Abstract
androgen reseptor (AR) uttrykkes i en undergruppe av prostata stromale celler og funksjonell stromal celle AR er nødvendig for normal prostata utviklings og påvirker veksten av prostatakreft. Selv om vi er stort sett klar over detaljene i de genomiske handlingene til AR i prostata kreft celler, er relativt lite kjent angående genet målene for funksjonell AR i prostata stromale celler. Her beskriver vi en roman menneskelige prostata stromal celle modell som gjorde oss i stand til å studere effekter av AR på genuttrykk i disse cellene. Modellen innbefatter en genetisk manipulert variant av udødeliggjorte humane WPMY-1 prostata stromale celler som overuttrykker villtype-AR (WPMY-AR) ved et nivå som kan sammenlignes med LNCaP-celler og er responsive til dihydrotestosteron (DHT) stimulering. Bruk av WPMY-AR celler for genekspresjon profilering viste at nærværet av AR, selv i fravær av DHT, betydelig forandret genekspresjon mønster av cellene sammenlignet med kontroll (WPMY-vec) celler. Behandling av WPMY-AR-celler, men ikke WPMY-VEC kontrollceller, med DHT resulterte i ytterligere endringer som påvirket ekspresjonen av gener 141 ved to-ganger eller større sammenlignet med vehikkelbehandlede WPMY-AR-celler. Bemerkelsesverdig, DHT downregulated betydelig flere gener enn var oppregulert, men mange av disse endringene reverseres de første effektene av AR overekspresjon alene på enkelte gener. Genene mest avviklet av DHT behandling ble kategorisert basert på deres rolle i kreftveier eller i cellesignalveier (transformerende vekstfaktor-β, Wnt, pinnsvin og MAP-kinase) antas å være involvert i stromal-epitelial krysstale i løpet av prostata eller prostatakreft utvikling. DHT behandling av WPMY-AR-celler var også tilstrekkelig til å endre sin parakrint potensial for prostata kreft celler som kondisjonert medium fra DHT-behandlet WPMY-AR betydelig økt vekst av LNCaP celler sammenlignet med DHT-behandlet WPMY-Vec celle kondisjonert medium.
Citation: Tanner MJ, Welliver RC Jr, Chen M, Shtutman M, Godoy A, Smith G, et al. (2011) Effekter av androgen Receptor og Androgen på genuttrykk i prostata stromal fibroblaster og parakrint aliserte til prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (1): e16027. doi: 10,1371 /journal.pone.0016027
Redaktør: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College of Cornell University, USA
mottatt: 12 oktober 2010; Godkjent: 02.12.2010; Publisert: 18 januar 2011
Copyright: © 2011 Tanner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Equinox Foundation og Stiftelsen Medical Research i Albany, New York. MT var en American Urological Association (URA) Foundation stipendiat. MC og AG er mottakere av Department of Defense (DoD) Prostate Cancer Research Program (PCRP) Postdoktor Stipend (W81XWH-10-100125 [MC] og W81XWH-09-1-0330 [til AG]). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den prostatakjertel krever androgene steroider for utvikling, voksen vedlikehold og funksjon. Hanner med inaktiverende mutasjoner i nøkkelgener som kreves for androgen metabolisme utvikle bare en elementær prostatakjertel [1] og hanner med inaktiverende mutasjoner i androgenreseptoren (AR) genet, som formidler effektene av androgener, utvikler ikke prostata [2]. Androgener og AR handling spiller også en viktig rolle i prostata kreftutvikling. Legemidler som hemmer androgen biosyntese har chemopreventative effekter som reduserer risikoen for å utvikle prostatakreft hos menn [3] og androgen ablasjonsterapier gi den mest klinisk nyttig middel for palliativ sykdomskontroll når prostatakreft oppdages i avansert stadium [4]. Disse kliniske fakta identifisere relevansen av androgen system for prostata biologi og karsinogenisitetsstudier og drive forskningsinnsatsen for å karakterisere konsekvensene av androgen signalisering i prostata celler.
Siden AR protein er en utvidet medlem av atomtranskripsjonsfaktor som betinget regulerer uttrykket av gener [5], er det rimelig å forvente at tilgjengeligheten av en omfattende katalog av androgen regulerte gener i prostataceller kunne bidra vesentlig til vår kunnskap om androgen action i prostata. For dette formål er bruken av moderne masse genekspresjon profilering teknologi, spesielt involverer genet mikromatriser på Chips, har allerede sterkt utvidet liste over kjente androgen-regulerte gener i prostatakreftceller [6] – [9]. Studier ved hjelp av denne tilnærmingen har støttet eventuell identifisering av nye genetiske avvik (ETS gene rearrangements) [10] – [12], og har bidratt til å identifisere unormalt aktive signalveier i prostatakreftceller [13], [14] som har translasjonsforskning potensial for forbedring av prostata kreft diagnose eller behandlingsstrategier. Denne typen teknologi har imidlertid ennå ikke blitt anvendt for å karakter androgen /AR-effektene på genekspresjon i prostata stromale celler, til tross for den omfattende bevis for at celler fra prostata stroma delta aktivt i de prosesser hvor androgener regulerer normal eller ondartet prostata utvikling [15] – [19]. Hovedårsaken til dette underskuddet er mangelen på egnede dyrkede humane prostata stromale cellemodeller som robust uttrykker AR-protein og som er påviselig reaksjon på nærværet av androgener som angitt ved endringer i genekspresjon når de dyrkes i et medium inneholdende androgen. Her beskriver vi vår erfaring i å teste noen tilgjengelige (godartet) menneskelige prostata stromal cellemodeller for deres respons til androgener
in vitro Hotell og i å utvikle en bestemt androgen-responsive menneskelige prostata stromal celle modell (WPMY-AR-celler) som ble profilert for AR- og androgen-induserte endringer i genuttrykk ved bruk av menneskelige gen-Chip mikromatriser. Videre brukte vi denne modellen cellesystem for å teste ideen om at androgener endre parakrint signale miljø av en prostata svulst ved å påvirke produksjonen av utskilt faktorer fra prostata stromal fibroblaster.
Resultater
Androgen reseptor uttrykk og aktivitet i dyrkede humane prostata stromale celler
To ledige udødeliggjort menneskelige prostata stromal cellelinjer, PS-30 og WPMY-en, og ikke-udødelig primære humane prostata stromal celle myofibroblasts ble evaluert for AR uttrykk og reaksjonsevne til androgener. Ingen av disse cellene krever androgen for
in vitro
vekst, men WPMY-1-celler ble tidligere rapportert til å vokse litt raskere i nærvær av syntetiske androgen, R1881 [20]. AR uttrykk ble undersøkt i disse cellene ved kvantitativ RT-PCR (qPCR) og Western blot prosedyrer og ble sammenlignet med dyrkede primære humane prostata stromal fibroblaster (PRSC) og til LNCaP prostata kreft celler som er modeller for AR handling i prostatakreft (Figur 1A ). Av de undersøkte celler, LNCaP cellene uttrykte de høyeste nivåene av AR mRNA. AR mRNA ble uttrykt ved bare 3,4% av dette nivået i PS30 celler, 1,1% i PRSC og på litt over 0,1% av dette nivået i WPMY-1-celler. Dette mønsteret var i samsvar med våre Western blot data der vi var i stand til å oppdage et band som tilsvarer AR i ekstrakter av hver av de udødeliggjort cellene eller i PRSC om det ble lett oppdaget i ekstrakt fra LNCaP celler (Fig. 1B). Likeledes, når sperre WPMY-1-celler ble transfektert med en androgen responsiv reporter vektor, viste de ingen tegn på øket ekspresjon av reporter (luciferase) i respons til økende mengder av DHT (Fig. 1C). Når imidlertid WPMY-1-celler ble ko-transfektert med androgen reporter sammen med en AR ekspresjonsvektor, ble ekspresjonen av reporter betydelig økt ved nærvær av DHT (Fig. 1C). Oppsummert, den lave endogene AR-ekspresjon i disse humane prostata stromale cellelinjer og deres manglende respons på androgen stimulering tyder på at de er dårlige modeller for studier av androgen virkning i stromale celler, men eksogene ekspresjon av AR, i det minste i den WPMY-1 celler, tillagt disse cellene en androgen-responsive fenotype som kan være mer som bidrar til studiet av androgen action.
(A) AR mRNA nivåer i PS30, primær prostata stromal (PRSC), WPMY-en (W ), WPMY-Vec (W-Vec), WPMY-AR (W-AR) eller LNCaP celler oppdages av sanntids qPCR av RNA ekstrahert fra cellene. Ekspresjonsnivåer er indeksert til ekspresjon av GAPDH i hver cellelinje. (B) AR protein (øvre baner) i PS30, PRSC, W, W-Vec, W-AR eller LNCaP celler oppdages av Western blot. Blottet ble probet på nytt for GAPDH protein (lavere baner) som en kontroll. (C) Luciferase reporter uttrykk i WPMY-1 celler ko-transfektert med ARE-Luc reporter vektor og en kontroll (tom) vektor (Vector) eller pLenti6.2-Har vektor (AR). Luciferase nivåene er normalisert for GFP fluorescens i det samme ekstrakt som transfeksjon kontroll markør. (D) Immunofluorescent farging for AR i W-AR-celler dyrket i 72 timer i fravær (venstre) eller nærvær (til høyre) på 10 nM DHT. Celler ble co-farget med DAPI å identifisere kjerner. (E) Luciferase-aktivitet i W-AR-celler transfektert med ARE-Luc og GFP i fravær eller nærvær av 10 nM DHT. Luciferase-aktivitet ble normalisert ved sammenligning med GFP nivåer i det samme ekstrakt. (F). Vekst av W-VEC eller W-AR-celler i fravær eller nærvær av 10 nM DHT som målt ved hjelp av WST-1-assay.
For å gjøre WPMY-1 celler mer mottagelig for studiet av androgen virkninger på genekspresjon, transdusert vi cellene med human villtype-AR uttrykk lentivirus og deretter brukt antibiotika utvalg for å oppnå en stabil populasjon av AR overekspresjon WPMY-1 celler (WPMY-AR). Andre WPMY-1 celler ble transduced med tom lentivirus og valgt under de samme betingelsene for å få en kontroll cellepopulasjon (WPMY-Vec). WPMY-AR-celler uttrykker AR mRNA og protein på et nivå som kan sammenlignes med androgen-følsomme LNCaP prostatakreftceller (fig. 1A, B). Immunfluorescens farging ved anvendelse av anti-AR-antistoff viste at AR var for det meste i cytoplasma når disse cellene ble dyrket i fravær av DHT, selv om det var lett atom immunofluorescerende farging i de fleste celler (Fig. 1D). I motsetning til dette, når WPMY-AR-celler ble dyrket i DHT-inneholdende medium, AR immunfarging var utelukkende atom. AR uttrykt i stabile WPMY-AR celler var funksjonell for genomisk aktivering av genuttrykk. Når disse cellene ble transfektert med androgen-reporter, ble luciferase aktiviteten betydelig økt ved behandling med DHT mens DHT ikke påvirke luciferase uttrykk i reporter-transfektert WPMY-Vec kontrollceller (Fig. 1E). Ellers viste WPMY-AR celler ingen andre åpen fenotypiske forskjeller i forhold til WPMY-Mer kontrollceller; de var utvisket av morfologi etter mikroskopisk observasjon (ikke vist) og har lignende vekst i både androgen-fri og androgen holdig medium (Fig. 1F).
Comparative Gene Expression Profilering av prostata stromal Cell varianter Vokst i Nærvær eller fravær av DHT
WPMY-Vec og WPMY1-AR-celler ble sådd ut i like antall på androgen-fritt medium for feste deretter overført til friskt medium med eller uten supplerende 10 nM DHT i 72 timer. RNA ekstrahert fra biologiske duplikater av disse kulturene ble merket så profilert på Affymetrix Menneskelig Gene ST 1,0 Array Gene Chips. Microarray Uttrykket data ble analysert for å identifisere genene som ble differensielt uttrykte mellom en gitt celle i henhold til forskjellige betingelser (- /+ DHT) eller mellom de to celletypene (WPMY-vec vs WPMY-AR) under ekvivalente betingelser. Ved hjelp av en cutoff av 1,5-gangers endring i RNA-ekspresjon, WPMY-vec kontrollcellene hadde bare åtte gener som er differensielt uttrykt i nærvær av DHT og den kurve som viser utvalget av disse endrede gener som ble generert av GeneSpring programmet og er vist i Figur 2A. Vi forsøkte å bekrefte differensial uttrykk for disse 8 gener i WPMY-Mer DHT-behandlede /-untreated celler ved hjelp av real-time qPCR å vurdere uttrykket av hvert gen på et nytt sett av biologiske dobbeltprøver, men resultatene av denne analysen viste ingen signifikante forskjeller i uttrykk for hvilken som helst av dem ved hjelp av denne fremgangsmåte (ikke vist). Sammenligning av genuttrykk profiler av DHT behandlet /-untreated WPMY-AR-celler, men gjorde viser mye mer slående og robuste endringer i genuttrykk forbundet med DHT behandling. DHT påvirket ekspresjon av 172 enkeltgener ved 1,5 ganger eller større (fig. 2B). Men de fleste av disse endringene (141 eller 81,9%) var på nivå med to ganger eller større. I sistnevnte kategori, ble flere gener nedregulert av DHT (85 gener) enn det som var oppregulert (56 gener). Genene som ble endret ved to-ganger eller større er identifisert i Tabell S2 og S3 Tabell. Vi valgte deretter 10 forskjellige gener fra disse listene, inkludert 6 oppregulert og 4 downregulated gener, for ytterligere validering av real-time qPCR på et friskt sett med RNA ekstrahert fra biologiske duplikate prøver. Hver av disse utvalgte gener ble bekreftet å være betydelig opp- eller ned-reguleres ved nærvær av DHT på samme måte som resultatene av microarray uttrykket analyse (fig. 3A). Endelig liste av gener (opp- og ned-regulert) som ble endret etter to ganger eller større i nærvær av DHT ble funksjonelt vurdert ved hjelp av
Pathway Express
program (http: //vortex. cs.wayne.edu/projects.htm) [21] som tildeler gener i spesifikke KEGG funksjonelle trasé og deretter de forskjellige KEGG trasé forbundet med disse genene ble kvantitativt prioritert ved en av to forskjellige parametre: 1) antall inn- gener som er tilordnet en bestemt KEGG vei; eller 2) den prosent av de enkelte KEGG spredningsveier gener som var til stede i inngangs genet satt (tabell 1). De 10 KEGG pathway rangeringen ved hjelp av to forskjellige parametre delt kategoriene, Pathways i Cancer, cytokin-cytokin reseptor Interaksjon, TGF-β Pathway, Wnt Pathway, og Hedgehog signalveien, men andre fremtredende cellesignalveier var representert i en rangering eller andre
(A) GeneSpring generert linjeplott av betydning. (P 0,05) genuttrykk forskjellene større enn 1,5 ganger i WPMY-Mer celler behandlet i 72 timer med 10 nM DHT. (B) GeneSpring generert linjeplott av signifikant (P 0,05) genuttrykk forskjellene større enn 1,5 ganger i WPMY-AR celler behandlet i 72 timer med 10 nM DHT. (C) GeneSpring generert linjeplott av signifikant (P 0,05) genuttrykk forskjellene større enn 1,5 ganger mellom WPMY-Vec og WPMY-AR celler dyrket uten DHT. (D) GeneSpring genererte linje plott som viser effekten av DHT behandling på gener som er differensielt oppregulert ved to-ganger eller større ved AR ekspresjon alene (uten DHT). (E) GeneSpring generert linje plott som viser effekten av DHT behandling på gener som ble differensielt ned-regulert av to-ganger eller større ved AR ekspresjon alene (uten DHT) og ble deretter opp-regulert av to ganger i nærvær av DHT. (F) GeneSpring generert linje plott som viser effekten av DHT behandling på gener som ble differensielt ned-regulert av to-ganger eller større ved AR ekspresjon alene (uten DHT) og ble deretter ytterligere nedregulert ved to-ganger eller større i nærvær av DHT.
(A). Vurdering av individuelle genuttrykk endringer knyttet til DHT behandling av WPMY-AR celler ved qPCR. Seks av genene i dette panelet (SFRP-5, IGF-1, Wnt-16, AQP3, FKBP5 og RERG) ble identifisert som DHT-up-regulert gener i microarray analyse av genuttrykk og fire gener (BMP-4, FST , IL7R og FGF5) ble identifisert som DHT-nedregulert gener i microarray genekspresjonsanalyser og disse endringene ble bekreftet i qPCR analysen. Alle endringer som registreres av qPCR var signifikante endringer (P 0,05). (B) Vurdering av individuelle genuttrykk endringer knyttet til DHT behandling av PS30 celler transient transfektert med pLenti6.2-Har ved qPCR. Måling av endringer i SRBP5, IGF1, Wnt-16, AQP3, FKBP5, RERG og FGF5 var signifikant (P 0,05), mens endringer i BMP-4, FST og IL7R ikke var signifikante (P 0,05).
for å bedre fastslå om disse genet endringer knyttet til DHT behandling var spesifikke for de WPMY-AR celler eller om de kan også forekomme i andre menneskelige prostata stromal celler med tilstrekkelig AR uttrykk, vi transient transfektert PS30 celler med AR ekspresjonsvektor eller en tom kontrollvektor deretter behandlet disse celler uten eller med 10 nM DHT i 72 timer. RNA ekstrahert fra disse celler ble testet ved sanntids qPCR-analyse for ekspresjon av AR og for ekspresjon av de samme 10 gener som ble selektivt analysert i WPMY-AR-celler. Resultatene viste at AR ble uttrykt 923 ganger mer i AR-transfektert enn hos kontroll-transfekterte PS30 celler. Som vist i figur 3B, ekspresjon av seks av de andre 10 gener ble endret på samme måte som for de WPMY-AR-celler behandlet med DHT, mens fire av de 10 gener som ikke ble vesentlig endret mellom untreated- eller DHT-behandlede cellene . Til slutt, de primære humane prostatacelle fibroblaster ble også dyrket i medium med eller uten DHT i 72 timer, og RNA ble ekstrahert i sanntid qPCR-analyse. CDNA fra disse cellene ble deretter analysert med hensyn til DHT virkninger på ekspresjonen av 5 forskjellige gener fra vårt panel. Resultatene viste at SFRP5 og IGF1 ble oppregulert ved 1.67- til 1.73- fold av DHT (p 0,05) og FGF5 ble nedregulert med 1,5 ganger (p 0,05) sammenlignet med ingen-DHT kontroller mens uttrykk for FST og Wnt16 var ikke vesentlig endret av DHT behandling av disse cellene.
Gene Expression endringer knyttet Overuttrykte av AR i WPMY-1 celler
for å avgjøre om AR uttrykk (i fravær av ligand) berørt genuttrykk i de WPMY cellene, vi også sammenlignet genuttrykk profiler mellom WPMY-Vec og WPMY-AR celler dyrket uten DHT behandling. Bemerkelsesverdig 443 gener ble funnet å bli uttrykt forskjellig mellom disse celler ved et nivå på 1,5 ganger eller større (fig. 2C) og 374 av disse genene blir uttrykt forskjellig ved to-ganger eller større mellom disse cellene. I sistnevnte undergruppe, ble 55 gener selektivt oppregulert og 319 gener ble selektivt nedregulert i AR-uttrykke celler. Det var av interesse kan man finne ut hvordan disse to kategoriene av gener ble senere påvirket av DHT behandling. For det første valgte vi de gener (55) som ble oppregulert ved overekspresjon av AR (minst to ganger) i fravær av DHT. Seksti prosent av disse genene (33 gener) ble deretter nedregulert (med to-ganger eller større) på nytt i nærvær av DHT (fig. 2D), mens de øvrige 40% var enten uendret eller endret mindre enn to ganger av DHT og, derfor ekskludert fra vår analyse. For de 319 gener som ble nedregulert ved to-ganger eller større ved AR overekspresjon alene ble 21 gener (6,58%) i ettertid oppregulert ved to-ganger eller større ved tilsetning av DHT (figur 2E), mens 21 gener (6,58%) var ytterligere nedregulert ved to-ganger eller større ved tilsetning av DHT (figur 2F). De resterende gener i denne kategorien (277 eller 86,8%) var enten uendret ved tilsetting av DHT eller ble endret mindre enn to ganger og ekskludert fra vår analyse. Ingen gener ble oppregulert ved AR uttrykk deretter videre oppregulert ved DHT selv i de som ble berørt av DHT 2 til 1,5 ganger. Oppsummert kan AR overekspresjon alene i fravær av ligand induserer men hovedsakelig undertrykke ekspresjon gener i WPMY-1-celler, men disse effektene ble noen ganger reversert i nærvær av liganden. Men noen genuttrykk endringer indusert av AR overekspresjon (genet downregulations) ble ytterligere forsterket av behandling med androgen ligand i disse cellene.
Direkte eller indirekte Regulering av gener ved DHT
Vi beskrev her endret mønster av genekspresjon i prostata stromale celler indusert ved overekspresjon AR, med eller uten ligand, som var basert på målinger av mRNA-nivåer. Vi har søkt ytterligere å evaluere en liten undergruppe av disse DHT-regulerte gener for å bestemme hvorvidt effekten av DHT nødvendig mellomledd proteinsyntesen. For dette formål, trypsinert WPMY-AR Cellene ble latt bli tilkoblet over natt, og deretter kort behandlet (30 min) med høy dose cykloheksimid (40 μgs /ml) for å blokkere proteinsyntese og deretter byttet til medium med eller uten DHT (10 nM) i tilstedeværelsen av lavere dose cykloheksimid (10 μgs /ml) i 24 timer. Kontrollceller ble behandlet på samme måte, bortsett fra at det ikke var inkludert cyclohexmide til enhver tid. RNA ekstrahert fra disse cellene ble så vurdert for uttrykk av utvalgte DHT-oppregulert (RERG, Wnt16 og SFRP5) eller DHT-nedregulert (FST, FGF5 og BMP4) gener. Resultatene (figur 4) viste at DHT effekt på ekspresjon endres for fire av disse genene (RERG, WNT16, SFRP5, og FST) ble ikke endret av sykloheksimid behandling, mens DHT virkninger på BMP4 og FGF5 uttrykk ble blokkert av cykloheksimid.
WPMY-AR-celler ble forbehandlet deretter behandlet med cykloheksimid i fravær eller nærvær av 10 nM DHT i 24 timer. RNA ble analysert ved qPCR for ekspresjon av RERG, FST eller FGF5, som indikert og ekspresjonsnivåene ble normalisert til GAPDH-ekspresjonsnivåene.
Effekter av DHT-stimulert WPMY1-AR kondisjonerte medium på LNCaP-cellevekst
til slutt, søkte vi å teste om DHT handling i WPMY-AR modell celler kan påvirke produksjonen av utskilt faktorer fra disse cellene som påvirker prostatakreft cellevekst. Tre dagers kondisjonert medium fra 10 nM DHT-behandlede WPMY-Vec eller WPMY-AR-celler ble fortynnet 1:01 med friskt medium (med 10 nM DHT), og ble deretter tilsatt til frisk LNCaP-celler monolag, og cellene ble fulgt i 9 dager med medium erstatning hver 3 dager. Vekst i denne perioden ble målt ved bruk av WST-1-analysen, og resultatene er vist i figur 5. Behandling med det kondisjonerte medium fra DHT-behandlede WPMY-AR-celler ble funnet å være betydelig mer vekst-stimulerende for LNCaP sammenlignet med behandling med kondisjonert medium fra DHT-behandlet WPMY-vec celler.
Relative celle tall på ulike dager ble anslått av WST-1-analysen. Bruk av kondisjonert medium fra DHT-behandlet WPMY-AR celler betydelig stimulert vekst (P 0,01, toveis ANOVA) av LNCaP celler sammenlignet med kondisjonert medium fra DHT-behandlet WPMY-vec celler. Bakken av to vekstkurver var også signifikant forskjellige (P = 0,0181, lineær regresjonsanalyse).
Diskusjoner
Som andre vev, prostata består av en blanding av uensartede celletyper som er bredt adskilt i en epitelial eller et stromal kammer basert på deres lokalisering i forhold til basalmembran. Prostata kreft celler som er utledet fra prostata epitel har historisk gitt modellene for å studere hvordan androgen action påvirker prostata celle genuttrykk. Imidlertid blir mange celletyper innen prostata stroma også kjent for å uttrykke AR
in vivo product: [22] – [24], og for å bidra til prosessen (e) gjennom hvilken androgener regulere prostata utvikling og sykdom, men vi vet meget lite om effekter av androgen på genekspresjon i slike celler. Arbeidet for å oppnå dette er hindret av mangelen på egnede dyrkede stromal cellemodeller, spesielt de som uttrykker AR på tilstrekkelig nivå for å tillate bruk av moderne masse genuttrykk profilering teknikker. Her forsøkte vi å karakterisere AR uttrykk og androgen signale aktivitet i to tilgjengelige udødelig prostata stromal cellelinjer, PS30 og WPMY-1, som tidligere ble rapportert å uttrykke AR [20], [25] for å vurdere om de kan gi modeller for å studere androgen regulert genekspresjon. Disse cellene er begge klassifisert som myofibroblasts basert på deres morfologi i kultur og deres co-uttrykk for vimentin og glatt muskulatur aktin. Vi fant at begge typer celler uttrykker ekstremt lave nivåer av AR mRNA og protein og verken celletype respondert på DHT behandling etter transfeksjon med et androgen-responsive luciferase reporter vektor så verken er sannsynlig en god modell for å studere androgen regulert genekspresjon. Når imidlertid androgen reporteren vektoren ble ko-transfektert med en villtype-AR ekspresjonsvektor, WPMY-1-celler ble deretter i stand til å svare på DHT behandling av oppregulering androgen-responsive reporter uttrykk. Dette resultatet viste at WPMY-1 celler kan gjøres mottagelig for studier av androgen regulert genekspresjon når det følger med eksogene AR. Transduksjon av et antibiotikum som kan velges av AR-ekspresjon lentivirus tillot oss deretter å utlede en stabil cellelinje, WPMY-AR, som uttrykt AR mRNA og protein på et nivå som kan sammenlignes med LNCaP-celler som ofte brukes for å modellere et prostata kreftceller respons på androgener. De WPMY-AR cellene flyttet AR-protein til kjernen i nærvær av DHT og hensiktsmessig oppregulere luciferase-ekspresjon fra en androgen-regulert reporter vektor etter DHT behandling identifisere at de har en funksjonell androgen signaleringssystem som er i overensstemmelse med deres anvendelse i gen-ekspresjon profilering eksperimenter. Det var bemerkelsesverdig at WPMY-AR-celler kunne ikke skilles morfologisk fra foreldre eller kontroll transduserte (WPMY-vec) celler, og at deres relative vekstrate (i nærvær eller fravær av androgen) ble ikke signifikant påvirket av AR overekspresjon, spesielt siden AR er kjent for å påvirke prostatakreft cellevekst, enten når det er uttrykt endogent eller eksogent [26], [27].
De WPMY-Mer og WPMY-AR-celler ble så profilert for generelle genuttrykksmønster og for endringer i disse mønstrene forbundet med DHT behandling ved hjelp av et gen Chip microarray tilnærming. Vår foreløpige krefter involvert en mer langvarig behandling med DHT (72 timer) enn det som er vanlig brukt i studier av prostata kreft celler, men vi håpet at dette lengre behandlingsperiode vil også tillate påvisning av potensielle sekundære genuttrykk endringer som kan være relevant for sider ved krysstale mellom prostata stromal og epitelceller som påvirker prostata utvikling eller prostatakreft cellevekst. For de WPMY-Mer kontrollceller, DHT behandling vesentlig endret uttrykk av bare åtte gener (av 28,712 genet probe sett på Chip) og disse endringene var relativt lav, alt fra en 1.62- til 1,74 ganger endring i forhold til ubehandlet WPMY -Vec celler. Ingen av disse endringer genet ble senere bekreftet ved hjelp av et sanntids qPCR tilnærming. Vi føler da, at disse små endringer i våre kontrollceller (+/- DHT) som detekteres ved hjelp av gen-chip microarray tilnærming representerer «støy» i systemet, og at denne støyen er ekstremt lav og lett filtreres med det sekundære qPCR tilnærming. I slående kontrast til behandling av WPMY-AR-celler med DHT endret ekspresjon av 141 forskjellige gener av to-ganger eller større. De aller fleste av disse endringene (60,2%) som er involvert genuttrykk ned-regler forbundet med DHT behandling. Tatt i betraktning at transkripsjonelt aktiv (liganded) AR er oftest tenkt som en induser av genekspresjon, er dette et bemerkelsesverdig høyt antall potensielt androgen-trykt gener. Imidlertid har AR /androgen trykt gener er tidligere beskrevet i prostatakreftceller [8] og en rapport som beskriver effekten av androgen på genekspresjon i LNCaP-celler viste at androgen behandling trykkes nesten like mange gener som ble indusert i disse cellene [9 ] så vår observasjon er støttet av observasjoner i andre prostata cellesystemer. Det var også interessant at en sammenligning av våre DHT-endret stromal celle genet lister med allerede kjente androgen-regulert gener samlet på et nettsted ressurs (https://argdb.fudan.edu.cn/index_info.php, [28] viste at omtrent 21% av genene som er tilstede på våre lister (tabellene S1 og S2) ble tidligere beskrevet å være «androgen reguleres» basert på undersøkelsen litteraturkilder i hovedsak omfatter studier av prostatacancerceller. tilstedeværelsen av denne betydelig andel av tidligere beskrevne «androgen regulert «gener på våre lister støtter ideen om at vi identifiserer mange gener som kan vanligvis regulert av liganded AR i mange typer prostata celler samt gener som kan være selektivt påvirket av AR /androgener i prostata stromale celler.
med hensyn til naturen av disse DHT-regulert stromal celle gener, var det få, om noen gener som er funksjonelt klassifisert som regulatorer av celle proliferative prosesser eller apoptose, og dette er i tråd med våre observasjoner som androgen behandling ikke signifikant innvirkning WPMY AR vekst. Vurderingen av gen-funksjon for oppregulert /nedregulert gener på våre lister basert på KEGG sti betegnelsen var bemerkelsesverdig siden det identifisert en overvekt av gener som er involvert i generiske «kreft pathways» som kan være relevante for våre funn at klimaanlegg medium fra DHT-stimulert WPMY-AR celler påvirkes LNCaP cellevekst. Likeledes, tilstedeværelse av multiple gener på listen klassifisert som effektorer av cytokin-cytokin-reseptor-signalering, TGF-β, WNT, pinnsvin eller MAP kinase-signaleringsreaksjonsveier ville støtte tidligere publiserte studier tyder på at disse spesielle signalbaner som er involvert i kryss- diskusjon som oppstår mellom prostata stromal og prostata epitel /kreftceller i utvikling eller sykdom [29] – [31]. Kategorisering av gener på listen basert på Gene ontologi (GO) oppdrag ble også gjøres ved hjelp av DAVID programmet og resultatet viste lignende kategorier til de som er tildelt under KEGG Pathway (ikke vist). Til slutt, gjør vår begrenset undersøkelse for en effekt av cycloheximide på DHT-indusert gen endringer støtte ideen om at mange av genet endringene vi observerte er først og fremst forbundet med AR funksjonell aktivitet. Men vår evne til å identifisere noen DHT rammede gener i WPMY-AR celler som ikke ble endret da cycloheximide fulgte med DHT behandling viser også at det er gener på våre lister som er sekundært regulert av noen andre protein påvirket av DHT som vi mistenkte. Bruk av WPMY-AR celler med en kortere periode DHT behandling kan hjelpe oss med å sortere ut den primære påvirket vs de sekundære berørt gener, og vi vil forsøke dette i fremtiden.
For valideringsformål, vi hadde valgt et panel
