DESI-MS negativ-ion-modusdata for DKO mus reproduktive system, og (c) det tilsvarende NMF spektrum. (D) Den totale ion strømmen (TIC) image for desi-MS negativ-ion modus data og (e) den tilsvarende TIC spekteret.
En negativ-ion modus Desi-MS-bildet ble tatt fra en 20 uM tykk seksjon av den komplette reproduksjonssystemet skåret ut fra nevnte DKO mus. Figur 1 viser et optisk bilde av vevsprøve sammen med den falske fargebilde og tilsvarende spektra for både den totale ion chronogram (TIC) og en-komponent NMF resultat. Sammenligning av både bilder og spektra illustrere hvor tett ALS algoritmen kan tilnærme data kube faktorene og dermed hvor godt NMF resultatene representerer den sanne data. Bildene som er presentert i figur 1B og 1D er like, men ikke identiske, som NMF tilnærmet hvert spektrum i dette bildet som en skalert versjon av en komponent spektrum. Regioner av komponenten bilde NMF som ikke samsvarer TIC bildet indikerer disse regionene har spektra som skiller seg fra TIC spekteret. For eksempel svulst /cyste region til høyre viser en høyere intensitet på falske fargeskala i TIC bildet, men den gjennomsnittlige spekteret for regionen ikke er modellert godt av «gjennomsnittlig» spektrum for hele bildet. Derfor, til sammenligning, er svulsten /cyste regionen representert med lavere relativ intensitet på falske fargeskala i enkeltkomponenten NMF bilde. Men spektra i figur 1C og 1E er nesten identisk med topplistene og relative Forekomsten bevart. Progressivt segmentere dataene i to eller flere komponenter ved hjelp av NMF kan derfor gi meningsfulle resultater om biologiske forskjeller knyttet til sykdomsprogresjon ved å avsløre disse spektrale forskjeller. Bestemme optimale antall NMF komponenter slik som å modellere true biologisk variasjon mens avvise uønsket støy, teknisk variasjon, og gjenstander er dermed viktig for å forstå nivået av nyttig informasjon i disse dataene.
2A og 2C-show resultatene fra splitting av dataterningen i to NMF komponenter. Bildet i figur 2A likner på figur 1B med base topp på
m /z
885,5436 dominerer tilsvarende spektra for begge bildene. Den nøyaktige massen av denne toppen antyder det tilsvarer [MH]
– ion av en phosphatidylinositol (PI) med 38 totalt karboner og 4 totalt dobbeltbindinger i acylkjedene (Theo [MH]
-;.
m /z
885,5499). Dette lipid art er en av de mest tallrike av sure fettarter som er tilstede i pattedyrcellemembraner og blir rutinemessig påvist ved utførelse MSI fra pattedyrvev. [49] Den mest merkbare forskjell mellom figurene 2A og 1B er den reduserte signalintensiteten i figur 2A innenfor svulst /cyste region. Figur 2C viser den andre NMF komponent og viser en sterk kontrast til den første NMF komponent, med økte signalintensiteter i tumor /cyste region og redusert intensiteter i sunn eggstokk-regionen. Fig 2d viser det tilsvarende spektrum for bildet i figur 2C, avslører de artene som bidrar til den økte signalintensitet innenfor tumor /cyste region. Det ble observert tre store arter i figur 2D på
m /z
572,483, 682,589 og 684,595. For de arter på
m /z
572,483 og 684,595, ble en 2 M + topp ble observert ved en relativ overflod forhold på 3: 1, noe som tyder på tilstedeværelsen av en kloratom innenfor hver art. For
m /z
682,589, M + 2 signal overlapper med de artene på
m /z
684,595. Artene på
m /z
684,595 har en relativ overflod mye høyere enn forventet for
37Cl isotop av
m /z
682,589. Derfor er ioner på
m /z
684,595 tilskrives en egen kjemiske stoffer med mulig bidrag fra en
37Cl isotop. Interessant nok har disse tre ionene ble også påvist i en studie som undersøkte cellulære lipidekstrakter fra murine tumorcellelinjer ved ESI-MS, og ble identifisert som [M + Cl]
– ioner av C16, C24: 1, og C24: 0 ceramider (Theo.
m /z
572,4815,
m /z
682,5911, og
m /z
684,6067, henholdsvis). [50] heving av disse tre metabolitter har blitt rapportert å være involvert i tumor-indusert dendrittisk celle apoptose ved nedregulering av fosfoinositid-3-kinase (PI3K) svei. [50] ved å frigjøre disse immunundertrykkende signaleringsforbindelser, skaper svulsten en gunstig mikromiljøet hvorved det kan unngå vertens immunrespons og sprer. [51]
de resulterende NMF komponent bilder (a) og (c), og tilsvarende spektra (b) og (d) fra å splitte negative-ion modus oppkjøpet Desi-MS i to NMF komponenter. (E) TIC bilde fra samme datasettet som viser region-of-interesse (ROI) manuelt valgt for tidlig stadium svulst og blodfylt cyste områder (rød oval) og (f) den tilsvarende gjennomsnitt spekteret fra avkastningen. (G) TIC bilde som viser den region-of-interesse (ROI) er valgt for tidlig stadium svulst stedet bare (rød oval) og (f) den tilsvarende gjennomsnitt spekteret fra avkastningen.
Region-of-interesse (ROI) spektra fra den kombinerte tidlig stadium svulst og blodfylt cyste region (fig 2E) og tidlig stadium svulst av seg selv (figur 2G) ble hentet fra data kuben ved hjelp av et MATLAB script for sammenligning til den tilsvarende NMF-komponenten bilde. Ved manuelt å velge en avkastning for et bestemt vev regionen, er et gjennomsnitt spektrum generert fra spektra for hver piksel innenfor det valgte området. Den andre NMF komponent spektrum (figur 2D) og ROI spektrum (figur 2F) deler en høy grad av likhet, med alle de store ioner oppdaget i ROI spekteret også til stede i NMF komponent spekteret, men med små forskjeller i relative abundances . oppstår store forskjeller observert mellom figur 2D og 2F grunn av NMF legger større vekt på kombinasjoner av arter oppdages med høyere grad av variasjon fra andre deler av bildet. For å bekrefte at de store topper som er identifisert i figur 2D og 2F faktisk er til stede i den tumor-regionen og er ikke bare forbundet med den biologiske forskjeller mellom blod og fast vev, en ROI spekteret for tidlig stadium tumor uten blodfylte cyste er vist på fig 2H. Den tilsvarende ROI spekteret inneholder alle toppene som finnes over 5% relativ overflod i Fig 2D. Men i figur 2H de samme toppene er til stede på mye lavere relative hopetall på grunn av de svært rike membranlipider,
i
e
, PI.. (38: 4) på
m /z
885,54. ROI metoden gir en mer nøyaktig representasjon av alle artene som finnes i det valgte området; men NMF kan isolere arter som skiller mellom regioner, potensielt hjelpe til oppdagelsen av arter med relativt lave hopetall som kan endres. Dette attributtet er avgjørende i å prøve å identifisere sykdomsprogresjon gjennom vev uten tilsyn brukermedvirkning for å definere grensene mellom sykt og friskt vev.
Dele datasettet inn i tre, fire og fem NMF komponenter (S1 og S2 Fiken, og fig 3, henholdsvis) progressivt atskiller signalene som blir utpreget i forbindelse med tumor /cyste region fra resten av det friske vevet. Det som fremkommer er et bilde i første rekke som representerer den sunne eggstokk, ett eller flere bilder (avhengig av antall komponenter er valgt) oppviser forskjellige ion fordelinger gjennom livmoren og sunne eggstokk, og et bilde som viser forhøyede arter i tumor /cyste region. Spektrene tilsvarer den friske eggstokk-komponenten bilde (figur 3C) som virker som vår pseudo-kontrollprøve for dette eksperimentet er dominert av den ion ved
m /z 885,5436
med alle andre ioner observert ved en relativ overflod av 5% eller mindre. Den progressive NMF faktorisering av signalene som bidrar til livmoren (fig 3A, 3E og 3I) viser en lavere relativ overflod av ion på
m /z
885,5436 enn Fig 3C. I tillegg er en større relative bidraget fra andre ioner i disse spektra observert, spesielt de i lipid regionen mellom
m /z
600-1000 fra potensielle fosfatidyletanolaminer (PE;
m /z
716.5247, 722,5070, 746,5053, 766,5324, og 794.5395), fosfatidylseriner (PS;
m /z
788,5369, 810,5229, 834,5229), fosfatidylglyceroler (PG;
m /z
747,5108), og fosfatidylinositoler (PI;
m /z
833,5120, 857,5111, 909,5489). [49]
av de fem NMF komponentbilder, viser figur 3A høyest intensitet i svulsten regionen. Imidlertid, viser figur 3A også en forholdsvis høy korrelasjon til NMF komponenten spektra (figur 3B) gjennom mesteparten av vevet delen. Selv om toppene i figur 3B er forhøyet i den tumor-regionen, er de ikke nødvendigvis er ideelt biomarkører for å skille mellom tumor og friskt vev. Dette støttes av flertallet av toppene som er identifisert i figur 3B er vanlige pattedyrcellemembranlipider som er kjent for å være forhøyet på grunn av en øket hastighet av lipidsyntese i cancervev. [52] På den annen side, viser figur 3G en mye større relativ forskjellen mellom tumor /cyste region og resten av vevet delen. Det er sant at de høyeste intensitet, og de fleste av de mest intense pikslene er observert i cyste, men det er fortsatt et betydelig antall av piksler med forhøyet intensitet i tumor-regionen. Som komponent bildet i figur 3G nesten utelukkende viser tumor /cyste region med minst mulig bidrag fra andre vev-områder, bør denne komponenten være meget representativ for metabolske endringer i tumormikromiljøet. De tre gjenværende NMF komponenter beskrive antagelig ikke-kreft regioner av vev (
i
.
e
., Sunt eggstokk og flertallet av livmoren). Derfor er den komponent bildet i figur 3G forventes å inneholde minimalt bidrag fra kjemiske stoffer ikke er spesifikke for kreft biologi, med det tilsvarende spektrum er vist på figur 3H.
Utførelsen av NMF som en ukontrollert segmenteringsalgoritme anvendt for å MSI-data ble fastslått ved sammenligning med en mer typisk gruppering algoritme, for eksempel k-means. K-Means resultater fra segmentere MSI datasettet inn i
k
= 5 klynger er vist i S3 fig. Fire av de fem K-Means klynger var romlig og spektralt veldig lik den NMF resultatene observert i figur 3, med blod-fylt cyste, sunt eggstokk, og gjenværende vev alle delt inn i separate grupper. For K-midler analyse, en av klyngene inneholdt store bidrag fra den kjemiske bakgrunnssignalet, og derfor at klynge korrelert romlig med området utenfor den biologisk vev. Segmentering av denne bakgrunnen regionen ble ikke observert innenfor NMF resultatene, i stedet livmoren ble delt opp i tre segmenter (sammenlignet med to med k-means). Det er åpenbart at NMF er mer egnet for MSI dataanalyse som NMF gir graden av korrelasjon av hver piksel til den spektrale tilnærmelse angitt for hver enkelt komponent, mens K-midler gir bare en binær indikasjon for hvert bildeelementer inkludering til den bestemte klynge. Dermed NMF bilder gir en mer informativ beskrivelse for MSI data enn k-means.
For å illustrere selektiv kraft NMF, ioner som oppdages innen svulsten spekteret på en overflod av ≥ 5% i forhold til basistopp er
