Abstract
caspase rekruttering domene familien, medlem 8 (CARD8) kan koordinere medfødte og ervervede immunresponser og bevisst celler til apoptose, som kan delta i tumorigenesis av virus-indusert leverkreft (HCC) og livmorhalskreft . Ved bioinformatikk analyser, identifiserte vi flere enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i en ny identifisert lang ikke-kodende RNA (lncRNA) som uttrykk kvantitativ egenskap loci (eQTLs) for CARD8. I denne studien har vi derfor antatt at CARD8 eQTLs SNPs innenfor lncRNA kan påvirke risikoen for HCC og livmorhalskreft. Vi utførte to uavhengige case-control studier av 1300 tilfeller med HBV-positiv HCC og 1,344 normale kontroller, sammen med 1,486 livmorhalskreftpasienter og 1536 kontrollpersoner for å teste sammenhengen mellom eQTLs SNP (rs7248320) for CARD8 og risikoen for HCC og livmorhals kreft. Varianten genotype av rs7248320 var signifikant assosiert med økt risiko for HCC og livmorhalskreft [GG vs AA /GA: justert odds ratio (OR) = 1,28, 95% konfidensintervall (KI) = 1,03 til 1,61,
P
= 0,028 for HCC; justert OR = 1,34, 95% CI = 1,09 til 1,66,
P
= 0,006 for livmorhalskreft]. Videre effekten av rs7248320 på livmorhalskreftrisiko var mer fremtredende hos premenopausale kvinner. Videre interaktiv analyse oppdaget en betydelig multiplikativ samspill mellom rs7248320 og menopausal status på livmorhalskreft risiko (
P
= 0,018). Disse funnene tyder på at CARD8 eQTLs SNP kan tjene som en mottakelighet markør for virus-relaterte HCC og livmorhalskreft
Citation. Yin J, Wen J, Hang D, Han J, Jiang J, Song C, et al . (2015) Expression Quantitative Trait Loci for CARD8 Bidrar til Risk of Two infeksjonsrelaterte Kreft-leverkreft og livmorhalskreft. PLoS ONE 10 (7): e0132352. doi: 10,1371 /journal.pone.0132352
Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Suzhouuniversitetet, KINA
mottatt: 31 mars 2015; Godkjent: 14 juni 2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Yin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Fund fra Natural Science Foundation National of China (81172757); National Science Foundation for Distinguished Unge Forskere i Kina (81225020); National Natural Science Fund fra Natural Science Foundation of China National (81373079); Foundation i Jiangsu-provinsen for Distinguished Young Scholars (BK2012042); National Key Basic Research Program For ungdom (2013CB911400); Fundamentet for Program for New Century gode talenter i University (NCET-10-0178); Nasjonalt program for støtte av Top-notch Young Professionals; Jiangsu-provinsen Clinical Science and Technology Projects (BL2012008); Collaborative Innovation Center For Cancer personlig medisin i Jiangsu-provinsen og Prioritet Academic Program for utvikling av Jiangsu høgskolerådet (Public Health og forebyggende medisin); National Natural Science Fund fra Natural Science Foundation of China National (30901236); Beijing Natural Science Foundation (7123225); Beijing Nova Program (xx2012067); Scientific Research Foundation for Returnerte Scholars, utdanningsdepartementet i Kina for gjennomføring av forskning og forberedelse av artikkelen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) og livmorhalskreft er to mest vanlige krefttyper over hele verden. I 2008 ble det anslått at mer enn 80% av HCC og livmorhalskreft tilfellene skjedde i utviklingsland, inkludert Kina [1,2]. Vedvarende Hepatitt B-virus (HBV) og humant papillomavirus (HPV) infeksjon har blitt godt etablert som risikofaktorer for lever [3] og livmorhalskreft [4]. Imidlertid kan bare en liten brøkdel av virale bærere vedvarende etterhvert utvikle kreft, noe som tyder på andre faktorer kan påvirke kliniske resultater etter virusinfeksjoner. Det ble rapportert at verts genetiske variasjoner spille en avgjørende rolle i kreftutvikling av HCC og livmorhalskreft [5,6].
caspase rekruttering domene familien, medlem 8 (CARD8) representerer et nytt medlem av caspase-forbundet rekrutterings domener (KORT) familie, som er protein-protein interaksjon moduler funnet mye i proteiner som spiller viktige roller i apoptose og nukleær faktor kappa-B (NFkB) aktivering [7]. Defekter i apoptose er sett i nesten alle typer kreft hos mennesker [8]. CARD8 kan undertrykke aktiviteten av NFkB aktivert ved inflammatoriske mediatorer [9]. Videre aktivering av NFkB, et kjennetegn på inflammatorisk respons, blir ofte påvises i tumorer og kan utgjøre en manglende sammenheng mellom betennelse og kreft [10,11], og det er avgjørende i utviklingen av virus-induserte kreftformer, inkludert HCC og livmorhalskreft [11-13]. For eksempel, aktivering av NFkB signaltransduksjon krever interaksjon mellom hepatitt B-virus X-protein og onkogen AIB1 [14], og humant papillomavirus 16 E5 oncoprotein medierer cervical karsinogenese via oppregulering av COX-2 ekspresjon gjennom NFkB [11].
lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) er definert som ikke-protein-koding transkripsjoner større enn 200 nukleotider. De kontrollerer genuttrykk i kjernen ved å modulere transkripsjon eller via post-transkripsjonsmekanismer rettet mot spleising, stabilitet, eller oversettelse av mRNA [15]. LncRNA AC008392.1 er en av nylig identifiserte lncRNAs, som finner i oppstrømsområdet av CARD8 i det nittende kromosomet, og er uttrykt i flere cellelinjer slik som GM12878 (human B-lymfocytt) og HeLaS3 (menneskelige cervikale kreftceller). Ved bioinformatikk analyser identifiserte vi to enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) (rs7248320 og rs12459322) i AC008392.1 kan representere uttrykket kvantitativ egenskap loci (eQTLs) for CARD8 (https://www.regulomedb.org) [16]. Det er mulig at SNP påvirke interaksjonen mellom AC008392.1 og CARD8, for derved å endre ekspresjonen av CARD8. Her, hypotese vi at CARD8 eQTLs SNP’er kan bidra til å modifisere risikoen for to virusrelaterte HCC og livmorhalskreft. For å teste vår hypotese, gjennomførte vi to uavhengige case-control studier inkludert 1300 tilfeller med HBV-positiv HCC og 1,344 kontrollpersoner, samt 1,486 livmorhalskreft og 1536 kontrollpersoner å vurdere sammenhengen mellom eQTLs SNPs for CARD8 og i hvilken grad de to kreft.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
Denne studien ble godkjent av etisk komité of Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences og Nanjing Medical University . Alle deltakerne gi sine skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien og de etiske komiteer godkjente samtykket prosedyren. Fagenes påmelding ble beskrevet tidligere [17-20].
I korthet HCC pasienter ble fortløpende rekruttert mellom januar 2006 og desember 2010 på Nantong Tumor Hospital, Qidong Liver Cancer Institute, og den første Affiliated Hospital of Nanjing Medical University of Jiangsu-provinsen i Kina. Diagnosen HCC ble underbygget av en patologisk undersøkelse og /eller alfaføtoprotein høyde ( 400 ng /ml) kombinert med magnetic resonance imaging og /eller datastyrte tomografi. Fordi HCV-smitte er sjelden i kinesiske populasjoner, ble HCC pasienter med HCV-infeksjon utelukkes. Som et resultat av 1300 HBV-positive pasienter HCC samtykket til å delta i studien. Fra september 2009 til mars 2010, 149,172 innbyggere, som var bosatt i femti-to landsbyer i provinsen Jiangsu, Kina i minst ett år, ble inkludert i et samfunn basert tverrsnittsstudie. Blant dem, totalt 11,474 deltakerne var HBsAg seropositive. Etterpå fra september til november 2010, 8,006 personer (69,8%, 8006/11474) som ble enige om å være regelmessig fulgt opp hvert 1-2 år ble kalt tilbake og sjekket hepatitt virus seromarkers igjen. Til slutt ble 7,250 personer som var HBsAg seropositive med dobbelt prøver samling i minst seks måneders intervall, negative for HCV og ha informasjon om antiviral terapi registrert samfunnet basert kohort. Blant dem, ble totalt 1,344 pasienter tilfeldig valgt som kontrollene fungerte som en sammenligningsgruppe av HCC tilfeller. Alle kontrollene var HBV vedvarende bærere som var positive for begge HBV overflateantigenet (HBsAg) og antistoff mot hepatitt B-kjerneantigen (anti-HBc), men negativ for HCV antistoff (anti-HCV). Ingen historie av HBV vaksinasjon ble rapportert for disse fagene. Disse utvalgte kontroller ble matchet til HCC tilfeller på alder (± 5 år) og kjønn, og erklærte ingen tidligere malignitet.
For livmorhalskreft studien, 1,486 histologisk-bekreftet livmorhalskreftpasienter ble fortløpende rekruttert mellom mars 2006 til desember 2010 fra tumor Hospital Nantong og First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu, Kina. De 1536 kontroller ble også tilfeldig valgt fra en kontroll bassenget mer enn 40.000 personer som deltok i et annet community-baserte screeningprogram for ikke-smittsomme sykdommer gjennomført i Jiangsu-provinsen med oppfølging sats på 98,1%. Kontrollene var frekvens-tilpasset sakene på alder (± 5 år). Alle kontrollene hadde ingen selvrapportert kreft historie.
Etter skriftlig informert samtykke ble innhentet, ble hver deltaker planlagt for et intervju ved hjelp av et strukturert spørreskjema for å samle informasjon om demografiske data, menstruasjons og reproduktiv historie, og miljøeksponering historie. Personer som røykte en sigarett per dag i mer enn ett år ble definert som røyker, og de som forbrukes en eller flere alkohol drinker per uke i mer enn 6 måneder ble kategorisert som drikker alkohol. Alle pasienter og kontroller var urelaterte etniske Han-kinesere. Etter intervjuet ble en venøs blodprøve av omtrent 5 ml fra hver deltaker (HCC pasient, livmorhalskreftpasient og kontroll).
serologisk testing
HBsAg, anti-HBc og anti-HCV ble oppdaget fra hver deltakers serum av enzymet bundet immunosorbent assay (Kehua Bio-Engineering Co, Ltd, Shanghai, Kina) etter produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [17].
SNPs Utvalg og Genotyping
Basert på data fra UCSC database (GRCh37 /hg19), Regulome database og kriteriene for mindre allelet frekvens (MAF) 0,05 i Han-kinesere, fant vi to vanlige eQTLs SNPs for CARD8 i nærheten lncRNA AC008392.1. De to CARD8 eQTLs SNPs (rs12459322 og rs7248320) er i høy koblingsulikevekt (LD) (D «= 1,000). Derfor vi valgte rs7248320 som tagging SNP. Genomisk DNA ble ekstrahert fra en leukocytt-pellet ved tradisjonell proteinase K-fordøyelse, og etterfulgt av fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling. SNP rs7248320 ble genotypet med Sequenom MassARRAY iPLEX plattform (Sequenom Inc). Informasjonen på primere er vist i tabell 1. Den genotyping ble utført blindt uten å vite status for saken eller kontroll. To tomme (vann) kontroller i hver 384-brønners plate ble brukt for kvalitetskontroll og mer enn 10% prøvene ble tilfeldig valgt ut til å bli gjentatt, noe som gir en 100% samstemmighet.
Statistical Analysis
Forskjeller av demografiske karakteristika og genotypefrekvensene av SNP rs7248320 mellom sakene og kontrollene ble beregnet av t-test (for kontinuerlige variabler) og χ
2 test (for kategoriske variabler). Assosiasjoner mellom genotyper og kreftrisiko ble estimert ved å beregne odds ratio (OR) med 95% konfidensintervall (CIS) fra logistisk regresjonsanalyse. Heterogenitet assosiasjoner mellom undergrupper ble vurdert av χ
2-baserte
Q
test. Alle statistiske analyser ble utført med R-programvaren (versjon 2.13.0; R Foundation for Statistiske Computing). Alle testene var tosidig og kriteriet om statistisk signifikans ble satt til
P
0,05.
Resultater
De demografiske kjennetegn ved 1300 HBV-positiv HCC pasienter og 1,344 kontrollpersoner, og 1,486 livmorhalskreftpasienter og 1536 kontrollpersoner ble beskrevet tidligere (tabell 2 og 3) [ ,,,0],17-20]. Det var ingen signifikante forskjeller i andelen av alder, kjønn og røyking mellom HCC tilfeller og kontroller. Men andelen av drikking var signifikant høyere i HCC tilfeller enn i kontrollene (
P
0,001). Sammenlignet med kontrollpersoner, de livmorhalskreftpasienter hadde signifikant høyere andel av røyking (
P
0,001), premenopausale status (
P
= 0,002), og høyere paritet (
P
= 0,001).
genotypen distribusjoner av rs7248320 i pasienter og kontroller ble vist i tabell 4. genotypefrekvensene av rs7248320 var i Hardy-Weinberg likevekt i kontrollene (
P
= 0,718 for HCC kontroller og
P
= 0,343 for livmorhalskreft kontroller). I de multivariate logistiske regresjonsmodeller, ble rs7248320 variant genotype GG assosiert med økt risiko i HCC av 1,28 ganger (95% CI = 1,03 til 1,61,
P
= 0,028) sammenlignet med genotypene AA /GA. Tilsvarende økte GG genotype risikoen for livmorkreft ved 1,34 ganger (95% CI = 1,09 til 1,66,
P
= 0,006) sammenlignet med de genotypene AA /GA (tabell 4).
Sammenhengen mellom rs7248320 og risikoen for HCC ble videre undersøkt i stratifisert analyse (tabell 5). I recessiv modell, risikoen effekt for rs7248320 var litt mer fremtredende hos yngre pasienter (≤ 53 år), mannlige fag, og de som aldri hadde røykt. Imidlertid heterogenitet testen var ikke signifikant for disse strataene. Tabell 6 vises foreningen av rs7248320 med risiko for livmorhalskreft. Selv om risikoen effekt for rs7248320 var litt mer uttalt blant yngre kvinner (≤ 53 år), fag som aldri hadde røykt, fag som ikke hadde noen familiehistorie med noen kreft, og mindre paritet (0 ~ 1), ingen heterogenitet mellom disse lagene var observert. Interessant nok var en sterkere risiko effekt av rs7248320 observert blant premenopausale kvinner (justert OR = 1,82, 95% CI = 1,33 til 2,48) (
P
= 0,014 for heterogenitet test). Ved ytterligere interaktiv analyse, ble det observert en signifikant multiplikativ samspill mellom rs7248320 og menopausal status for risikoen for livmorhalskreft (
P
= 0,018). Den crossover analysen antydet at sammenlignet med overgangsalder kvinner med genotypene AA /GA, premenopausale kvinner med genotype GG hadde høyest risiko for livmorhalskreft (justert OR = 3,18, 95% CI = 2,24 til 4,52,
P
0,001) (tabell 7).
Diskusjoner
i disse to uavhengige case-control studier undersøkte vi sammenhengen mellom rs7248320 og mottakelighet for HCC og livmorhalskreft fra en kinesisk befolkning. Vi fant ut at eQTLs SNP rs7248320 for CARD8 var assosiert med økt risiko for HCC og livmorhalskreft. Videre er en betydelig multiplikativ samspill mellom rs7248320 og menopausal status for risikoen for livmorhalskreft ble også observert.
Siden KODE Project og RNA-seq analyse har identifisert tusenvis av nye lncRNAs, genetiske varianter og biologisk funksjon av lncRNAs blir hot spot i studier av komplekse sykdommer. Flere studier har rapportert at flere lncRNAs ble dysregulerte i HCC og livmorhalskreft, som hotair og MEG3 [21-25]. Dessuten, vi tidligere rapportert at ZNRD1 eQTLs SNPs økte risikoen for HCC [20]. LncRNA AC008392.1 lokaliserer i oppstrøms regionen CARD8, noe som kan påvirke uttrykket av CARD8. En tidligere studie viste at den varianten genotype av rs7248320 og rs12459322 var assosiert med ned-uttrykk for CARD8 i monocytter [26]. Det er bevis som tyder på at CARD8 er en negativ regulator av NFKB aktivering, noe som resulterer i undertrykkelse av immunsystemet og inflammatoriske [27,28]. I tillegg til reduksjon av CARD8 antyder en reduksjon i anti-apoptotiske forsvar [29]. Aktivering av NFkB signalering bidrar til kreftutvikling og fremmer sykdom prognose og metastaser i HCC og livmorhalskreft [30-34]. Således kan variant genotypen GG av rs7248320 i lncRNA AC008392.1 være assosiert med aktivering av NFkB og apoptose hemning gjennom nedregulering av CARD8, og følgelig fremme utvikling og progresjon av infeksjonen relatert kreft, inklusive HCC og kreft i livmorhalsen, hvilken var i samsvar med risikoen effekten av varianten genotype GG av rs7248320 i resultatene av vår undersøkelse.
det er flere begrensninger i studien som må løses i den videre forskningen. For det første har vi gjennomført case-kontrollstudie for bare ett trinn uten validering. Ytterligere store studier er nødvendig for å validere assosiasjoner mellom rs7248320 i AC008392.1 og risikoen for HCC og livmorhalskreft. For det andre, den biologiske funksjon av de to eQTLs SNP’er på AC008392.1 ble ikke ytterligere undersøkt i denne studien. Foreningene mellom SNPs og risikoen for HCC og livmorhalskreft bør tolkes med forsiktighet. Mens det i vår tidligere studie [20], Vi fant ZNRD1 (sink bånd domene som inneholder 1) eQTLs SNP rs3757328 i ZNRD1-AS1 (ZNRD1 antisense RNA 1) var assosiert med økt risiko for HCC, og ytterligere eQTLs analyseresultater indikerte signifikant assosiasjon mellom genotyper av rs3757328 og uttrykk for ZNRD1 og ZNRD1-AS1. In vitro studier viste også at ZNRD1 knockdown hemmet uttrykk for HBV mRNA og fremmet spredning av HepG2.2.15 celler. Gitt at funnene fra vår tidligere studie [20], hypotese vi at lncRNA AC008392.1 kan regulere uttrykk av relatert protein (CARD8) av seg selv variasjon og dermed påvirke forekomst og utvikling av levertumor og livmorhals svulst. For det tredje, HPV-infeksjon, er den primære og nødvendig årsaken til livmorhalskreft, ble ikke oppdaget i livmorhalsen prøver. Og samspillet mellom HPV type og rs7248320 kan ikke vurderes i livmorhalskreftutvikling.
Så vidt vi vet, er dette den første studien undersøkte sammenslutning av CARD8 eQTLs SNPs i lncRNA AC008392.1 med risiko for HCC og livmorhalskreft. Med en forholdsvis stor befolkning, denne studien viste at den varianten genotype GG av rs7248320 i lncRNA AC008392.1 påvirket risikoen for to virusrelaterte kreft-HCC og livmorhalskreft. Varianten genotype GG kombinert med premenopausale status styrket risikoen effekt. Disse resultatene antydet at AC008392.1 rs7248320 kan tjene som en mottakelighet markør for HCC og livmorhalskreft. Videre studier som omfatter forskjellige befolkningsgrupper og funksjonelle analyser er garantert å validere og utvide våre funn.
