Abstract
En av de viktigste prognostiske faktorer i endetarmskreft er lymfeknutemetastase. Dannelsen av lymfeknutemetastaser er avhengig av at det finnes en premetastatic nisje. En viktig faktor foregående metastaser er lymfekar som er plassert i lymfeknute. Følgelig er forekomsten av intranodal lymphangiogenesis antatt å indikere fjern metastase og dårligere prognose. For å vurdere betydningen av lymfeknute lymphangiogenesis studerte vi formalinfikserte, parafin innebygd adenokarsinomer og regionale lymfeknuter av 203 endetarmskreftpasienter som ble behandlet med neoadjuvant radiochemotherapy og rad kurativ kirurgi med kreft gratis kirurgiske marginer (R0). Regionale lymfeknute lymfeårer ble oppdaget av immunhistokjemi for podoplanin (D2-40). Våre resultater viser at nærværet av lymfekarene i regionale lymfenoder betydelig påvirker den sykdomsfri overlevelse i univariate og multivariate analyser. I motsetning til dette var det ingen korrelasjon mellom peritumoral eller intratumoral lymfe fartøy tetthet og prognose. Faktisk viser vår studie hvor viktig lymphangiogenesis i regionale lymfeknuter etter neoadjuvant radiochemotherapy og påfølgende operasjon som selvstendig prognostisk markør. Farging for intranodal lymphangiogenesis og metoder for intra avbildning av lymphangiogenesis og lymfatiske flyt kan være en nyttig strategi for å forutsi langsiktig utfall i endetarmskreftpasienter. Videre tillegg av VEGF-hemmere til standardiserte neoadjuvant behandling ordninger kan angis i avansert endetarmskreft
Citation. Jakob C, Aust DE, Liebscher B, Baretton GB, Datta K, Muders MH (2011) Lymphangiogenesis i regionale lymfeknuter er en uavhengig prognostisk markør i endetarmskreft pasienter etter Neoadjuvant Treatment. PLoS ONE 6 (11): e27402. doi: 10,1371 /journal.pone.0027402
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: 20 september 2011; Godkjent: 17 oktober 2011; Publisert: 07.11.2011
Copyright: © 2011 Jakob et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ingen strøm eksterne kilder finansiere denne spesifikke studien. Vanligvis ble arbeidet til forskerne støttet med tilskudd til MHM (Wilhelm Sander Stiftung pels Krebsforschung) og KD (R01-NIH, CA140432)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Preoperativ (neoadjuvant) radiochemotherapy fulgt av kurativ kirurgi har blitt standard behandling i lokalavansert endetarmskreft [1]. Den histopatologiske tumor regresjon som et korrelat for lokal behandlingseffekt varierer fra ingen til minimale regressive forandringer for å fullføre svaret [2], [3]. Lymfeknute status etter neoadjuvant radiochemotherapy, men er fortsatt den viktigste uavhengige prognostiske faktoren for sykdomsfri overlevelse, som pasienter med post-terapeutiske positive lymfeknuter (YPN +) har en ugunstig prognose uavhengig av regresjon av primærtumor [2], [3], [4], [5], [6]. Dermed kan hemming av regionale lymfeknutemetastaser være en effektiv fremtid avenue i behandling av endetarmskreftpasienter. Derfor innsats har blitt gjort for å avdekke mekanismene for lymfeknutemetastase. Det har blitt foreslått at induksjon av lymphangiogenesis i den primære tumor og i lymfeknuter bidrar betydelig til tumormetastase [7], [8]. I denne studien har vi validert lymphangiogenesis i regionale lymfeknuter som en prediktor for dårlig prognose og tilrettelegger for fjernmetastaser i en kohort av neoadjuvant behandlet avanserte endetarmskreftpasienter. Det er en bedre prediktor enn peri- og intratumorale lymfe fartøy tettheter eller standardiserte tumor regresjon karaktersystemer for denne gruppen av endetarmskreftpasienter.
Resultater
Clinicopathological karakterisering av de evaluerte kohorten
Alle pasientene gjennomgikk rektum reseksjon med total mesorectal eksisjon etter neoadjuvant radiochemotherapy. Hos alle pasienter et lokalt kurativ reseksjon ble oppnådd (R0-situasjon). Patologisk staging er rapportert i tabell 1. Fullstendig tumorregresjon [9] ble observert i 10 tilfeller (5%). 57 pasienter erfaren tumorregresjon klasse 3 (28%). 85 pasienter viste tumor regresjon klasse 2 (42%) og 48 pasienter hadde tumorregresjon klasse 1 (23%). Ingen tumor regresjon ble observert hos 3 pasienter (1,5%). Ved median oppfølging av 223 uker (95% konfidensintervall 216,9 til 247,3 uker) 38 pasienter hadde tilbakefall av sykdommen, 32 utviklet fjernmetastaser og 6 lokale tilbakefall. Fjernmetastaser ble påvist i følgende organer: lever 15 (HEP), lunge 6 (PUL), fjern ikke-regionale lymfeknuter 3 (Lym), pleura 1 (PLE), hud 1 (HUD), bukhule 1 (PER), bein 2 (OSS), lever- og lunge 2 (HEP og PUL) og andre 1 (OTH). I disse tilfellene av sykdommen og fjernmetastaser ble bekreftet ved patologisk evaluering og eksamen. I åtte tilfeller klinisk informasjon (tilgjengelig ved en dokumentasjon assistent) ble brukt til å oppdage tilbakefall av sykdommen.
For å oppdage metastatiske tumorceller i lymfeknutene vi brukte standard HE farging samt Pan-Cytokeratin flekker ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig monoklonalt antistoff (Dako Inc) i minst tre serielle seksjoner av lymfeknute. En median på 14 regionale lymfeknuter per Saken ble undersøkt. Tilstedeværelsen av Pancytokeratin positive tumorceller er angitt lymfeknutemetastaser (fig. 1A).
A. Immunhistokjemi for Pancytokeratin å påvise lymfeknutemikrometastaser. B. Podoplanin farging med D2-40 i en lymfeknute med spredning. Den røde til brune flekker merkene lymfeårer. C. Podoplanin farging med D2-40 i en lymfeknute uten metastaser.
Association of regresjon av primærtumor og lymfeknutemetastase med clinicopathological parametere og prognostiske parametre
En signifikant korrelasjon var funnet mellom graderinger av tumor regresjon (fig. 2) og progresjonsfri overlevelse når dikotomisert for høy og lav tumor regresjon (p = 0,0033 Log-Rank) (fig. 3A) i Kaplan Meier analyse. Multivariat analyse viste en statistisk signifikant forskjell når man sammenligner TRG en og TRG 3 (tabell 2). Som i tidligere publiserte rapporter [2], [3], [4], [5], [6], vi også demonstrert at lymfeknutemetastase er en viktig uavhengig prognostisk faktor i vår kohort (p = 0,0017 Log-Rank) ( fig. 3B).
A. HE farget rektal adenokarsinom med tumor regresjon klasse 1 (40x). B. HE farget endetarmskreft vev med tumor regresjon klasse 1 (100x) C. Rektal kreft med tumor regresjon grad 2 (40x) D. Rektal adenokarsinom med tumor regresjon grad 2 (100x). E. Tumor regresjon grad 3 (100x) i endetarmskreft med ekstracellulært mucin akkumulering. F. lymfeknutemetastase regresjon klasse 2 (40x). G. lymfeknutemetastase regresjon grad 3 (40x). H. regionale lymfeknutemetastase (400x) i standard HE farging.
A. Tid til progresjon i uker i forhold til sannsynligheten for progresjonsfri overlevelse stratifisert for en dikotomisert tumorregresjon gradering (TRG 0/1/2 = ingen regresjon eller dominerende tumormasse med åpen fibrose eller mucin eller dominant fibrotisk eller mucinkjertler endringer, med tumorceller eller grupper; TRG 3/4 = svært få tumorceller i fibrotisk eller mucinous vev eller ingen kreftceller, bare fibrotisk eller mucinous masse /total regresjon;. henhold til Dworak et al 1997). B. Tid til progresjon i uker i forhold til sannsynligheten for progresjonsfri overlevelse stratifisert for lymfeknutemetastase (ypN0 og YPN +).
Association of peritumoral og intratumoral lymfe fartøy tetthet med lymfeknute metastase, UICC scenen, og prognostiske parametre
i et neste skritt vi evaluert peritumoral og intratumoral lymphangiogenesis (pLVD og iLVD) og dens forhold til metastaser i vår kohort. Lymphangiogenesis ble vurdert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig antistoff som gjenkjenner podoplanin (D2-40, Dako) (Fig. 1B og 1C). Farging er spesifikk for lymfesystemet endotelet og ikke beis ikke noen blodårer med påvisbare intraluminale erytrocytter. pLVD var ikke signifikant korrelert med lymfeknutemetastaser (p = 0,08 χ
2). Det var ingen signifikant korrelasjon mellom pLVD og ypUICC scene eller sykdomsfri overlevelse. I tillegg iLVD ikke korrelerer med prognose, lymfeknutemetastaser, eller ypUICC scenen.
Association of intranodal lymphangiogensis i regionale lymfeknuter med UICC scenen, progresjonsfri overlevelse og type tilbakefall
table -1-captionIn parallelt vurderes vi intranodal lymphangiogenesis ved farging regionale mesorectal lymfeknuter med D2-40 som tidligere beskrevet. En lymfeknute er klassifisert som positivt for intranodal lymphangiogenesis når minst en lymfe fartøy kan påvises i den follikulære eller /og interfollicular region av minst en mesorectal lymfeknute (betegnet som NLV +). I hovedsak i 102 pasienter alle lymfeknuter var negative for lymfeknute lymphangiogenesis, mens 43 pasienter i bare en lymfeknute påvisbar lymphangiogenesis kunne ses. I 58 pasienter mer enn en regional lymfeknute har påvisbar lymphangiogenesis.
Vi har funnet en statistisk signifikant korrelasjon mellom NLV + (lymphangiogenesis i det minste en mesorectal /regionale lymfeknuter) og tumor tilbakefall samt ypUICC trinn (tabell 1 ). Kaplan Meier-analyse viste en signifikant korrelasjon på NLV + med progresjonsfri overlevelse (p = 0,0071 logrank) i hele kohorten (fig. 4A). Videre NLV + var en uavhengig prognostisk faktor som studerte ved Cox regresjonsmodell med kovariatene ypUICC-trinns, alder, kjønn, tumor regresjon, intratumoral lymfe fartøy tetthet, peritumoral lymfe fartøy tetthet, og lymfeknute lymfe fartøy tetthet (tabell 2 ). Følgelig undergruppeanalyse fra node-negative pasienter som presentert en signifikant korrelasjon mellom NLV + og sykdomsfri overlevelse (Fig. 4B) under anvendelse av Kaplan-Meier-analysen. Når man sammenligner hyppigheten av levermetastaser hos pasienter med og uten mesorectal intranodal lymphangiogenesis (NLV +), fant vi flere levermetastaser hos pasienter med lymfeknute lymphangiogenesis (13 levermetastaser hos pasienter med intranodal lymphangiogenesis versus 2 levermetastaser hos pasienter uten intranodal lymphangiogenesis). Vi vurderte også antall lymfeårer (lymfe fartøy tetthet, nLVD) påvist i de regionale lymfeknuter. Her er den maksimale antall lymfekar detektert i en lymfeknute med lymphangiogenesis korrelerte signifikant med noden status (ypN0 eller YPN +; p = 0,01 χ
2) (figur 5B.). I motsetning til dette var det ingen korrelasjon av det maksimale antall lymfekar med fjernmetastaser. Når dichotomizing ifølge medianen av maksimal lymfeknute lymfe fartøy tetthet, kunne vi ikke påvise noen signifikant sammenheng med tid til progresjon. Også, antall lymfeknuter med lymphangiogenesis ikke korrelerer med ypUICC scenen eller svulst tilbakefall i undergruppen av pasienter med NLV +. Oppsummert nærvær av regionale lymfeknute lymfekar representerer en selvstendig prognostisk parameter, mens den nodal lymfe fartøyet tetthet, så vel som antallet lymfeknuter med detekterbar nodal lymphangiogenesis kan være av mindre betydning for generell prognosen.
«med lymfeknute lymphangiogenesis» er definert som minst en regional /mesorectal lymfeknute med påvisbare lymphangiogenesis i follikulær eller interfollicular området. A. Tid til progresjon i uker i forhold til sannsynligheten for sykdomsfri overlevelse stratifisert for tilstedeværelsen av lymfeknute lymphangiogenesis hos alle pasienter. B. Tid til progresjon i uker i forhold til sannsynligheten for sykdomsfri overlevelse stratifisert for tilstedeværelsen av lymfeknute lymphangiogenesis i node-negative pasienter.
A. Box plott som sammenligner antall lymfeårer i peritumoral region med tilstedeværelse eller fravær av lymfeknutemetastase. B. Boksplott sammenligne antall regionale lymfeknute lymfeårer i forhold med tilstedeværelse eller fravær av lymfeknutemetastaser hos pasienter med påviselige lymfeårer i de regionale lymfeknuter.
Association of lymfeknutemetastase regresjon gradering og prognose
i vår årsklasse, var det ingen statistisk signifikant sammenheng mellom lymfeknutemetastase regresjon gradering og tumorresidiv /sykdomsfri overlevelse i Kaplan Meier-modellen i alle pasienter og i subgruppeanalyser. I multivariate analyser ingen statistisk relevant sammenheng ble funnet.
Diskusjoner
Uansett tumorstørrelse og omfanget av invasjonen, regional lymfeknutemetastase (ypn +) er en viktig prognostisk faktor hos pasienter behandlet med neoadjuvant radiochemotherapy [2], [3], [4], [5], [6]. Derfor er det viktig å belyse de mekanismer lymfeknutemetastase så vel som hvor lymfeknutemetastase kan påvirke den samlede pasientens overlevelse. Selv om kontroversielle, peritumoral lymfekar er rapportert av noen å spille en rolle i å fremme lymfeknutemetastase i kolorektal karsinom [10], [11], [12], [13] [12], [14], [15]. Vi brukte D2-40 antistoff (Podoplanin, celleoverflaten sialylert glykoprotein) [16], [17] for å flekke lymfekar i grunnskolen adenokarsinomer og mesorectal lymfeknuter 203 endetarmskreftpasienter. Disse pasienter ble behandlet med preoperative radiochemotherapy etterfulgt av fullstendig kirurgisk fjerning av tumoren (R0). Våre resultater indikerer ingen signifikant korrelasjon mellom peritumoral og intratumoral lymphangiogenesis og pasient prognose. Interessant, observerte vi lymfeknute lymphangiogenesis var en viktig prognostisk parameter i denne pasient kohort. Som tidligere rapportert, kan lymphangiogenic vekstfaktorer som VEGF-C og VEGF-A migrere til de regionale lymfeknuter fra primærsvulster og fremme lymphangiogenesis [7], [18]. Vi kan forutsi et lignende fenomen i kolorektal cancer som nivået av VEGF-C ble vist å være forhøyet i blodserum fra pasienter med kolorektal kreft [19]. Det har blitt antatt at lymfeknute lymfekar kan fungere som en metastatisk nisje for kreftceller [7], [8], [20], [21] og forenkle den videre metastatisk transformasjon av tumorcellene. Dette kan føre til terapiresistent metastatisk kreft og er derfor ansvarlig for dårlig pasient prognose. Studier i andre kreftformer også indikere en lignende prognostisk betydning av lymfeknute lymphangiogenesis. I en B16 melanom musemodell ble det påvist at lymfeknute lymphangiogenesis er en tidlig respons på tumorvekst og tumormetastase forut [22]. Betydningen av Sentinel lymfeknute lymphangiogenesis på metastatisk spredning av brystkreft til ikke-fast punkt lymfeknuter er vist i humane pasienter. [23]. Lignende resultater som indikerer viktigheten av lymfeknute lymphangiogenesis ble rapportert i kreft i bukspyttkjertelen [8], plateepitel hode og nakke kreft [21], og extramammary Paget sykdom [20].
Multimodal forbehandling av lokalavansert endetarmskreft har vist terapeutiske fordeler for pasientene [24]. Tidligere er det blitt vist at lymphangiogenic vekstfaktorer, f.eks VEGF-C ble oppregulert av kreftceller under stress og fremmet sine stress-motstand evne, [25] ,, [26]. Derfor er det mulig at terapeutiske påkjenning i neoadjuvant behandling av endetarmskreft øker nivået av syntese av lymphangiogenic vekstfaktorer og øker dannelsen av lymfekar i regionale lymfeknuter. Dette fører til slutt til tumorresidiv og metastasering. Blokkering av lymphangiogenic aksen under neoadjuvant behandling bør derfor forbedre utfallet av dagens behandlingsmetoder for avansert stadium endetarmskreft. Foreningen av lymfeknute lymphangiogenesis og dårligere prognose foreslår videre rutinen påvisning av lymfeknute lymphangiogenesis som en viktig parameter for prediksjon av kreft tilbakefall og som en indikator for en mer aggressiv adjuvant behandling.
I konklusjonen, vår studie viser at tilstedeværelsen av intranodal lymphangiogenesis representerer en selvstendig prognostisk markør assosiert med kortere progresjonsfri overlevelse hos pasienter med lokalavansert endetarmskreft, som er behandlet med neoadjuvant radiochemotherapy. Derfor strategier for å oppdage lymfeknute lymphangiogenesis i klinisk setting kan bidra til å identifisere pasienter som vil ha nytte av mer aggressiv behandling. Dessuten ville inkludering av en terapeutisk tilnærming for å blokkere lymphangiogenesis være gunstig å neoadjuvantly behandlet avanserte endetarmskreftpasienter.
Materialer og metoder
Pasientmateriale
Materiale brukt i denne studien er omfattet av godkjennelse av etikk komité ved Universitetssykehuset «Carl Gustav Carus», TUD-medisinske fakultet, til bruk i forskning (EK59032007; «Feingewebliche und molekularpathologische Untersuchung i langzeit-archiviertem Gewebsmaterial des Instituts fuer Pathologie des Universitaetsklinikum Dresden /Medizinische Fakultaet Carl Gustav Carus, TU Dresden «, leder av komiteen: W. Kirch, MD). Avgjørelsen av etikk komité godkjente spesielt bruken av vevet materiale for dette minimalt invasive og retrospektiv studie som bruker pasientmateriale som har vært lagret i mer enn tre år. Alle pasienter samtykket til bruk av vev materiale for forskning (som nevnt i filer av pasientene). Ifølge Ethic komité muntlig samtykke er tilstrekkelig i denne saken (dette samtykke prosedyren er godkjent av Ethic komité) fordi materialet er brukt her ikke er knyttet til navnet på pasienten og er kodet. To hundre og tre pasienter (mannlig: n = 152, kvinnelige: n = 51, median alder = 70 år) med lokalavansert endetarms adenokarsinom (UICC stadium II /III) mellom 2001 og 2008 ble inkludert i denne studien (figur 1). Alle pasientene gjennomgikk preoperativ (neoadjuvant) 5-fluorouracil (5-FU) basert radiochemotherapy og kurativ R0 kirurgi i analogi til randomisert fase III tyske endetarmskreft Trials CAO /ARO /AIO-94 [1]. Dataene for sykdom tilbakefall (fjernmetastaser eller lokale residiv) samt andre relevante data ble hentet fra databasen ved Institutt for patologi, Universitetssykehuset «Carl Gustav Carus», Medisinsk fakultet ved Universitetet i Dresden, Tyskland.
Patologisk undersøkelse av kreftprøve etter neoadjuvant terapi
minst fire prøver ble tatt og evaluert fra primærendetarmskreft. I tilfelle av okkult rest kreft i løpet av grov undersøkelse, ble den fullstendige tidligere kreft område innleiret og undersøkt ved histologi. I tilfelle av fravær av gjenværende cancerceller i HE farging vitale epiteliale kreftceller ble oppdaget av cytokeratin farging. Denne prosedyren sikrer at terapi-indusert fibrose vev, så vel som ekstra-cellulære slimstoffansamlinger ikke ble betraktet som rest kreftvev og incuded i tumorregresjon gradering. Mesorectal regionale lymfeknuter ble dissekert i henhold til «Union inter contre kreft» (UICC). Ved undersøkelse av mindre enn tolv regionale mesorectal lymfeknuter perirectal fettvev (minimum ti parafinblokker) ble forankret og evalueres for forekomst av flere lymfeknuter som ikke var påviselig av brutto undersøkelse. For å oppdage gjenværende kreftceller Pancytokeratin farging ble utført som beskrevet.
Tumor og lymfeknutemetastase regresjon gradering
Histopatologisk tumor regresjon (TRG) innen primærtumor ble gradert etter semikvantitativ system etablert av Dworak et al. [9]: TRG 0 = ingen regresjon; TRG 1 = dominant tumormasse med åpen fibrose eller mucin; TRG 2 = dominant fibrotisk eller mucinkjertler endringer, med få tumorceller eller grupper; TRG 3 = svært få tumorceller i fibrotisk eller mucinous vev; TRG 4 = ingen tumorceller, bare fibrotisk eller mucinous masse /total regresjon [2] (fig. 2).
Bevis på tumorrespons til preoperative radiochemotherapy innenfor perirectal lymfeknutene ble definert som tilstedeværelse av nodal fibrose eller mucin bassenger (med eller uten gjenværende tumorceller), som beskrevet tidligere [27], [28]. Lymfeknutemetastase regresjon (LRG) ble evaluert med de samme parametere som den primære tumorregresjon vurderer hver metastatisk lymfeknute: LRG 0 = ingen regresjon; LRG 1 = dominant tumormasse med åpen fibrose eller mucin; LRG 2 = dominant fibrotisk eller mucinkjertler endringer, med få tumorceller eller grupper; LRG 3 = svært få tumorceller i fibrotisk eller mucinous vev; LRG 4 = ingen kreftceller, bare fibrotisk eller mucinous masse /total regresjon. Ikke-metastatiske lymfeknuter ble skjelnes fra de med total metastatisk regresjon (LRG 4) ved fravær av fibrose eller mucin (fig. 2). Når ulike LRGs ble funnet i en pasient, ble bare lymfeknute med den verste regresjon vurderes.
Immunohistochemistry
Immunohistokjemi ble utført på 2 mikrometer deler av parafininnstøpte blokker fra den primære svulsten og regionale lymfeknuter. Deparaffination, rehydrering, og antigen gjenfinning ble utført ved dampkoking (98 ° C, 45 min) i PT-modul-buffer (pH 8,0) (Thermo vitenskapelig, medac, Hamburg, Tyskland). Vevene ble vasket i Tris-bufret saltvann (TBS) (Thermo vitenskapelig, medac, Hamburg, Tyskland) og inkubert med monoklonalt mus anti-humant podoplanin detektere D2-40-antistoff (DAKO, Hamburg, Tyskland, 1:400 fortynning) i 30 min ved romtemperatur. Deretter ble endogen peroksydase-aktivitet inhiberes ved inkubering av lysbildene i 3% H
2o
2 i 10 minutter. Etter vasking i TBS, LP Ultra stort volum deteksjonssystem HRP Polymer (Thermo vitenskapelig, medac, Hamburg, Tyskland) ble brukt i henhold til produsentens anbefaling. Seksjonene ble farget med 0,5 mg /ml diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) og kontra farget med hematoksylin. I alle forsøkene ble positive og negative kontroller inkludert.
Evaluering av immunhistokjemi
lymph kar Tettheten ble bestemt ved «hot-spot» metoden som er beskrevet tidligere og er også referert til som Chalkley punkt graticule metode [29]. Kort sagt ble alle lysbilder skannet ved lav forstørrelse (x40) og de områdene med høyest tetthet av D2-40 positive skip ble identifisert. Deretter ble antallet D2-40 positive fartøy tellet i de områdene i fem høyeffekts felt (HPF, x400) ved to uavhengige patologer (CJ og MHM) uten kjennskap til de clinicopathological funn, og den midlere verdi av fartøyets tellinger var beregnet. Intratumoral (lymfeårer innenfor tumormasse) og peritumoral (lymfe fartøy utenfor av tumoren, men innenfor 2 mm fra tumorinvasjon foran) LVD ble bestemt separat. Fartøy nær sårdannelse områder ble ikke telles. LVD ble vurdert på alle dissekert mesorectal lymfeknuter inkludert nodemetastaser, rest lymfevev av metastatiske lymfeknuter (hvis denne finnes), og alle ikke-metastatiske lymfeknuter. Forhåndsdefinert intranodal fartøy (mellom samt marginal sinus) ble ikke telles. Under evalueringen høy interobserver avtalen ble bekreftet ved hjelp av Cohens Kappa koeffisient (κ = 0,8; p 0,001). Ved interobserver forskjeller, ble saken revurderes ved samtidig revurdering av prøven.
Statistisk analyse
Alle tester er utført ved bruk av SAS JMP versjon 9. Foreninger mellom ulike kategoriske variabler ble vurdert ved hjelp av χ
2 test. Kontinuerlige variabler ble sammenliknet med Mann-Whitneys U-test eller ANOVA. Tid til progresjon ble sammenliknet med den univariate analysen av Kaplan-Meier, multivariat analyse ble utført ved hjelp av Cox regresjonsmodellen med kovariatene ypUICC-scenen, alder, kjønn, tumor regresjon, intratumoral lymfe fartøy tetthet, peritumoral lymfe fartøy tetthet, lymfeknute lymfe fartøy tetthet. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Takk
Forfatterne takker Marissa J Stanton, University of Nebraska Medical Center, for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
