Abstract
Bakgrunn
For å forbedre livskvaliteten til pasienter med kolorektal kreft, er det viktig å etablere nye screeningmetoder for tidlig diagnostisering av tykk- og endetarmskreft.
metodikk /hovedfunnene
Vi utførte serum metabolomet analyse ved hjelp av gasskromatografi /massespektrometri (GC /MS). Først ble nøyaktigheten av vår GC /MS-baserte serum metabolomic analysemetode evaluert ved å beregne RSD% -verdier i serumnivåer av forskjellige metabolitter. For det andre ble det intra-dag (morgen, dagtid, og natt) og inter-dag (blant 3 dager) variasjoner i serum metabolitter undersøkt. Deretter ble serum metabolitter forhold mellom pasienter med kolorektal kreft (N = 60 N = 12 for hvert trinn 0-4) og alders- og kjønnstilpassede friske frivillige (N = 60) som en treningssett. Den metabolitter hvis nivåene vises betydelige endringer ble utsatt for multippel logistisk regresjonsanalyse hjelp av en trinnvis variabel valgmetoden, og en tykktarmskreft prognose modellen ble etablert. Prediksjonen modell var sammensatt av 2-hydroksybutyrat, asparaginsyre, kynurenine, og cystamin, og dets AUC, sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet var 0,9097, 85,0%, 85,0% og 85,0%, henholdsvis, i henhold til treningssettet data. I motsetning til dette, følsomhet, nøyaktighet og presisjon av CEA var 35,0%, 96,7% og 65,8%, henholdsvis, og de av CA19-9 var 16,7%, 100%, og 58,3%, respektivt. Gyldigheten av prediksjon modellen ble bekreftet ved hjelp av pasienter med kolorektal kreft (N = 59) og friske frivillige (N = 63) som en valideringssettet. Ved valideringssettet, følsomhet, nøyaktighet og presisjon av prediksjon modellen var 83,1%, 81,0% og 82,0%, henholdsvis, og disse verdiene var nesten de samme som de som ble oppnådd med treningssettet. I tillegg vises modellen høy sensitivitet for å påvise stadium 0-2 kolorektal kreft (82,8%).
Konklusjon /Betydning
Vår prognose modellen etablert via GC /MS-basert serum metabolomic analyse er verdifull for tidlig deteksjon av tykktarmskreft, og har potensial til å bli en ny screening test for tykktarmskreft
Citation. Nishiumi S, Kobayashi T, Ikeda A, Yoshie T, Kibi M, Izumi Y, et al. (2012) A Novel Serum Metabolomics-basert diagnose Approach for tykktarmskreft. PLoS ONE syv (7): e40459. doi: 10,1371 /journal.pone.0040459
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 28. mars 2012; Godkjent: 07.06.2012; Publisert: 11.07.2012
Copyright: © 2012 Nishiumi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskudd til Global COE Program, Global Center of Excellence for utdanning og forskning på signaloverføring Medicine i kommende generasjon fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) fra Japan (TK, TY, MK, TA, og MY); en Grant-in-Aid for Scientific Research på innovative områder fra MEXT av Japan (SN og TA); Utdanningsprogram for Specialized Klinikere i Support Program for bedre Graduate School Education fra MEXT av Japan (AI); og tilskudd til prosjektet forskning (utvikling av grunnleggende teknologi for analyse og evaluering av funksjonelle landbruksprodukter og funksjonell mat) fra Landbruksdepartementet, skogbruk og fiskeri (MAFF) fra Japan (MY). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste årsakene til kreft dødsfall i utviklede land [1]. Behandlingsmetoder basert på koloskopi og kirurgi har avansert raskt, og et stort antall pasienter med tykktarmskreft oppnå forbedringer etter terapi. Men reduserer avansert stadium kolorektal kreft livskvaliteten for pasienter som fikk kirurgisk behandling eller kjemoterapi. Derfor metoder som gjør at tidlig oppdagelse og diagnose av tykk- og endetarmskreft blir nå søkt. Fekal okkult blod test (FOBT) er den mest brukte screening metode for å diagnostisere tykktarmskreft og er en ikke-invasiv og billig metode. Imidlertid har FOBT lav følsomhet, spesielt for tidlig fase kolorektal kreft. Kolonoskopi er en mer nøyaktig og pålitelig metode for diagnostisering av tykktarmskreft, men det er vanskelig for pasienter eldre eller alvorlig syke å gjennomgå kolonoskopi, og dets høye pris er også et problem. Dermed undersøkelser som involverer en kombinasjon av konvensjonelle screening metoder har blitt brukt for diagnostisering av tykk- og endetarmskreft; Men slike undersøkelser bare oppdage om lag 40% av kolorektal kreft [2]. Derfor er det nødvendig å etablere nye screeningmetoder for tidlig diagnostisering av tykk- og endetarmskreft som er svært sensitive, spesifikke, lett, og ikke-invasiv.
Det menneskelige genom hadde blitt fullstendig identifisert ved utgangen av 2003. Siden da , proteomikk, som er den omfattende studie av hele settet av proteiner uttrykt av et genom, er blitt grundig undersøkt, og mange forskere har forsøkt å anvende proteomikk analyse for det medisinske feltet for å finne effektive diagnostiske markører og belyse ukjente patologiske tilstander [ ,,,0],3]. Nylig, metabolomics, som er den omfattende studie av lavmolekylære metabolitter, har også blitt utviklet. I klinisk forskning som involverer metabolomet analyse ved bruk av en kombinasjon av high-throughput væske-kromatografi /masse-spektrometri (LC /MS) og gass-kromatografi /masse-spektrometri (GC /MS), Sreekumar et al. viste at sarcosine er en potensielt viktig metabolsk mellommann for prostata kreft celle invasjon og aggressivity [4]. I tillegg ble en omfattende og kvantitativ analyse av de ladde metabolitter i tumor og normalt vev oppnådd fra kolorektal og magekreftpasienter utført ved anvendelse av kapillær elektroforese-massespektrometri (CE /MS) [5]. Således har forskjellige typer av kliniske prøver er analysert ved metabolomet analyse ved bruk av kjernemagnetisk resonans (NMR), GC /MS, LC /MS, CE /MS, og /eller matrise assistert laserdesorpsjon ionisering-massespektrometri (MALDI-MS) i for å belyse sykdomsutbruddet mekanismer og oppdage nye biomarkører [6]. Blant disse teknikkene, har GC /MS en lang historie og er enklere å bruke enn CE /MS eller MALDI-MS, selv om GC /MS har lav sensitivitet sammenlignet med LC /MS. Dessuten er det flere databaser av GC /MS-baserte serum metabolitt analyseresultater enn med LC /MS-baserte serum metabolitt analyseresultater. I tillegg kan GC /MS anvendes på store studier med relativ letthet på grunn av høy repeterbarhet. Derfor, i denne studien, serum metabolitter av kolorektal kreftpasienter og friske frivillige ble analysert ved GC /MS-analyse for å etablere nye diagnostiske verktøy for tykktarmskreft, og stabilitet og inter-dag og intra-dag variasjoner av disse serum metabolitter Det ble også evaluert. Ved hjelp av en treningssett bestående av pasienter med kolorektal kreft (N = 60) og friske frivillige (N = 60), var en tykktarmskreft varslingsmodell etablert via multippel logistisk regresjonsanalyse hjelp av en trinnvis variabel valgmetoden. Deretter ble gyldigheten av prognosemodellen vurdert ved hjelp av en validering sett bestående av pasienter med kolorektal kreft (N = 59) og friske frivillige (N = 63).
Metoder
Etikk og Deltakere
Denne studien ble godkjent av etisk komité ved Kobe universitet Graduate School of Medicine, og utført mellom februar 2009 og desember 2011. humane prøver ble brukt i samsvar med retningslinjene i Kobe universitetssykehus, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. For å beregne den relative standardavvik (RSD)% for de serum metabolomet analyseresultater oppnådd ved GC /MS ble blodprøver samlet inn fra en frisk 30-år gammel mann frivillig etter faste tidlig på morgenen, og serum ble separert ved sentrifugering ved 3000 xg i 10 min ved 4 ° C. Serumet ble overført til et rent rør og lagret ved -80 ° C inntil bruk. For å vurdere intra-dag variasjon i serum metabolitter, ble fullblodprøver innsamlet fra friske frivillige (n = 16) på 8:00-9: 00 am før frokost, 24:00-1: 24:00 før lunsj og 18:00-7: 00 pm før middag. For å evaluere den inter dag variansen i serum metabolitter, fullblod (n = 16) ble oppsamlet ved 8:00-9: 00 a.m. før frokost en gang daglig i totalt 3 dager. For treningssettet, ble 60 serumprøver hver innhentet fra kolorektal kreft pasienter og friske frivillige etter faste i tidlig morgen. For valideringssettet, ble 59 og 63 serumprøver innsamlet fra kolorektal kreft pasienter og friske frivillige, henholdsvis. Serumprøver fra pasienter med kolorektal kreft var samlet på Kobe universitetssykehus. Ingen av kreftpasienter hadde noen kompliserende sykdommer. Pasientene ble diagnostisert ved mikroskopi, biopsi, eller kirurgisk fjerning og klassifisert ved hjelp av den sjette utgaven av International Union Against Cancer klassifisering (UICC). Serumprøver fra friske frivillige ble hentet fra Kobe universitetssykehus og to andre fasiliteter. I Kobe universitetssykehus ble det bekreftet at det ikke er unormalt med blodprøver, endoskopiske undersøkelser, bildediagnostikk og /eller medisinsk intervju. På to andre fasiliteter, ble friske frivillige valgt via helsesjekk inkludert blodprøver, endoskopiske undersøkelser, bildediagnostikk og /eller medisinske intervjuer. Enkeltpersoner som hadde blitt diagnostisert som krever behandling, detaljerte undersøkelser og /eller observasjoner ble ikke behandlet som friske frivillige. Karakteristikkene for alle fag er oppsummert i tabell 1, Tabell S1, og Tabell S2.
Eksperimentelle metoder
ekstraksjon av lavmolekylære metabolitter ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet i vår forrige rapport [7]. Kort beskrevet ble 50 ul av serum blandes med 250 ul av en løsningsmiddelblanding (MeOH: H
2o: CHCI
3 = 2,5: 1: 1) inneholdende 10 ul 0,5 mg /ml 2-isopropylmalic syre (Sigma -Aldrich, Tokyo, Japan) oppløst i destillert vann som en intern standard, og deretter ble løsningen ristet ved 1200 rpm i 30 minutter ved 37 ° C, før den ble sentrifugert ved 16 000 x g i 3 minutter ved 4 ° C. To hundre og tjuefem ul av den resulterende supernatanten ble overført til et rent rør, og 200 pl destillert vann ble tilsatt til røret. Etter å ha blitt blandet, ble oppløsningen sentrifugert ved 16 000 x g i 3 minutter ved 4 ° C, og 250 ul av den resulterende supernatanten ble overført til et rent rør, før de ble frysetørket ved anvendelse av en frysetørker. For oksimering, ble 40 ul 20 mg /ml methoxyamine hydroklorid (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) oppløst i pyridin blandes med en frysetørket prøve, før den ble ristet ved 1200 rpm i 90 minutter ved 30 ° C. Deretter ble 20 ul N-metyl-N-trimetylsilyl-trifluoracetamid (MSTFA) (GL Science, Tokyo, Japan) tilsatt for derivatisering, og blandingen ble inkubert ved 1200 rpm i 30 minutter ved 37 ° C. Blandingen ble deretter sentrifugert ved 16 000 x g i 5 min ved 4 ° C, og den resulterende supernatanten ble underkastet GC /MS-måling.
I henhold til den metoden beskrevet i en tidligere rapport [8], GC /MS analysen ble utført ved hjelp av en GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Co, Kyoto, Japan) med en smeltet silika kapillær kolonne (CP-SIL 8 CB lav blø /MS, 30 m × 0,25 mm indre diameter, tykkelse: 0,25 mikrometer; Agilent Co., Palo Alto, California). Den fremre innløpstemperatur var 230 ° C. Strømningshastigheten av heliumgass gjennom kolonnen var 39,0 cm /sek. Kolonnetemperaturen ble holdt ved 80 ° C i 2 minutter og deretter hevet med 15 ° C /min til 330 ° C og holdt der i 6 min. Overføringsledningen og ione-kilde temperaturer var 250 ° C og 200 ° C, respektivt. Tjue skanninger per sekund ble registrert over masseområdet 85-500 m /z hjelp av Avansert skanning Speed Protocol (ASSP, Shimadzu Co.). I denne studien ble deteksjons spenning bekreftet hver dag før GC /MS-analyse, fordi denne verdien reflekterer over graden av forurensning i instrumentet. I tillegg ble de blanke prøvene målt før måling av serumprøvene. Under GC /MS-analyse, ble 20 prøver pr 1 dag målt, og septum og glassforing i GC-inntak ble skiftet hver 100 injeksjoner til kolonnen.
Databehandlingen ble utført i henhold til metodene beskrevet i tidligere rapporter [8], [9]. Kort fortalt ble MS data eksporteres i NetCDF format. Den toppdeteksjon og justeringen ble utført ved anvendelse av programvaren MetAlign (Wageningen UR, Nederland). De resulterende data ble eksportert i CSV-format og deretter analysert med in-house analytisk programvare (AIoutput). Denne programvaren gir topp identifisering og semi-kvantifisering ved hjelp av en in-house metabolitt bibliotek. For semi-kvantifisering ble topphøyden av hvert ion beregnet og normalisert til topphøyden av 2-isopropylmalic syre som en indre standard. Navn ble tildelt hver metabolitt topp basert på fremgangsmåten som er beskrevet i en tidligere rapport [9]. Alle data oppnådd fra serumprøvene ble underkastet MetAlign programvare på en gang, fordi de samme justerings betingelser som er nødvendig for å bli utført i løpet av hele dataanalyse. I GC /MS-analyse, er flere topper noen ganger registrert for en spesiell metabolitt grunn av TMS-derivatisering, isomer form, etc. I slike tilfeller er det mest reflekterte nivået av metabolitten ble tatt i bruk for semikvantitativ evaluering topp.
Statistical Analysis
de pasientene (N = 119) ble tildelt til trening og valideringssett som følger. De kolorektal kreft pasientprøver for treningssettet ble samlet uten forhåndsdefinerte kriterier, og 12 pasienter med kolorektal kreft ble valgt for hvert stadium av sykdommen (N = 60). Som for friske frivillige som brukes for treningssettet, ble alders- og kjønns kontrollert prøver forberedt (N = 60). I treningssettet studien ble nivåene av metabolitter i forhold mellom pasienter med kolorektal kreft og friske frivillige ved hjelp av Mann-Whitney U-test. Blant de metabolitter som viste signifikant forskjellige nivåer mellom gruppene (
p
0,05), valgte vi metabolittene med RSD% verdier av ikke mer enn 20%, og som ikke viser signifikant intra-dag eller inter- dag avvik ifølge Wilcoxon signed-rank test og stål-Dwass test, henholdsvis. De valgte metabolitter ble underkastet et trinnvis utvalg med variabel metode, etterfulgt av multippel logistisk regresjonsanalyse, og disse analyser ble utført ved anvendelse av standardbetingelser JMP9 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Den Multikolineæritet av de utvalgte via trinnvis variabel valgmetoden metabolitter ble bekreftet ved å beregne sine varians inflasjonen faktorer (VIF). AICC, som er Akaike informasjons Criterion (AIC) med en korreksjon for begrensede utvalgsstørrelser, ble beregnet å belyse det optimale antallet faktorer å ta med i prognosemodell. Nagelkerke R
2 ble også beregnet for å vurdere egnethet av multivariate logistiske modellen. Mottaker som opererer karakteristikk (ROC) analyse ble utført ved anvendelse JMP9 (SAS Institute Inc.), og den optimale cut-off-verdi og AUC, spesifisitet, følsomhet og nøyaktighet ble beregnet. I valideringssettet studien, prediksjon modellen ble undersøkt på nytt ved hjelp av forskjellige prøver, og den spesifisitet, sensitivitet og nøyaktighet av modellen ble undersøkt ved hjelp av cut-off-verdien oppnås fra treningssettet.
p
verdier på mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere en betydelig forskjell.
Resultatene
I vår GC /MS-baserte metabolomic analysesystem, som i hovedsak rettet mot vannløselige metabolitter, 132 metabolitter ble påvist i fagenes sera (tabell S3). Blant de 132 metabolitter, en metabolitt; dvs. 2-isopropylmalic syre, ble anvendt som en intern standard, og 5 metabolitter ble sannsynligvis ekstrahert fra ikke-serum, for eksempel, de ble avledet fra Eppendorf-rør. Derfor ble disse 6 metabolitter ekskludert fra de påfølgende analyser. Siden oxalacetic syre ble omdannet til pyruvat under pre-behandling prosedyre, ble oxalacetic syre detektert som pyruvat i vårt system. Derfor er det beskrevet som «pyruvat + oxalacetic syre» i den understøttende bord og som «pyruvat», som faktisk ble påvist ved hjelp av GC /MS-analyse, i dette manuskriptet. På grunn av deres tilsvarende strukturer, ble sitronsyre og isositronsyre detektert på samme retensjonstid ved systemet. Derfor er de beskrevet som «sitronsyre + isositronsyre «. Siden cysteamin ble omdannet til cystamin under pre-behandling prosedyre, ble cysteamine detektert som cystamin av systemet vårt. Derfor er det beskrevet som «cysteamin + cystamin «i bærebord og som» cystamin «, som faktisk ble påvist ved hjelp av GC /MS-analyse, i dette manuskriptet. Siden cystein ble konvertert til cystin under pre-behandling prosedyre, ble cystein detektert som cystin av systemet vårt. Derfor er det beskrevet som «cystein + cystin «i bærebord og som» cystin «, som faktisk ble påvist ved hjelp av GC /MS-analyse, i dette manuskriptet.
For å bedømme stabiliteten av dette system under anvendelse av human serum, serumnivåene av ulike metabolitter separat analysert ved hjelp av serumprøver (N = 10) hentet fra en friske frivillige (mann, 30 år gammel), og deretter RSD% verdiene av metabolittene ble beregnet (tabell S3). Prosentandelen av metabolitter med RSD% -verdier på mindre enn 20% og 30% var 68,5% og 86,5%, respektivt. Deretter ble den inter-dag (blant 3 dager) og intra-dag (morgen, dagtid, og natt) variasjoner av serum metabolitter evaluert ved bruk av Wilcoxon signed-rank test og stål-Dwass test, henholdsvis (tabell S3), fordi den betydelige intra-dagen og /eller inter-dagers varians er egnet til å føre til lav sensitivitet og spesifisitet ved klinisk bruk. Mange metabolitter ble ikke vist signifikante inter-dag og intra-dagers avvik, men 30 metabolitter, for eksempel Dihydroxyacetone og tryptofan, viste betydelig variasjon. I GC /MS-analyse, er flere topper noen ganger registrert for en spesiell metabolitt grunn av TMS-derivatisering, isomer form, etc. I slike tilfeller, ble den topp som mest gjenspeiler nivået av metabolitten vedtatt for den etterfølgende vurdering. For disse metabolittene, begrepene «_1 «,» _2 «, og» (-TMS) «ble lagt til endene av navnene sine i henhold til metoden for en tidligere rapport [9]. De ekskluderte toppene er indikert med begrepet «Minor» i tabell S4, og etter eksklusive «mindre» topper totalt 107 metabolitter hadde sine nivåer sammenlignet mellom kolorektal kreftpasienter og friske frivillige (figur 1, tabell S4).
Den midlere fold endringer i nivåene av 107 metabolitter observert i en sammenligning mellom pasienter med kolorektal kreft (N = 60) og friske frivillige (n = 60) (treningssett) er vist i figur 1. i GC /MS-analyse, flere topper er noen ganger registrert for en spesiell metabolitt grunn av TMS-derivatisering, isomer form, etc. i slike tilfeller er det mest reflekterte nivået av metabolitten ble tatt i bruk for senere evaluering topp. I tillegg har hver metabolitt hadde begrepet «_1 «,» _2 «, eller» (-TMS) «legges til på slutten av navnet, som beskrevet i en tidligere rapport [7]. Dette tallet inkluderer ikke bakgrunns metabolitter eller mindre peak-derived metabolitter.
I opplæringen sett studien, serum metabolitter av kolorektal kreftpasienter og helsepersonell frivillige ble sammenlignet med Mann-Whitney U test (tabell S4). Treningen sett besto av pasienter med kolorektal kreft (N = 60) og alders- og kjønnstilpassede friske frivillige (N = 60) (Tabell 1, Tabell S1). Det var ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig alder eller BMI verdiene av de to gruppene (Tabell 1). I denne studien ble tykktarmskreft også klassifisert i 2 grupper; dvs. en gruppe inkludert stadium 0, 1, 2 og sykdom (fravær av invasjon og metastase) og gruppe 2 inkludert trinn 3 og 4 sykdom (nærvær av invasjon og metastase). Fra resultatene av GC /MS-analyse ble 27 metabolitter som møtte de følgende betingelser valgt som kandidater biomarkør: en RSD% verdi av 20%; ingen signifikant (p≥0.05) intra-dag eller inter-dagers avvik i henhold til Wilcoxon signed-rank test og stål-Dwass test; og nærværet av en signifikant forskjell (p 0,05) mellom nivåene av pasientene med kolorektal kreft og friske frivillige i henhold til Mann-Whitney U-test. ROC-kurver ble fremstilt ved bruk av data for disse 27 metabolitter, (fig S1), og cut-off-verdien, AUC, sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet av hver metabolitt ble beregnet (tabell 2). Som et resultat, viste nonansyre- (C9) og p-hydroksybenzosyre forholdsvis høy følsomhet, med verdier på 86,7% og 90%, respektivt. Når det gjelder spesifisitet, cystamin og cystin både oppviste verdier på 90%, og ornitin (86,7%), citrullin (85,0%), og palmitoleat (85,0%) også viste relativt høy spesifisitet. Men det var ingen metabolitter med nøyaktighet verdier på mer enn 80%, noe som tyder på nødvendigheten av å foreta evaluering ved hjelp av flere metabolitt biomarkører.
Som en ny evaluering metode, anvendelse av en multippel logistisk regresjonsmodell som involverer flere metabolitt biomarkører ble undersøkt. Blant de 27 metabolitter ble 10 metabolitter som viste størst forskjeller mellom deres nivåer i pasienter med kolorektal kreft og de i friske frivillige og hadde høyere nivåer i pasienter med kolorektal kreft sammenlignet med friske frivillige valgt: cystamin, cystin, asparaginsyre syre, arabinose, p-hydroksybenzosyre, glutaminsyre, 2-hydroksybutyrat, kynurenine, meso-erytritol, laktitol og (tabell 3). De fleste av disse metabolittene viste signifikant-endrede nivåer i den fasen 0-4 (N 60 =), stadium 0-2 (N = 36), og scene 3-4 (N = 24) grupper. Blant disse metabolittene, er arabinose, meso-erytritol, laktitol og ofte forbrukes i dietten. Derfor ble de gjenværende 7 metabolitter underkastet en trinnvis variabel utvelgelsesmetode. Som et resultat, 2-hydroksybutyrat, asparaginsyre, kynurenine, og cystamin ble valgt. Disse 4 metabolitter ikke vise Multikolineæritet (data ikke vist). Deretter ble en multippel logistisk regresjonsmodell for å forutsi kolorektal kreft etablert på grunnlag av data for disse metabolittene (tabell 4)
prediksjon modellen er som følger:.
p = 1 /[1 + e – {- 8,32 + 286,59 (2-hydroksybutyrat) 33,87 (asparaginsyre) 1634,96 (kynurenine) 78,78 (cystamin)}]
Nagelkerke R
2-verdien var 0,4533. AUC, sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet av denne modellen var 0,9097 {95% konfidensintervall (95% CI): 0,8438 til 0,9495}, 85,0%, 85,0% og 85,0%, henholdsvis (tabell 5, figur 2). Selv om vi har valgt 2, 3, 5 eller 6 metabolitter via trinnvis variabel valgmetoden og deretter utført ytterligere multippel logistiske regresjonsanalyser, kunne vi ikke opprette en bedre modell (data ikke vist). Tvert imot, når treningssettet data ble anvendt, følsomhet, nøyaktighet og presisjon av CEA var 35,0%, 96,7% og 65,8%, henholdsvis, og de av CA19-9 var 16,7%, 100%, og 58,3% hhv. Vår prognose modellen viste også høy følsomhet (83,3%) i den fasen 0-2 tykktarmskreft pasientgruppen, mens CEA og CA19-9 vises følsomheten til 30,6% og 5,6%, henholdsvis.
Den faste kurve er ROC-kurven for prediksjon modellen etablert på grunnlag av treningssettet. AUC og cut-off verdiene var 0,9097 {95% konfidensintervall (95% CI): 0,8438 til 0,9495} og 0,4945, henholdsvis. Følsomhet, spesifisitet og nøyaktighet av denne modellen er oppsummert i tabell 5.
De 27 metabolitter valgt i treningssettet (Tabell 2) og den etablerte prognosemodellen ble undersøkt ved hjelp av valideringssettet, som var sammensatt av pasienter med kolorektal kreft (N = 59) og friske frivillige (N = 63) (Tabell 1, Tabell S2). Når det gjelder de 27 metabolitter, ble sensitiviteten, spesifisitet og nøyaktighet av treningssettet delvis korrelert med de for valideringssettet, og korrelasjonskoeffisientene for disse parametrene var 0,425, 0,655, og 0,587, respektivt (figur S2). Imidlertid viste ingen av metabolittene høy sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet verdier (tabell 2). Tvert imot, når valideringssettet ble anvendt følsomhet, nøyaktighet og presisjon av prediksjon modellen var 83,1%, 81,0% og 82,0%, henholdsvis, og disse verdiene var nesten de samme som de som ble oppnådd med treningssettet (tabell 5). I tillegg modellen viste også høy sensitivitet for påvisning av stadium 0-2 kolorektal kreft (82,8%).
diskusjon
I denne studien undersøkte vi en ny screening-fremgangsmåte for tidlig diagnose av kolorektal kreft basert på GC /MS metabolomics. Selv om treningssettet inkluderte pasienter med tidlig stadium kolorektal kreft, for eksempel scenen 0 eller trinn 1, vises prediksjon modellen høy AUC (0,9097), følsomhet (85,0%), og nøyaktighet (85,0%) verdier, noe som var høyere enn de av serum tumormarkører (CA19-9 og CEA). I tillegg, når valideringssettet ble anvendt på modell oppviste også høy følsomhet for tidlig fase kolorektal kreft (83,1%). Til sammen synes patogenesen av tykktarmskreft å føre til endringer i nivåene av en rekke serum metabolitter, selv om disse svingningene varierer fra liten til stor.
Evalueringer av data innhentet av metabolomics bør behandles forsiktig. For eksempel, blant serum metabolitter oppdaget av vår GC /MS-baserte metabolomic system, ble intra-dag og inter-dagers avvik observert. For eksempel ble tryptofan konsentrasjoner observert i ettermiddag og om natten betydelig redusert sammenlignet med de som påvises i morgen (tabell S3 og fig S3), og disse forskjellene kan ha vært grunnet virkningen av dietten og /eller daglig aktivitet. Tidligere studier har også demonstrert intra-dag og varians inter-dag i nivåene av noen aminosyrer [10], [11], [12]. Derfor er det viktig å evaluere den inter-dagers og intra-dagers variasjoner i serum metabolitter i metabolomic forskning, og blodprøver samlet før frokost ble anvendt i denne studien. I tillegg bør nøyaktigheten av data oppnådd ved instrumentell analyse av serumprøver vurderes nøye fordi den kan bli påvirket av den anvendte metode. Derfor, for å oppdage nye pålitelige metabolitt biomarkører, beregnet vi at RSD% verdiene for serum metabolitt-nivåer ble oppnådd ved hjelp av GC /MS-analyse, og deretter evalueres den inter dag og intra-dag avvik i konsentrasjonen av hvert serum metabolitt. I GC /MS-analyse, er flere topper noen ganger registrert for en spesiell metabolitt. For eksempel, det er variasjoner i antall TMS molekyler som binder til visse molekyler, og derfor blir større og mindre topper som detekteres. De små topper kan være ustabile, noe som kan føre til feil tolkning av dataene. Egentlig, i denne studien RSD% verdiene oppnådd ved å utelate resultatene for de mindre peak-derived metabolitter var bedre enn de som oppnås ved hjelp av alle de data: når alle data ble brukt, hvor mange prosent av metabolitter med RSD% verdier på mindre enn 20 % og 30% var 68,5% og 86,5%, respektivt. I kontrast, når resultatene for de mindre peak-derived metabolitter ble utelatt, var de 72,0% og 90,0%, henholdsvis. Således er nøyaktig evaluering av data oppnådd ved metabolomikk ventet å gi nyttig informasjon. Basert på disse vurderingene ble 27 metabolitter valgt som metabolitt biomarkør kandidater, men disse metabolittene viste individuelle AUC-verdier på 0,6-0,8 og relativt lav følsomhet eller spesifisitet (tabell 2), noe som indikerer at enkelt metabolitt biomarkører er ikke praktisk for sykdom screening og /eller diagnose og at bruken av flere biomarkører kan være bedre for å oppdage kandidater med høy sensitivitet og spesifisitet, selv om metabolomic tilnærminger har blitt mye brukt for å oppdage enkelt sykdom biomarkører. Deretter, med sikte på å vurdere nytten av flere biomarkører for diagnostisering av kolorektal kreft, multippel logistisk regresjonsanalyse hjelp av en trinnvis variabel valgmetoden (i denne undersøkelsen) og hovedkomponentanalyse (PCA) (data ikke vist) ble utført. Imidlertid PCA ikke produsere verdifulle resultater. PCA er en analytisk metode for å analysere et redusert antall variable; det vil si, det er en dimensjon reduksjon teknikk, og har ingen avhengige variabler. Tvert imot, kan multippel logistisk regresjonsanalyse med den trinnvise variabel valgmetoden brukes for å velge den optimale delsett av variabler og krever avhengige variabler. Dermed PCA kan være uegnet for store studier fordi det kan gi uventede forskjeller mellom gruppene som sammenlignes, selv om veiledet PCA, kan delvis minste kvadraters diskriminant analyse (PLS-DA), og ortogonale PLS-DA (OPLS-DA) være aktuelt å etablere diagnose modeller, fordi diskriminering mellom pasienter med kolorektal kreft og kontrollene ble vist via OPLS-DA [13]
Den etablerte prognosemodellen var sammensatt av 4 metabolitter.; dvs. 2-hydroksybutyrat, asparaginsyre, kynurenine, og cystamin (cysteamin + cystamin). 2-hydroksybutyrat er dannet som et biprodukt under dannelsen av α-ketobutyrat via en reaksjon som katalyseres av laktat-dehydrogenase eller α-hydroksybutyrat dehydrogenase. I en tidligere studie [13], ble det økte nivå av 2-hydroksysmørsyre i sera fra pasienter med kolorektal kreft observert, å være i overensstemmelse med våre resultater. Serum α-hydroksybutyrat dehydrogenase og total laktat-dehydrogenase-aktivitet i ovarier kreftpasienter var betydelig høyere enn de til pasienter med godartet ovarial tumor [14], men nivået av melkesyre i kolorektal kreft var lavere enn hos friske frivillige (tabell S4) . Derfor vil to-hydroksybutyrat ikke fremstilles i blodet ved laktatdehydrogenase, men den enzymatiske produksjon av 2-hydroksybutyrat med α-hydroksybutyrat dehydrogenase kan være forårsaket i blod og /eller 2-hydroksybutyrat ville bli utskilt fra celler.
