Abstract
Til tross for siste utvikling i medisin, nesten 50% av pasienter med endetarmskreft viser gjentakelse av sykdommen. Selv om årsakene til den høye tilbakefall ikke er fullt ut forstått, kan tilstedeværelsen av lekkasje fra kjemiske og radiotherapy resistent cancer stem /stilk-lignende celler, hvor mange oncomirs som mikroRNA-21 (MIR-21) er oppregulert, være en av de underliggende årsaker. MIR-21 regulerer prosesser av invasjon og metastasering av downregulating flere tumor /metastatisk suppressor gener inkludert PTEN (fosfatase og tensin homolog). Tumor suppressor protein PTEN kontrollerer selvfornyelse av stamceller. Ja, våre nåværende data viser en markant nedregulering av PTEN i SCID-mus xenografter av MIR-21 over-uttrykke tykktarmskreft HCT116-celler. Colonospheres som er høyanriket i kreft stammen /stilk som celler avslører økt MIR-21 uttrykk og redusert PTEN. Difluorinated curcumin (CDF), en ny analog av diett ingrediens curcumin, som har blitt vist å hemme veksten av 5-Flurouracil + oksaliplatina motstandsdyktig tykktarmskreftceller, downregulated MIR-21 i kjemoterapi resistent kreft i tykktarmen HCT116 og HT-29 cellene og restaurert PTEN nivåer med påfølgende reduksjon i Akt fosforylering. Lignende resultater ble også observert i metastatisk tykktarmskreft SW620 celler. Siden PTEN-Akt overfører legemiddelresistens til forskjellige maligniteter inkludert tykktarmskreft, vår observasjon av normalisering av MIR-21-PTEN-Akt sti av CDF tyder på at forbindelsen kan være en potensiell terapeutisk middel for kjemoterapi-resistente tykktarmskreft.
Citation: Roy S, Yu Y, Padhye SB, Sarkar FH, Majumdar AP (2013) Difluorinated-Curcumin (CDF) Gjenoppretter PTEN Expression i Colon kreft celler ved å nedregulere MIR-21. PLoS ONE 8 (7): e68543. doi: 10,1371 /journal.pone.0068543
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 28. mars 2013, Godkjent: 30 mai 2013; Publisert: 24.07.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til Dr. Majumdar fra National Institutes of Health /National Institute on Aging (AG014343) og Institutt for Veterans Affairs (VA Merit anmeldelse). De finansieringskilder denne undersøkelsen hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den nye utfordringen i behandling av tykktarmskreft (CRC), den tredje vanligste kreftformen, er tilbakefall av sykdommen. Nesten 50% av CRC-pasienter viser tilbakefall av sykdommen. Tilstedeværelsen av kjemo- og radioterapi motstandsdyktig kreft stilk /stilk-lignende celler (cscs /CSLCs) kan være en av de bakenforliggende årsakene [1]. Disse cellene er liten populasjon av udifferensierte kreft initierende celler som har uendelig selvfornyelse kapasitet, og er derfor referert til som tumorceller initiere [2]. PTEN (fosfatase og tensin homolog), har en tumor suppressor gen blitt rapportert å spille rolle i stamcelleselvfornyelse [3]. PTEN fungerer som et lipid fosfatase for å dephosphorylate fosfatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3), antagonisering den PI3-K /Akt pathway. Nedregulering av PTEN i forskjellige humane tumorer er blitt vist å føre til resistens mot konvensjonell terapi og tilbakefall av kreft etter første behandling [4]. PTEN-Akt svei overfører resistens til forskjellige maligniteter, inkludert kolorektal cancer [5], [6], [7], [8].
PTEN er en av målproteinene i MIR-21, som er oppregulert i mange kreftformer, inkludert tykktarmskreft [9]. microRNAs negativt regulerer ekspresjonen av målgener ved å spalte mRNA eller gjennom oversettelse undertrykkelse [10]. MIR-21 regulerer ikke bare tumorvekst, men også invasjon og metastasering ved å målrette flere kreft /metastatisk suppressor gener som PTEN [11]. Vi har rapportert at 5-fluorouracil og oksaliplatin (FU-Ox) resistente [chemo-resistente (CR)] tykktarmskreft HCT116 og HT29 celler vise berikelse av cscs /CSLCs og forhøyede nivåer av modne MIR-21 og at Mir-21 indusere stemness i tykktarm kreft celler [12]. Disse observasjonene bedt oss om å søke etter agent (er) som ville modulere cellulære hendelser som er knyttet til Mir-21-induksjon av stemness i tykktarm kreft celler.
Difluorinated curcumin (CDF), en giftfri analog av kosttilskudd ingrediens curcumin med en mye større biotilgjengelighet enn moderforbindelsen [13], [14], er en slik forbindelse. CDF har vist seg å modulere ekspresjonen av MIR-21 og PTEN i bukspyttkjertelkreft [15], [16], [17], [18], og for å hemme veksten av CR tykktarmskreftceller, og induserer nedbryting av colonospheres som er høyanriket i cscs /CSLCs [19]. I tillegg, fant vi CDF til opp regulere ekspresjonen av MIR-34 [20], som er rapportert å bli nedregulert i tykktarmskreft [21]. For å avgjøre om CDF hemming av veksten av CR tykktarmskreft kan delvis tilskrives restaurering av MIR-21-PTEN-Akt aksen, har vi undersøkt (a) forholdet mellom MIR-21 og PTEN og (b) effekten av CDF på uttrykk for MIR-21, PTEN og aktivering av Akt aksen i ulike tykktarmskreftceller.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kultur tilstand
den menneskelige kolon kreftceller HCT-116 (p53 villtype;
K-ras
mutant), HCT-116 (p53 null;
K-ras
mutant), HT-29 (p53 mutant;
K-ras
wt) og SW620 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Chemo-resistente (CR) tykktarmskreftceller ble samlet i vårt laboratorium som beskrevet tidligere [12]. Kort sagt ble HCT116 og HT29-celler inkubert med et klinisk relevant dose av FU-Ox (25 pM av 5-FU og 0,625 uM av oksaliplatin) i 72 timer. Mediet ble fjernet, og de adherente celler, som overlevde den FU-Ox fornærmelse, ble dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS uten at medikamenter i 3 til 4 dager. Tillegget fjerne FU-Ox syklusen ble gjentatt 12 ganger. De overlevende celler ble deretter passert og utsettes for høyere doser av kombinasjonen av FU-Ox (100 pM av 5-FU + 2,5 uM av oksaliplatin) i 2-3 uker. Til slutt ble de chemo-resistente celler opprettholdt i normalt dyrkingsmedium inneholdende 50 uM 5-FU + 1,25 uM oksaliplatin. SW620 kolon cancer-cellelinjen ble opprettholdt i RPMI, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS)
Colonospheres ble samlet fra foreldre HCT116 og HT29-cellelinjer under anvendelse av DMEM /F12. (1: 1) medier supplert med B27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), som rapportert tidligere [12] [22]. I korthet ble cellene tillatt å vokse i ikke-differensierende tilstand (stamcelle media) i ultra lav-festeplater (Corning Inc, Lowell, Massachusetts) i 10-14 dager. Stamcelle-medium ble supplementert med B27 ,, 20 ng /ml EGF (Sigma, St. Louis, MO), 10 ng /ml fibroblast vekstfaktor (Sigma), og antibiotisk /antimykotisk. Ved slutten av 5 dager, bare den stilk-lignende celler var i stand til å overleve i ikke-adherente betingelser, mens de ikke-stammen lignende celler døde av. Fersk stamcelle media ble gitt til de overlevende celler hver 5 dager. Kulene dannet ble fotografert ved 10 × forstørrelse. Cellene ble passert bruker 0,05% trypsin-EDTA (Invitrogen) når konfluent.
Behandling av tykktarmskreft cellelinjer
CDF ble oppløst i DMSO. Der det er aktuelt, ble CR HCT116, CR HT29 eller SW620-celler ble behandlet med 100 nM CDF i 72 timer. Kontrollceller fikk 0,05% DMSO. Etter 72 timer ble cellene utsatt for DNA, RNA og protein isolasjon.
Xenotransplantat vevsprøver
Dyret forskning protokollen ble godkjent av Wayne State University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) . Xenograft avledet fra HCT116-celler, stabilt transfektert med enten MIR-21 eller vektoren (pCMV), ble samlet i SCID-mus som rapportert tidligere [12]. Formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) xenograft vev ble brukt til å isolert RNA ved hjelp miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) som beskrevet tidligere [20].
Real-time RT-PCR
RNA ble isolert fra FFPE- vev ved hjelp miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) og fra dyrkede celler ved hjelp miREasy kit (Qiagen). Twenty nanogram av total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, MA) i henhold til produsentens protokoll. For å estimere de relative nivåer av PTEN-mRNA, ble 500 ng av RNA revers transkribert til cDNA ved hjelp av Gene Amp Gold RNA PCR Kit (Applied Biosystems). Real time PCR ble utført ved hjelp av spesifikke primere for MIR-21 (Exiqon) og PTEN [23] sammen med SYBR
® Grønne PCR reagenser (Applied Biosystems). Den relative mengde av MIR-21 og PTEN-mRNA ble normalisert til henholdsvis RNU1α (Exiqon) og human β-aktin-genet.
Western blot-analyse
Western blot-analyse ble utført i henhold til vår standard protokollen [22]. I korte trekk ble cellene lysert; proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad). Lysater ble underkastet elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE og proteinene overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore) etterfulgt av blokkering med BSA ved romtemperatur i 1 time. De ble deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, deretter vasket og inkubert med kompatible sekundære antistoffer. Proteinbåndene ble visualisert ved ECL prime western blotting deteksjonsreagensen (GE Healthcare biovitenskap). Membranene ble strippet behov for ytterligere undersøkelser.
Luciferase Assay
HCT116-CR celler ble transfektert enten med anti-sense MIR-21 eller negativ kontroll [NC] (Ambion) sammen med luciferase reporter plasmid med PTEN 3’UTR frø sekvens for MIR-21 [11] og pMIR-RAPPORT b-gal kontroll plasmid DNA (Applied Biosystems) ved hjelp Lipofectamine
TM 2000 i henhold til manufaturer protokoll. Seks timer etter transfeksjon, ble mediene skiftet og cellene transfektert med NC ble inkubert med 100 nM CDF i 24 timer. Luciferase aktivitet ble bestemt ved hjelp av Promega luciferase kit følgende manufaturer protokoll. β-galaktosidase analyser ble utført for å normalisere transfeksjon variabilitet. Dataene ble presentert som relative luciferase aktivitet per mikrogram protein.
Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som betyr ± SD. Sammenligninger av de kontinuerlige variabler mellom to uavhengige grupper ble beregnet ved hjelp av to-tailed students t-test. Den p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
PTEN uttrykk ble nedregulert i MIR-21 over uttrykke xenograft
PTEN er et mål på. oncomir MIR-21. For å undersøke forholdet mellom MIR-21 og PTEN, SCID-muse-xenografter avledet fra MIR-21 over-uttrykker HCT116-celler (MIR-21) og vektor-transfekterte kontrollceller (pCMV) ble analysert for ekspresjon av MIR-21 og PTEN . Som forventet, data fra QRT-PCR-analyse viste at de relative nivåene av MIR-21 var signifikant høyere i xenotransplantater fra MIR-21 over-uttrykker HCT-116-celler, sammenlignet med kontrollene (fig. 1A). I kontrast, PTEN mRNA nivåer i xenografter fra MIR-21 over-uttrykke celler ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollene (Fig. 1B). Til sammen viser resultatene en invers sammenheng mellom MIR-21 og PTEN. Denne observasjonen er i likhet med hva vi tidligere nevnt for PTEN protein nivåer i MIR-21 hyperexpressing tykktarmskreft HCT-116 celler (12).
kvantitativ real-time RT PCR ble utført med RNA isolert fra formalinfiksert parafin innebygd xenografter.
PTEN-Akt pathway er aktivert i colonosphere
Colonospheres, anses å være surrogat svulster, er høyanriket i cscs /CSLCs [22]. For å avgjøre om MIR-21 og målet protein PTEN er involvert i regulering funksjonelle egenskaper colonospheres, uttrykk for MIR-21, PTEN og Akt, nedstrøms effektorer av PTEN ble analysert i colonospheres generert fra HCT116 og HT29. Begge HCT116 og HT29 cellelinjer dannet godt avrundede kuler (figurene 2A . B; øvre panel). Ekspresjon av MIR-21, bestemt ved QRT-PCR, ble funnet å være 4-5 ganger høyere i colonospheres, dannet av begge cellelinjer, sammenlignet med deres tilsvarende parentale celler (figur 2A . 2B, midtre panel). På den annen side, Western-blot-analyse viste redusert ekspresjon av PTEN i colonospheres, sammenlignet med de tilsvarende parentale celler (figurene 2A . 2B, nedre panel). Som ventet, ble reduksjon i PTEN i colonospheres assosiert med økt aktivering av Akt, som demonstrert av markert økning i relative konsentrasjoner av p-Akt sammenlignet med tilsvarende foreldre celler (figur 2A .. 2B nedre panel). Til sammen tyder resultatene på at en økning i MIR-21 i colonospheres som fører til reduksjon i PTEN aktiverer Akt signalveien, som kan spille en rolle i å regulere tumorigene egenskaper colonospheres som er beriket i cscs /CSLCs.
CDF gjenoppretter PTEN uttrykk i tykktarm kreft celler
vi har tidligere vist at CR tykktarmskreftceller ikke bare beriket i cscs /CSLCs men uttrykker også betydelig høyere nivåer av MIR-21 enn foreldre kolleger [12]. Siden CDF har tidligere blitt vist å hemme veksten CR tykktarmskreft HCT116 og HT29-celler, fikk oss til å bestemme hvorvidt CDF-indusert veksthemming av CR tykktarmskreftceller kunne tilbakeføres til restaurering av MIR-21-PTEN-Akt akse. Faktisk, uttrykket av MIR-21 i CR HCT116 og HT29 celler ble markert redusert når de ble inkubert med 100 nM CDF, sammenlignet med tilsvarende DMSO kontroller (figur 3A og amp;. 3B, øvre panel). Dette var assosiert med økt uttrykk av PTEN og reduksjon i Pakt (aktivert form) i CR HCT116 og HT29 celler (figur 3A . 3B, nedre paneler); ingen tydelig endring i ikke-fosforylert (total) form av Akt i enten CR HCT116 eller CR HT29-celler ble observert i respons til CDF (figurene 3A og 3B;. nedre paneler). Effekten av CDF på MIR-21 indusert PTEN uttrykk ble bekreftet av luciferase assay. CR-HCT116-celler ble transfektert med luciferase reporter konstruksjon inneholdende PTEN 3’UTR MIR-21 frø-sekvens og deretter inkubert med 100 nM CDF i 24 timer. CDF økt betydelig luciferase-aktivitet, sammenlignet med kontrollen (Fig. 3C). For sammenligningsformål ble det CR-HCT116-celler transfektert med anti-sense-MIR-21, noe som viste en økning i PTEN-luciferase-aktivitet (Fig. 3C). Kollektivt, dataene viser at i CR tykktarm kreft celler, CDF nedregulerer MIR-21 som resulterer i oppregulering av PTEN som fører til redusert aktivering av Akt. Disse observasjonene tyder på at CDF gjenoppretter Mir-21-PTEN og Akt aksen i chemo-resistente (CR) tykktarmskreftceller.
Kontroller ble inkubert med DMSO. Western-blot (nedre panel) viste forandringer i de relative konsentrasjoner av PTEN, pakt og total Akt i chemo-motstandsdyktig HCT116 og HT29-celler i respons til CDF eller DMSO. (C), CDF behandling eller anti-MIR-21 transfeksjon øker luciferaseaktivitet i chemo-resistente HCT116-celler transfektert med pGL3-luc konstruksjon som har PTEN-miR21 frø sekvens. NC = negativ kontroll
For ytterligere å undersøke om CDF vil påvirke uttrykket av MIR-21- PTEN -. Akt aksen ved metastaserende tykktarmskreft, gjennomførte vi det samme eksperimentet med SW620 cellelinje som ble generert fra metastaser tykktarmskreft vev. Som det har blitt observert for CR-HCT116 og HT29 celler, CDF forårsaket en markert reduksjon i MIR-21 uttrykk i SW620 celler (Fig. 4). Dette var assosiert med økt PTEN nivåer og reduksjon i fosforylert form av Akt, sammenlignet med tilsvarende kontroller (Fig. 4).
Vest-blotter (panel høyre) som viser endringer i relative uttrykk for PTEN, Pakt og total Akt i SW620 celler etter 72 timers inkubering med CDF eller DMSO (kontroller). Menneskelig β-actin tjente som lasting kontroll.
Diskusjoner
Til tross for siste utvikling i medisin, nesten 50% av pasienter med CRC showet tumorresidiv. Selv om grunnene til dette ikke er fullt ut forstått, kan det delvis være relatert til manglende evne til å målrette cscs /CSLCs som uttrykker kreft stilk cellemarkører, beholder ubegrenset mulighet for å regenerere og er resistente mot konvensjonell terapi [24] som resulterer i kjemoterapi-ildfast svulster. Dette ville forklare hvorfor det er vanskelig å fullstendig utrydde kreft og hvorfor tilbakefall er en alltid tilstedeværende trusselen.
Selv om det er allment antatt at kreftstamceller oppstår fra normale stamceller eller progenitorceller ved mutasjon [24], en bedre forståelse av de molekylære og biokjemiske forandringer assosiert med cancer stamceller er essensielt for utviklingen av målrettede terapier. Vi har rapportert at CR tykktarmskreftceller, som er anriket i cscs /CSLCs, lett danne sfæroider og oppviser økt ekspresjon av MIR-21, som har vist seg å være oppregulert ved mange ondartede sykdommer, inkludert kreft i tykktarmen [12], [25] . Uttrykk av MIR-21 i colonic slimhinnen har også blitt funnet å øke i løpet av aldring, da forekomsten av tykktarmskreft øker kraftig [26]. Selv om den nøyaktige rollen MIR-21 i utviklingen av tykktarmskreftutvikling er ikke fullt ut forstått, rapporterte vi MIR-21 for å indusere stemness i tykktarm kreft celler ved downregulating TGFB-reseptor [26].
Resultatene av vår nåværende undersøkelsen viser at colonospheres, som er høyt anriket i cscs /CSLCs med økt uttrykk av MIR-21 [12], [22], redusert utstillingen uttrykk for tumor suppressor protein PTEN, et mål av MIR-21. Vår nåværende data viser også en invers sammenheng mellom MIR-21 og PTEN og støtter påstanden om at Mir-21 regulerer uttrykket PTEN. Tapet av PTEN, observert i MIR-21 over-uttrykker tykktarmskreftceller kan delvis være ansvarlig for aktivering av Akt, som dokumentert av den økte nivåer av Pakt i colonospheres. Økt aktivering av Akt signalveien kan spille en sentral rolle i akselerasjon av vekst av xenograft fra Mir-21-overekspresjon tykktarm kreft celler i SCID-mus, som vi rapporterte tidligere [12] og kan gi resistens til forskjellige maligniteter inkludert tykktarmskreft [5 ], [6], [7], [8].
MIR-21 potensial «oncomir» påberopt oss å søke etter agent (er) som kan være effektivt brukes til å nedregulere MIR-21 i tykktarmskreft celler og dermed redusere deres tumorigent potensial. Begrunnelsen for å forfølge denne linjen av etterforskningen kommer fra vår siste observasjon at nedregulering av MIR-21 i chemo-resistente tykktarmskreftceller fører til differensiering og gjør dem utsatt for anti-kreft agenter, spesielt difluorinated curcumin (CDF), en analog av kosttilskudd ingrediens curcumin med større biotilgjengelighet enn moderforbindelsen [13], [14], [27]. Nyere studier fra dette laboratoriet har også vist at CDF hemmer veksten av CR tykktarmskreftceller og oppregulerer også ekspresjonen av MIR-34, som er nedregulert i colontumorer [20]. I tillegg har tidligere undersøkelser vist at CDF for å modulere ekspresjonen av MIR-21 og PTEN i bukspyttkjertelkreft [18]. Derfor CDF kan betraktes som en potensiell terapeutisk middel for både bukspyttkjertel og kolorektal kreft. Videre vår observasjon at CDF modulerer MIR-21-PTEN-Akt aksen i begge p53-positive og p53-negative tykktarmskreftceller tyder på at CDF kan være terapeutisk effektive i p53-positive og negative colontumorer. Interessant CDF er også funnet å være effektivt for å gjenopprette PTEN nivåer i den metastatisk kreft i tykktarmen cellelinje SW620. Til sammen tyder resultatene på at CDF kunne være en effektiv terapeutisk middel for ulike stadier av kreft i tykktarmen. Addtionally, det faktum at CDF modulering av MIR-21-PTEN-Akt aksen kunne observeres i chemo-resistente tykktarmskreftceller som er sterkt anriket på cscs /CSLCs tyder på at denne nye analoge av curcumin kan også være terapeutisk effektiv for tilbakevendende kreft, som er kjent for å være resistente mot konvensjonell kjemoterapi [14].
i konklusjonen vår nåværende data viser at MIR-21 og PTEN er omvendt proporsjonale i at en øket ekspresjon av MIR-21 resulterer i reduksjon i PTEN ledningene til aktivering av Akt signalering. Disse hendelsene kan spille sentral rolle i tumorprogresjon. Videre vår observasjon at Mir-21 mediert PTEN-Akt signal kan normaliseres ved CDF i chemo-resistente tykktarmskreftceller tyder på at CDF kan være en potensiell terapeutisk middel for tilbakevendende tykktarmskreft.
Takk
pGL3-Luc konstruksjonen var snill gave fra Prof Tushar Patel, Ohio state university og professor Goutam Ghosh Choudhury, UTHSCSA.
