Abstract
Eggstokkreft er en svært dødelig sykdom med dårlig prognose og spesielt i høyverdig tumor. Emerging bevis har rapportert at avvikende oppregulering og aktivering av GRB7, ERK samt FOXM1 er nært forbundet med aggresivenesss av kreft hos mennesker. Men fortsatt gjenstår samspillet mellom disse faktorene i patogenesen av kreft hos mennesker uklart. I denne studien fant vi at GRB7 (
P
0,0001), ERK-fosforylering (
P
0,0001) og FOXM1 (
P
= 0,001) var ofte økt og forbundet med høy grad av tumorer, så vel som en høy tendens i forbindelse med avansert stadium eggstokkreft ved immunhistokjemisk analyse. Forbløffende nok uttrykk for GRB7 (
P
0,0001), ERK-fosforylering (
P
0,001) og FOXM1 (
P
0,001) viste en signifikant trinnvis økning mønster langs Grade 1 til grad 3 eggstokkreft. Biokjemiske studier med western blot analyse viste at håndhevet uttrykk eller knockdown av GRB7 viste GRB7 kunne heve nivåene av ERK-fosforylering og FOXM1, mens håndheves uttrykk for FOXM1 ikke kan forandre nivåer av GRB7 og ERK-fosforylering. Men hemning av ERK-signalering ved U0126 eller PD98059 kan redusere nivået av FOXM1 i GRB7-overekspresjon eggstokkreft celler, noe som tyder på at GRB7, ERK og FOXM1 reguleres ryddig. Videre hemming av ERK aktivitet ved U0126 eller PD98059, eller redusert FOXM1 uttrykk ved Thiostrepton betydelig hemmet celle migrasjon /invasjon, tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Samlet våre funn konferere som målgruppe GRB7 /ERK /FOXM1 signalkaskade kan være en lovende molekylær terapeutisk valg i kampen mot kreft i eggstokkene
Citation. Chan DW, Hui WWY, Cai PCH, Liu MX, Yung MMH, Mak CSL, et al. (2012) Targeting GRB7 /ERK /FOXM1 signalveien Svekker Aggressivitet av eggstokkreft celler. PLoS ONE 7 (12): e52578. doi: 10,1371 /journal.pone.0052578
Redaktør: Muy-Teck Teh, Barts The London School of Medicine og odontologi, Queen Mary University of London, Storbritannia
mottatt: 30 august 2012; Godkjent: 20 november 2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Chan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Wong Sjekk Hun Charitable Foundation. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige sykdommen blant alle gynekologiske kreftformer [1], [2]. Den høye dødeligheten av kreft i eggstokkene er på grunn av dårlig prognose og de fleste tilfeller blir oppdaget på sent stadium. Eggstokkreft er en heterogen tumor som oppviser et bredt spekter av cytologiske, klinisk og endrede genetiske egenskaper [3], [4]. Eggstokk høyverdig kreft er preget av høy grad av kjerner, en høy mitotisk indeks, mer aggressivitet, dårlig differensiert, mindre lydhør overfor kjemoterapi samt lav overlevelse [4], [5], [6]. De relativt verre patogeneserelaterte og klinisk-patologisk funksjoner av høy grad av eggstokkreft føre til dårlig klinisk behandling av denne type sykdom. Derfor forstå de underliggende molekylære mekanismer kan bidra til å utvikle bedre kurativ behandling i aggressive eggstokkreft.
vekstfaktor reseptor-bundet protein 7 (GRB7) er et signal adapter som fungerer for par signaler fra celleoverflatereseptorer til spesifikk signalveier [7]. Emerging bevis har rapportert at GRB7 er overuttrykt og vanligvis ledsaget med overekspresjon av erbB2 i kreft hos mennesker [8], [9]. Clinicopathological analyser har vist at oppregulert GRB7 er forbundet med metastatiske adferd [8], [10], [11], [12]. Dessuten har konstitutiv aktivering av ERK vært implisert i en rekke tumorigene atferd som celleproliferasjon, differensiering, metastase, angiogenese, og chemoresistance i humane cancere [13], [14], [15], [16]. I tillegg har gaffelhode Box M1 (FOXM1) blitt identifisert som et oncogent transkripsjonsfaktor som er hyppig oppregulert i mange humane cancere [17], [18], [19]. Vi og andre har nylig funnet at oppregulering av FOXM1 forbedrer celleformering, migrering /invasjon og spesielt dens ekspresjon er involvert i kreft progresjon [17], [20], [21], [22]. Interessant, de ovennevnte tre faktorer synes å konvergere mot de aggressive kreft egenskaper som høy klasse og avansert stadium svulster, men forholdet deres reguleringsmekanisme er ikke helt klarlagt. Derfor avgrensningen av samspillet av sine reguleringsmekanismer vil bistå i å utforske en potensiell terapeutisk mål i eggstokkreft.
I denne studien, viser vi at de uttrykk for GRB7, ERK og FOXM1 var signifikant korrelert med progresjon av eggstokkreft. Vi beskriver også reguleringsmekanisme for GRB7 /ERK /FOXM1 signalkaskade og hemming av denne signal enten ved hjelp av kjemisk hemmer U0126 eller FOXM1 inhibitor Thiostrepton kunne bemerkelsesverdig oppheve eggstokkreft celle migrasjon /invasjon, og
in vitro
og
in vivo
tumorvekst. Våre resultater understreker viktigheten av GRB7 /ERK /FOXM1 sti i tumorigene egenskaper og argumentere denne veien for en lovende terapeutisk mål i høyverdig eggstokkreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer og narkotika
To eggstokkreft cellelinjer: A2780cp (gaver fra Prof. BK Tsang, Dept. of Obstetrics gynekologi, University of Ottawa) [23], og OVCA433 (hentet fra American Type Culture Collection, Rockville, MD), samt to GRB7 stabilt uttrykker kloner; C19 i OVCA433 og C15 i A2780cp som ble samlet tidligere [12] ble inkludert i denne studien. Alle ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2 i minimum essensielt medium eller Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplementert med 10% føtalt bovint serum. MAPK /ERK kinase 1/2 (MEK1 /2) hemmere PD98059 og U0126, og FOXM1 inhibitor Thiostrepton ble oppnådd fra Calbiochem (La Jolla, CA, USA).
plasmider og Cell Transfeksjon
den pEGFP /GRB7 uttrykkende plasmider ble anvendt som tidligere [12]. Fire shRNA hysj 29mer shRNA konstruerer mot GRB7 i pGFP-V-RS vektor ble kjøpt fra OriGene Technologies for å generere stabil GRB7 knockdown celler (kat. Nr TG312621, OriGene Technologies, Inc, Rockville, MD, USA). Den ikke-effektive 29-mer forvrengt shRNA (TR30013) (OriGene Technologies) ble anvendt som en negativ kontroll. For å knockdown menneskelig FOXM1 ble TriFECTa® RNAi Kit som inneholder tre sirnas rettet mot menneskelig FOXM1 kjøpt fra IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Iowa, USA). Cell transfeksjon ble utført med LipofectAMINE ™ 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. De uttrykk mønstre ble analysert ved Western blotting. Foreldre vektor pEGFP-C1 ble brukt som tom vektor kontroll.
Immunohistokjemiske og Western Blot Analyser
Immunhistokjemisk (IHC) farging for GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 ble utført på en eggstokkreft vev matrise (OVC1021) (Pantomics Inc, San Francisco, CA) ved hjelp av primær polyklonale anti-GRB7 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-fosfor-ERK (Chemicon International, Inc., Temecula, USA), og anti-FOXM1 (Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA). Prosentandelen av immuno-positive celler i tumorer og normalt epitel ble undersøkt ved å andelene av immuno-positive celler varierte fra 10 til 100%, og intensiteten av fargingen scoret som 0 (negativ), 1 (svak), 2 (moderat) , 3 (sterk) og 4 (merket). Immunoreaktiviteten for hvert tilfelle ble scoret som en prosentandel av andelene av immuno-positive celler multiplisert med intensiteten av fargingen. Folden endring av hvert farging ble oppnådd ved å dividere uttrykket nivået for hver prøve kreft ved den midlere verdi immunreaktive farging av normale ovarier og border blandet cystadenoma. Kvantifisering av immunhistokjemisk farging ble scoret blindt minst av to uavhengige observatører.
For Western blot analyse ble cellene lysert med Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) som inneholder proteasehemmer Cocktail (Roche, Indianapolis , IN) og PMSF (phenylmethylsulphonyl fluor) (Sigma Chemical Co. St Louise, MO). Prøvene ble oppløst ved SDS-PAGE og elektroblottet på Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA). Blottene ble blokkert med 5% skummet melk, etterfulgt av inkubasjon med anti-GRB7, FOXM1 (Santa Cruz), GFP (Abcam), fosfo-ERK, ERK (Cell Signaling), og
β-
aktin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Blottene ble deretter inkubert med geite-anti-kanin eller anti-mus sekundært antistoff konjugert med pepperrotperoksidase (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH) og visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) (Amersham).
celleviabilitet analyse
Celleviabilitet ble målt ved Cell Proliferation Kit II (XTT) i 5 dager i henhold til produsentens instruksjoner (Roche). Dataene ble samlet inn fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Cell migrasjon og invasjon Analyser
For å kvantifisere celle trekkende og invasive kapasiteter på eggstokkreft celler, transwell celle migrasjon og celle invasjon undersøkelseskit (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) ble brukt i denne studien i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, 1,5 x 10
5-celler ble resuspendert i serumfritt kulturmedium (Thiostrepton, PD98059 eller U0126 ble tilsatt når det er nødvendig) og sådd ut på det øvre kammer, mens den fullstendige mediet ble plassert i det nedre kammer som chemo-lokke . Platen ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 til 12 timer for cellemigrasjon assay, og 48 timer for celle invasjon assay slik at cellene til å passere gjennom porene i membranen. Cellen migrert og invaderte rater ble beregnet etter cellefarging og telling ved anvendelse av minst tre forskjellige felter for hver transwell filter. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
In Vivo
tumorigenitet analysen
For å undersøke
in vivo
effektene av U0126 og Thiostrepton på svulstutvikling, 5 × 10
6 A2780cp celler ble inokulert sc i
BALB /c nu /nu
hunnmus 3-4 uker gamle og i grupper på fem. Den tumordannelse i nakne mus ble overvåket i 3 dager. 25 til 50 umol /kg av U0126 eller 200-300 mikromol /kg Thiostrepton (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) ble administrert intraperitonealt en gang for hver 3. dag med totalt 4 injeksjoner i fem nakne mus når hver tumorstørrelse ble ~3 mm i diameter. Som en kontrollgruppe, DMSO alene ble tilførte i.p. for samtidig behandling. Tumorstørrelsene ble målt ved hjelp av glide calipers og ble beregnet ved den følgende formel: volum = (bredde)
2 * lengde * π /6. Tumorvekstkurver ble plottet fra det midlere volum ± SEM av tumorer fra 5 mus. Bivirkningene for eksempel kroppsvektendring ble fulgt nøye. Alle dyreforsøk ble godkjent av University of Hong Kong komité for bruk av levende dyr i undervisning og forskning (CULATR No.2560-11).
Statistical Analysis
De kliniske parametre var analysert med SPSS 13.0 programvare (SPSS, Chicago, IL). Fishers eksakte test (for parametrisk data) og Mann-Whitney test (for ikke-parametriske data) ble brukt for å sammenligne verdiene mellom undergrupper. Studentenes
t
-test ble brukt til å analysere celle levedyktighet, migrasjon /invasjon og
in vivo
tumorvekst resultater. En
p
-verdi ble betraktet som signifikant når det er mindre enn 0,05.
Resultater
GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 er ofte forhøyet i Eggstokkreft
har tidligere rapportert at GRB7 [12], ERK-fosforylering og FOXM1 [21] er overexpressed i eggstokkreft prøver spesielt i høyverdig svulster. Imidlertid samspillet mellom disse faktorene i eggstokk-kreft ennå ikke er klarlagt. Ved immunhistokjemisk (IHC) analyse på en eggstokkreft vev array (OVC1021), fant vi at alle disse faktorene ble congruently oppregulert i eggstokkreft prøver som var i tråd med våre tidligere funn [12], [21]. Som forventet, uttrykt GRB7 ( 4 folder) ble korrelert med økt ERK-fosforylering ( 2 folder) (
P
0,0001, Fishers eksakte test) og FOXM1 ( 3 folder) (
P
0,0001, Fishers eksakte test) (tabell 1). I tillegg GRB7 (
P
0,0001, Fishers Exact test), ERK-fosforylering (
P
0,0001, Fishers eksakte test), og FOXM1 (
P
= 0.001, Fishers eksakte test) var signifikant korrelert med høy grad av svulsten og hadde en høy tendens i forbindelse med avansert stadium eggstokkreft (GRB7,
P
= 0,021; fosfor-ERK,
P
= 0,065, og FOXM1,
P
= 0,065, Fishers eksakte test) (tabell 1). Det var bemerkelsesverdig at en betydelig progressiv økning av GRB7 (
P
0,001, Mann-Whitney test), ERK-fosforylering (
P
0,001, Mann-Whitney test), og FOXM1 (
P
0,001, Mann-Whitney test) ble uttrykket mønster observert fra Grade 1 til Grad 3 svulster (fig. 1A og 1B) og en mindre opplagt mønster fra tidlig til sent stadium eggstokkreft (figur S1 ), noe som tyder på at disse faktorene spiller viktige roller i kreft progresjon eggstokkene. Samlet utgjør disse dataene indikerer at det er et nært samspill mellom GRB7, ERK aktivitet og FOXM1 i å regulere eggstokkreft Oncogenesis spesielt i høyverdig svulst.
(A) uttrykk for GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 ble evaluert ved immunhistokjemisk analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer på en eggstokkreft vev utvalg (OVC1021, Pantomics). (B) Representative Bildene viser trinnvis økning på GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 uttrykk fra Grade 1 til Grad 3 eggstokkreft (serøs subtype) (200 × forstørrelse).
Molecular Regulering av GRB7 /ERK /FOXM1 signale i eggstokkreft celler
Gitt at den økte GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 betydelig korrelert med høy grad av ovarial tumor, kan de bli regulert coordinately for å megle onkogene funksjoner i kreft progresjon eggstokkreft . Vi var derfor interessert i å undersøke reguleringsmekanisme blant disse faktorene i eggstokkreft celler. For dette formål, ble både A2780cp og OVCA433 celler først behandles med U0126 MEK1 /2 inhibitor. Western blotting viste at ERK-fosforylering og FOXM1 ble merkbart redusert, men ingen endring i GRB7 uttrykk ble observert (Fig. 2A). Dessuten, behandling av Thiostrepton lykkes med å redusere nivået av FOXM1, mens nivåene av GRB7 og ERK-fosforylering var fremdeles uforandret (Fig. 2B). For å utelukke ikke-spesifikke funksjon Thiostrepton i høydosebehandling, ble siRNA tilnærming mediert FOXM1 knockdown utført i A2780cp celler. På samme måte som ved behandling av Thiostrepton, uttømming av FOXM1 endret ikke uttrykk for GRB7 og ERK-fosforylering (Fig. 2B). Dette indikerer at undertrykkelsen av ERK aktivitet kan avta FOXM1 nivå, mens reduksjon av FOXM1 uttrykk ikke påvirker enten GRB7 ekspresjon eller ERK-aktivitet. For ytterligere å bevise denne observasjonen, stabilt knockdown av endogent GRB7 i en GRB7 høy uttrykke cellelinje, OVCA433, ved hjelp shRNA tilnærming tydelig viste at ikke bare GRB7 men også ERK-fosforylering og FOXM1 ble redusert (Fig. 2C). I kontrast, håndhevet uttrykk for GRB7 økt ERK-fosforylering og FOXM1 i A2780cp og OVCA433 celler (Fig. 2D). På den annen side kan behandling av enten U0126 eller PD98059 MEK1 /2-hemmere reduserer ikke bare ERK-fosforylering men (2D fig.) Også FOXM1 i GRB7 ektopiske uttrykkende celler. Sammen er disse funnene jf at GRB7 oppregulerer positivt ERK-aktivitet, som i sin tur hever FOXM1 i eggstokkreft celler.
(A) Behandling med U0126 (5 uM) viste en signifikant reduksjon i ekspresjonen av ERK-fosforylering sammen med FOXM1 i eggstokkkreftceller tidsavhengig, mens ingen forandring i GRB7 ekspresjon ble funnet i A2780cp celler. (B) Behandling av Thiostrepton (20 mm) bemerkelsesverdig redusert uttrykk for FOXM1 bare, men ingen endring i de uttrykk for GRB7 og ERK-fosforylering i A2780cp celler (
forlot
). Nedbryting av FOXM1 av siRNA knockdown endret ikke uttrykk for GRB7 og ERK-fosforylering (
midt
). C, siRNA egge kontroll. Si1, SI2 og SI3 sirnas rettet mot tre ulike regioner av menneskelig FOXM1 og knockdown uttrykk for FOXM1 med 60%, 45% og 70% henholdsvis. (C) To av fire GRB7 shRNA konstruerer (SH1 og SH2) viste ~70% knockdown av GRB7 sammen med en reduksjon av ERK fosforylering og FOXM1 uttrykk i OVCA433 celler. Det omkastede kontroll (NC) ble anvendt som negativ kontroll. (D) Tvangs uttrykk for GRB7 økt ERK-fosforylering og FOXM1. Men behandling med enten U0126 (10 mm) eller PD98059 (20 mm) kan undertrykke indusert ERK-fosforylering og FOXM1 i A2780cp og OVCA433 eggstokkreft celler.
Undertrykkelse av ERK aktivitet eller FOXM1 Expression Reduserer Ovarian Cancer Cell migrasjon og invasjon
Det er dokumentert at høy grad av ovarian tumor utstillinger høy kapasitet i celle migrasjon /invasjonen [4], [24]. Derfor lurte vi på om hemming av ERK aktivitet eller FOXM1 uttrykk av deres spesifikke hemmere kan påvirke celle migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler. For å bekrefte denne hypotesen, ble en høyverdig eggstokkreft cellelinje, OVCA433, viser høye trekkende og invasive evner ectopically uttrykt med GFP /GRB7 og behandlet med hemmere. Resultatene viste at behandling av Thiostrepton, PD98059 og U0126 bemerkelsesverdig redusert cellemigrering hastighet på OVCA433-GRB7 celler ved 3,5 ganger, 2,2 ganger og 2,5-ganger henholdsvis sammenlignet med kontrollen (Fig. 3A). Likeledes, behandling av Thiostrepton, PD98059 og U0126 også betydelig redusert celle invasjon hastighet på OVCA433-GRB7 celler ved 3,5 ganger, 2,6 ganger og 2,9 ganger henholdsvis sammenlignet med kontrollen (Fig. 3B). Disse funnene tyder på at inhibering av GRB7 /ERK /FOXM1 signalisering er i stand til å svekke cellemigrering og invasjon av eggstokkreft celler.
OVCA433 celler med stabil ekspresjon av GFP /GRB7 (OVCA433-GRB7) ble behandlet med DMSO som kontroll, Thiostrepton (20 uM), PD98059 (20 uM) og U0126 (10 uM) i 6 timer og ble analysert ved (A) Transwell cellemigrering assay. Den representative bilder og stolpediagram viste signifikant reduksjon i antall trekkende cellene gjennom Matrigel belagt membran i OVCA433-GRB7 celler behandlet med Thiostrepton, PD98059 og U0126 enn DMSO kontroll (*
P
0,02, Student
t
-test) ved 8-time; (B) Transwell-celle invasjon assay. Den representative bilder og stolpediagram viste signifikant reduksjon i invasjonen raten i OVCA433-GRB7 celler behandlet med Thiostrepton, PD98059 og U0126 sammenlignet med DMSO kontroll (*
P
0,05, Student
t
-test) ved 15-timers.
Målrette GRB7 /ERK /FOXM1 hemmer Eggstokkreft tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
Tidligere studier har vist at konstitutiv aktivering av ERK-aktivitet eller øket ekspresjon av GRB7 og FOXM1 er nært forbundet med tumorgenisitet av forskjellige humane cancere [12], [16], [21], [25], [26]. Dette tyder på at målrettet mot noen komponenter i denne signalkaskade skal teoretisk oppheve de tumorigene egenskaper i eggstokkreft celler. Faktisk, tidligere publikasjoner rapportert at knockdown av FOXM1 og ERK kan redusere cellevekst og invasivitet av kreft hos mennesker [27], [28], [29]. I denne studien ønsket vi å undersøke tumorigen endringer ved hjelp av farmasøytiske hemmere spesifikt rettet mot GRB7 /ERK /FOXM1 signalkaskade. Vi dermed først evaluert undertrykkende effekt på celleproliferasjon av to høyverdig serøs eggstokkreft cellelinjer; A2780cp og OVCA433 hjelp U0126 (10 mm). Ved XTT celleproliferasjon analysen, både A2780cp (
P
= 0,02, Student
t
-test) og OVCA433 (
P
= 0,03, Student
t
-test) viste signifikant reduksjon i celleformering hastighet som sammenlignet med deres kontroller (fig. 4A). Tilsvarende ved behandling av Thiostrepton (20 mm), A2780cp (
P
= 0,015, Student
t
-test) og OVCA433 (
P
= 0,025, Student
t
-test) viste også en betydelig reduksjon i celleformering hastighet som sammenlignet med deres kontroller (fig. 4B).
(A) XTT celle proliferasjonsanalyser viste at hemning av ERK-fosforylering ved U0126 (10 mm) betydelig avskaffet celleproliferasjon sats i GRB7 stabilt uttrykker OVCA433 celler (
P
= 0,020, Student
t
-test) og A2780cp celler (
P
= 0.030, Student
t
-test) sammenlignet med sine vektor kontroller. (B) XTT celleproliferasjonsprosesser analyser viste at undertrykkelsen av FOXM1 uttrykk ved Thiostrepton (20 mm) betydelig redusert celledeling satsen i GRB7 stabilt uttrykker OVCA433 celler (
P
= 0,015, Student
t
-Test) og A2780cp celler (
P
= 0,025, Student
t
-test) sammenlignet med sine vektor kontroller.
Vi neste undersøkte
in vivo
tumorigent aktiviteten GRB7 i A2780cp av subkutant inokulasjon GRB7 og vektor kontroll uttrykker A2780cp celler til én flanken av nakne mus. Som forventet, GRB7 stabilt uttrykker A2780cp celler utstilt 30% raskere tumorvekst sammenlignet med vektor kontroll (
P
= 0,020, Student
t
-test) (figur S2). Vi neste undersøkte undertrykkende effekt på tumorvekst av GRB7 stabilt uttrykker A2780cp ved behandling av U0126 eller Thiostrepton. Når tumorstørrelsen nådde ~3 mm i diameter i tumorbærende nakne mus på dag 6, U0126 25 og 50 uM /kg var i.p. injisert i bukhulen til nakne mus for hver 3-dag. Etter 4 ganger av U0126 injeksjon, fant vi at det var 35% og 72% reduksjon i tumorstørrelse sammenlignet med DMSO kontroll på dag 18 når injisert med U0126 på 25 mikrometer /kg (
P
= 0,032, Student
t
-test) og 50 M /kg (
P
= 0,005, Student
t
-test) henholdsvis (figur 5A og 5B). Dessuten, ved behandling av Thiostrepton for 200 mikrometer /kg og 300 mikrometer /kg på dag 9, var det 47% og 52% reduksjon i tumorvekst sammenlignet med DMSO kontroll på dag 18 henholdsvis (
P
0,01, Student
t
-test) (figur 5A og 5B). Disse funnene markere at oppregulering av GRB7 kunne forbedre tumorvekst, mens du bruker enten U0126 eller Thiostrepton kan effektivt redusere tumorvekst av eggstokkreft celler både
in vitro Hotell og
in vivo
.
(A) GRB7 stabilt uttrykker A2780cp-celler (Acp-GRB7) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av nakne mus. Mus ble delt inn i 5 grupper (5 mus pr gruppe) og behandlet med enten DMSO som en kontroll, eller U0126 (25 eller 50 uM /kg) eller Thiostrepton (200 eller 300 pM /kg) for hver tre-dagers siden på dag 6 (piler representerer injeksjoner). Den relative tumorstørrelse ble beregnet i forhold til de i den første behandlingsdagen (dag 0), og er representert som relativ midlere størrelse (%) ± SE for hver gruppe (*
P
= 0. 032, **
P
0,01, og ***
P
= 0. 005, er vesentlig forskjellige fra DMSO kontrollgruppen, Student
t
-test). (B) De representative bilder og søylediagrammer viser gjennomsnittlig tumorvekt hver gruppe tatt på dag 18. (*
P
= 0. 043, **
P
= 0. 001, og ***
P
0,02, er vesentlig forskjellige fra DMSO kontrollgruppen, Student
t
-test)
diskusjon
i denne studien presenterer vi bevis for at GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 er økt i eggstokkreft. Interessant er det samtidig økning av GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 forbundet med høy grad av eggstokkreft. Viktigere, viser vi at disse faktorene er coordinately regulert i GRB7 /ERK /FOXM1 signale aksen i eggstokkreft celler. Funksjonelt, begrenser ERK aktivitet ved U0126 eller PD98059 og FOXM1 uttrykk ved Thiostrepton bemerkelsesverdig hemme kreft i eggstokkene celle migrasjon /invasjon og tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse funnene tydelig bevis på at den aktiveres GRB7 /ERK /FOXM1 signalkaskade spiller en viktig rolle i patogenesen av høyverdig eggstokkreft.
konstitutiv aktivering av ERK signalveien har vært involvert i menneskelig utvikling kreft [30] , [31], [32]. Faktisk, rettet mot denne veien for å bekjempe kreft hos mennesker har blitt tiltrukket mange forsøk på å utvikle effektive medisiner for de siste ti årene [15], [33], [34], [35]. Vi og andre har nylig funnet at GRB7 og dens variant GRB7v, blir ofte oppregulert i eggstokk-kreft og er i stand til å forbedre celle-proliferasjon, migrering /invasjon gjennom aktivering av ERK-signalveien [12], [36], [37]. På den andre aspektet, er nye bevis funnet at den avvikende oppregulering av FOXM1 transkripsjonsfaktor er involvert i patogenesen av forskjellige humane cancere [17], [21], [22], [38], [39]. Selv om alle disse abnormt aktiverte faktorer er overveiende assosiert med kreft patogenese, er det ingen rapport så langt å nevne den signaleringslenke blant GRB7, ERK-aktivitet og FOXM1 i humane kreftceller. I denne studien, ved hjelp av IHC analyse av eggstokkreft vev array, viser vi at GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 er samtidig økt i eggstokkreft prøver. Forbløffende nok deres uttrykk viser en trinnvis økning langs svulst karakteren av eggstokkreft. Faktisk, gir vår clinicopathological korrelasjonsanalyse ytterligere bevis på at deres oppregulert uttrykk signifikant assosiert med høyverdig tumor. Som vi vet, er dette den første rapporten som viser uttrykket status av disse faktorene som er involvert i utviklingen av eggstokkreft så langt. Alt i alt, disse funnene tyder på at GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 danne en onkogen konvergens i høyverdig eggstokkreft patogenesen. Derfor rettet mot denne signalkaskade kan oppnå et godt resultat ved behandling av denne type sykdom.
GRB7 er et kjent adapter som sender signaler fra reseptorer på celleoverflaten til bestemte nedstrøms signalkaskader via protein-protein interaksjon av sin Src -homology 2 (SH2) domene til en rekke av tyrosin-kinaser [7], [40], [41]. Vi og andre har tidligere rapportert at GRB7 er ofte overuttrykt og fremmer celleproliferasjon, cellemigrering og celle invasjon av kreft hos mennesker [10], [12], [42]. Gitt til sine viktige roller som signaltransduksjon molekyler i aktivere onkogene signalbaner, har mange studier forsøkt å utvikle inhibitorer målretting til SH2 domenet GRB7 for å hemme avvikende aktivering av relaterte signal aktiviteter og eliminere kreftceller [43], [44] , [45], [46]. For eksempel, en kombinasjon av Grb7 cyklisk peptid, G7-18NATE, med chemo-medikamenter var i stand til å inhibere brystcancer-cellevekst [47], [48], eller med spesifikt peptid-ligand for å undertrykke GRB7-mediert metastase i pankreatisk karsinom etc [11], [49]. Imidlertid er spesifisiteten og affiniteten er de viktigste hindringer påtreffes i utviklingen av disse inhibitorer som GRB7 rettede molekyl terapeutika [26], [49], [50]. Her er våre data viser at GRB7 regulerer ERK-aktivitet og den FOXM1 uttrykket ordnet og er i overensstemmelse med våre tidligere rapporter [12], [21], noe som indikerer at overuttrykt GRB7 forbedrer eggstokkreft cellevekst og cellevandring /invasjon gjennom heve ERK og FOXM1 aktiviteter. Derfor foreslo vi at undertrykke avvikende aktivert ERK og FOXM1 bør utøve lignende effekter ved bruk GRB7 inhibitor i begrenser de ovennevnte tumorigene egenskaper eggstokkreft celler. Faktisk vår
in vitro Hotell og
in vivo
tumorigene studier viser tydelig at eggstokkreft cellevekst og cellemigrasjon /invasjon er bemerkelsesverdig redusert på behandlinger av PD98059 eller U01260, og Thiostrepton via målretting MEK /henholdsvis ERK og FOXM1 aktiviteter. Enda viktigere, tumor undertrykkende effekter hentet fra enten U0126 /PD98059 eller Thiostrepton er likeverdige. Disse funnene synes å gi en alternativ tilnærming ved utvikling GRB7 målrettede behandlingsformer i eggstokkreft.
Oppsummert viser denne studien at avvikende aktivering av GRB7 /ERK /FOXM1 signalkaskade er signifikant korrelert med utviklingen av eggstokkreft . Målrette dette signaliserer aksen av MEK /ERK eller FOXM1 hemmere kunne få lovende effekt på signaltransduksjon basert terapi for denne sykdommen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Immunhistokjemisk analyse viste økt uttrykk for GRB7, ERK-fosforylering og FOXM1 var assosiert med avansert stadium eggstokkreft.
doi: 10,1371 /journal.pone.0052578.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Tvungen uttrykk for GRB7 øker tumorvekst i mus xenograft modell. Den GRB7 stabilt uttrykker A2780cp celler (ACP-GRB7) og tom vektor kontroll A2780cp celler (ACP-V) ble subkutant injisert i høyre flanke av hårløse mus (5 mus per gruppe). Tumorstørrelsen ble overvåket for hver 3-dag. De representative bilder og søylediagrammer viser gjennomsnittlig tumorvekt hver gruppe tatt på dag 18. (*
P
= 0,02, Student
t
-test)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052578.s002 product: (TIF)
takk
Vi takker professor Guan Jun-Lin, Institutt for Cell og utviklingsbiologi, Universitetet i Michigan, for å gi GRB7 full lengde cDNA.
