Abstract
Intrinsic Radiosensitivity er en viktig faktor bak strålebehandling respons, men det er ingen metode for sin rutine vurdering i humane tumorer. Gene signaturer blir nå hentet og noen ble tidligere generert av expression profilering NCI-60 cellelinje panel. Det ble hypotese at fokus på mer homogene tumortyper ville være en bedre tilnærming. To cellelinje kullene ble anvendt avledet fra cervix [n = 16] og hode og hals [n = 11] kreft. Radiosensitivity ble målt som gjenlevende brøkdel etter bestråling med 2 Gy (SF2) ved klonogene analysen. Differensial genuttrykk mellom radiosensitive og radioresistant cellelinjer (SF2 / median) ble undersøkt ved hjelp av Affymetrix Genechip Exon 1.0ST (cervix) eller U133A plus2 (hode og nakke) arrays. Det var forskjeller innenfor cellelinje kohorter knyttet til vev av opprinnelse reflekteres av uttrykk for stratifisert epitel markør p63. Av 138 gener som er identifisert som å være assosiert med SF2, bare 2 (1,4%) var sammenfallende mellom cervix og hode og hals-karsinom-cellelinjer (MGST1 og TFPI), og dette førte ikke partisjonere publiserte NCI-60 cellelinjene basert på SF2. Det var varierende suksess i å anvende tre publiserte Radiosensitivity underskrifter til våre kohorter. Ett gen signatur, opprinnelig utdannet på NCI-60 cellelinjer, gjorde delvis separate sensitive og resistente cellelinjer i alle tre cellelinje datasett. Funnene bekrefter ikke vår hypotese, men foreslår at en felles transkripsjonen signatur kan reflektere Radiosensitivity av svulster i heterogene opprinnelse
Citation. Hall JS, Iype R, Senra J, Taylor J, Armenoult L, Oguejiofor K, et al. (2014) Undersøkelse av Radiosensitivity Gene signaturer i Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (1): e86329. doi: 10,1371 /journal.pone.0086329
Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, Tyskland
mottatt: 29 juli 2013; Godkjent: 09.12.2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Hall et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kreftforskning UK (C1094 /A9437, C1467 /A7286, og C147 /A6058), Medical Research Council UK (GO801525), og ECMC (C1467 /A7286) støttet denne forskningen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Mark J O’Connor er ansatt i Astrazeneca. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Andre forfattere erklærer at det ikke er noen interessekonflikter. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære.
Innledning
Intrinsic Radiosensitivity er en viktig faktor bak strålebehandling svar [1]. Radiosensitivity kan måles som fraksjonen av celler som overlevde en enkelt 2 Gy stråledose (SF2) med høye verdier indikerer radioresistance. Mens andre metoder er tilgjengelige for å måle celledelt radiosensitiviteten i cellelinjer, er SF2 anses å være gullstandarden og støttes av god klinisk dokumentasjon.
In vitro
målinger av SF2 korrelerer med
in vivo
radioresponse i musemodeller [2]. Måling av SF2 i primære humane svulster var en uavhengig prognostisk faktor hos pasienter med karsinom i cervix [3] og hode og nakke [4] følgende potensielt kurativ strålebehandling. Til tross for bevis for sin betydning, er det ingen metode tilgjengelig for sin rutine vurderingen hos pasienter som, på grunn av impracticalities for å måle tumor Radiosensitivity. Evnen til å måle en svulst er Radiosensitivity ville være et stort fremskritt og tillate individuell behandling for å redusere dosen og /eller utelate kjemoterapi hos pasienter som er følsomme tumorer eller omvendt for å intensivere behandling mot resistente tumorer. Behandling individualisering bør øke overlevelse og redusere sykelighet. Anslag tyder på en biologisk individualisert tilnærming til behandling basert på Radiosensitivity testing kan øke overlevelse av . 10% [5]
Derfor er det interesse for å utlede et gen signatur som gjenspeiler Radiosensitivity. Flere metoder har vært utforsket: identifisere gener indusert følgende bestråling i cellelinjer [6]; identifisere differensial uttrykk mellom indusert radioresistant og foreldreradiosensitive kreftcellelinjer [7] og profilering av
in vitro
respons fra cervix svulster til bestråling [8]. De fleste publiserte studiene var små, og har ikke blitt uavhengig bekreftet. Den mest omfattende studier benyttet NCI-60 panel av cellelinjer [9]. En studie identifisert 22 gener som sammen diskriminerte mellom lave og høye verdier SF2 i 63 cellelinjer, basert på en terskelverdi på 0,2 (det vil si cellelinjer med mindre enn 20% colony overlevelse etter 2 Gy definert som radiosensitive) [10]. En annen serie undersøkelser utviklet en prediktiv klassifikator av Radiosensitivity basert på SF2 forbundet genekspresjonsprofiler i NCI-60 linjer [11], [12], [13], [14]. Endepunktet av disse studiene var en regresjonsmodell av 10-hub gener, som hadde prognostisk betydning når den brukes til tre kliniske datasett (rektal, spiserørs og hode nakke kreft) [13] og var også prediktive for nytte av strålebehandling ved brystkreft [15]. I tillegg en meta-analyse av publiserte data fra fire microarray plattformer for NCI-60 celler identifisert en 31 gen Radiosensitivity signatur [16].
NCI-60 panel er den mest omfattende karakterisert satt av kreft cellelinjer og en offentlig ressurs som er hyppig brukt som et screeningverktøy for medisiner [9]. Panelet inneholder cellelinjer fra flere vev av opprinnelse, men noen radiobiologically relevante krefttyper som livmorhalsen (n = 0) eller hode og hals (n = 0), dvs. kreft der strålebehandling er en viktig del av behandlingen. Det er vel kjent at tumorer avledet fra forskjellige vev varierer i radiosensitivities; med hematologiske maligniteter være sensitive, og glioblastom og melanomer mest radioresistant [17]. Studier viser at basal genuttrykk nivåer korrelerer sterkt med vev av opprinnelse, særlig mellom hematologisk og solide tumorer [10]. Som sådan, stor variasjon og støy er til stede i NCI-60 «basal» genekspresjon data, potensielt hindrer identifisering av gener assosiert med SF2. Transkripsjonsfaktor P63 er en markør for plateepitelkreft opprinnelse og regulerer mange gener assosiert med epidermoid /plateepitelkarsinom skjebne. Tap av p63 er forbundet med den opp-regulering av gener assosiert med en mer mesenchymale /vandrende celle skjebne [18].
Det ble hypotese at utlede en Radiosensitivity signatur ved hjelp av en mer homogen gruppe av cellelinjer ville være en bedre tilnærming. Vi erholdt 16 cervikale karsinom-cellelinjer, en tumortype hvor radioterapi er viktig, men som ikke er representert i NCI-60 panel. Cellene ble preget i tett kontrollert basale forhold; parametre målt inkludert SF2, protein uttrykk ved omvendt-fase protein array (ZeptoMARK) og genuttrykk av Affymetrix Exon 1.0ST array. Vi forsøkt å identifisere gener som er differensielt uttrykte mellom høye og lave SF2 cellelinjer i en enkelt homogen tumortype. Vi hadde tilgang til en annen uavhengig radiobiologically-relevant hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) cellelinje kohort (n = 11) for å validere våre funn og de som stammer fra de offentlig tilgjengelige NCI-60 data.
Material og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Fjorten kommersielt tilgjengelige livmorhalskreft cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) eller den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser (JCRB). To andre cellelinjer (778 og 808) ble utledet i huset [19]. Alle livmorhalsen cellelinjer ble dyrket i identiske forhold: 4,5 g /l glukose DMEM pluss Glutamax (Life Technologies, Paisley, UK), supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Lot: A04305-0160, PAA Laboratories (Yeovil, UK )) og holdt i en fuktet inkubator. Elleve hode og nakke cellelinjer ble dyrket som beskrevet i tabell S1. Alle cellelinjer gikk STR autentisering og var mycoplasma gratis.
klonogene Analyser
Metoden er beskrevet andre steder [20]. Kort sagt ble eksponentielt voksende celler trypsinisert og bestrålt med 0-10 Gy ved romtemperatur ved å anvende en røntgenenhet ved en dosehastighet på 1,37 Gy /min. Etter plating og 2-3 uker vekst, ble koloniene dannet farget med krystallfiolett og de med 50 celler scoret. Hvert forsøk involverte et minimum av tre, men vanligvis seks replikater tekniske og forsøkene ble gjentatt to (n = 4) eller tre (n = 21) ganger. Data som vises er gjennomsnittet av de biologiske replikater.
HPV Genotyping
HPV genotyping av disse livmorhalskreft cellelinjer ble beskrevet tidligere [21]. For hode og nakke kreft cellelinjer QRT-PCR for E2, E6 og E7 for HPV16 og HPV18 ble utført som beskrevet tidligere [22].
MTT analysen
Dobling tid ble beregnet for hver celle linjen ved hjelp av CellTiter 96 Aqueous ikke-radioaktiv celleproliferasjon analysen (Promega, Madison, WI, USA) som per produsentens «over natten» protokollen. En standard syv-dagers vekstkurve ble utført i 96-brønners plater. Kolorimetriske avlesninger ble tatt ved 570 nm og sammenlignet, ved eksponentiell regresjon til en standardkurve av kjente celletetthet. Et gjennomsnitt av tre uavhengige replikater ved ulike tettheter ble brukt til å beregne gjennomsnittet dobling tid.
RNA Utvinning
Celler ble vasket i PBS og snap-frosset i flytende nitrogen. RNA ble ekstrahert og DNase behandlet ved hjelp av Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, UK), som per produsentens instruksjoner. RNA integritet (RIN) og kvantifisering ble målt ved hjelp av en Bioanalyser (Agilent Technologies Ltd, Santa Clara, CA, USA). 260/230 og 260/280 forhold ble vurdert ved hjelp av en Nanodrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
Western blotting
p63 protein status for cervix kreft cellelinjer ble beskrevet tidligere [21]. Ved hjelp av de samme metodene Western blotting ble utført på hode og nakke cellelinjer, ved hjelp av følgende antistoffer: p63 musmonoklonale (BC4A4) (Abcam, Cambridge, UK) og anti-β-Actin monoklonalt (Clone AC-15) (Sigma . -Aldrich, Dorset, UK)
ZeptoMARK omvendt fase Protein Arrays
eksponentielt voksende celler ble vasket med PBS, lysert i 75 ul av CLB1 lysis buffer (Zeptosens: en divisjon av Bayer ( Schweiz) AG, Sveits), skrapet inn i mikrofugerør, vortex-blandet og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 15000 rpm ved romtemperatur ble supernatanter samlet og konsentrasjoner bestemt ved Bradford-analysen. Den spotting prosedyren er beskrevet tidligere [23]. Kort sagt ble cervix carcinoma proteinlysatene standardisert til 2 mg /ml, fra hvilken fire konsentrasjoner (0,20, 0,15, 0,10 og 0,05 mg /ml) ble oppdaget, i duplikat på en ZeptoMARK hydrofob brikke (Zeptosens). Hver cellelinje ble uavhengig dyrket og høstet ved to anledninger; følgelig to biologiske replikater ble oppdaget på tabellen. Flisen ble blokkert med CeLyA buffer (Zeptosens), før inkubering med primære antistoffer i 22 timer ved 20 ° C. Tjuefire antistoffer (Zeptosens) ble valgt på grunnlag av deres rolle i kreftterapi eller motstand [24]. Etter inkubering overskudd av primært antistoff ble fjernet, og en fluorescensmerket-merket artsspesifikke antistoff hybridisert i 2,5 timer ved 20 ° C. Etter vasking, ble arrays lese på en ZeptoREADER (λ
ex /λ
em = 635/670 nm). Den resulterende relative fluorescensintensitet (RFI) ble beregnet ut fra en standardkurve konstruert fra de fire konsentrasjoner (i duplikat). Dette er en kvantitativ måling av protein. Verdier som vises er gjennomsnittet av to biologiske replikater (dvs. fire standard kurver).
Exon Array Hybridisering
100 ng RNA ble forsterket ved hjelp Nugen WT-Ovation FFPE v2 kit (Nugen Technologies, San Carlos , CA, USA). WT-Ovation Exon modul V1.0 ble brukt til å generere ST-cDNA og 4 ug ble hybridisert til human Exon 1,0 ST matriser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Ytterligere detaljer og rådata (CEL filer) er tilgjengelig på https://bioinformatics.picr.man.ac.uk/vice (eller GEO. GSE39066 (del av super serie GSE39067) Rådata for HNSCC cellelinjer er tilgjengelig på GEO .:. GSE51370
Exon Array data Analysis
Microarray array~~POS=HEADCOMP data ble normalisert ved hjelp av RMA [25] R /BioConductor pakke
annmap
og annmap databasen [26] ble brukt å fjerne ikke-exonic og multi-targeting probesets Array ytelsen ble målt som andel av probesets flagget som «til stede» med en konservativ cut-off (% Detection over bakgrunnen [% DABG]
P
. 0,01 ) og bare de probesets flagget «til stede» i minst tre prøver ble beholdt. Denne filtreringen redusert antall probesets vurderes fra 1.411.399 til 353981 exonic probesets, hvorav 243,301 gått DABG sammendrag filtrering. gennivå ble beregnet ved å ta median signal om filtrerte probesets som er kartlagt til unike genet symboler. Når oppsummert dette resulterte i 31,345 gener vurderes. Unsupervised hierarkisk clustering ble utført på de 1000 mest variant gener (rangert på variasjonskoeffisient) for å vise separasjon av prøvene basert på de variable gener i dataene, mens beregningskrav minimeres. Signatur Generation: Et gen signatur var fast bestemt på å bli sett av gener eller probesets som ble signifikant forskjellig uttrykt mellom to grupper av cellelinjer i henhold til enten LIMMA eller Rank Product Analysis. Cut-off for betydningen var en falsk oppdagelse korrigert p-verdi på 0,01. Pakker: R: 3.0.2, Annmap: v1.2.1 bruker menneskelig database bygge 66, LIMMA: 3.17.26, RankProd: 2.32.0, Pheatmap:. 0.7.7
Validerings Kohorter, Array Kartlegging og Data analyse
hode og hals cellelinje Affymetrix U133A plus2 array-data var RMA normalisert ved hjelp av
AFFY
pakke i R. Affymetrix kontroll probesets ( «AFFX» kommenterte) ble fjernet. For avviksanalyse, _X_, _a_ og _s_ kommenterte probesets ble også fjernet. NCI-60 – Affymetrix plus2 cel filene ble lastet ned fra CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/) og RMA normalisert som før. Etter normalisering replikere matriser for hver cellelinje ble beregnet. For forhold til gen-nivå oppsummert ekson array-data, ble plus2 probesets kartlagt til genet symboler ved hjelp av
annmap
.
Radiosensitivity Signatur Mapping
Alle signaturer ble brukt til genet -nivå sammendrag av livmorhalsen data ved hjelp av genet symbol kartlegging. For påføring av underskrifter til HNSCC og NCI-60 Affymetrix Plus 2 datasett, ble følgende protokoller brukes:
Probeset IDer for Eschrich
et al product: [13] ti hub gener ble tatt fra Tabell 3 fra konsernets første papir [13]. NCI-60 test satt cellelinjer ble tatt fra tabell 4 fra gruppen nest papir [12]. Tolv cellelinjer ble oppført, men det var ingen tilsvarende plus2 array for brystkreft cellelinje MDN.
De fire beste ranking gener fra Torres-Roca
et al product: [14] (
rpia , RBBP4, RGS19, ZNF208
) ble kartlagt til Affymetrix plus2 probesets bruker
annmap
. De tilsvarende uttrykk data for de probesets ble hentet ut og plottet på en lineær skala (anti-log).
Gene symboler for Amundson
et al
gensignaturen ble tatt fra den andre tabellen av opprinnelige artikkelen [10]. Ett gen kan ikke kartlegges (Unigene ID Hs.494347) så det var ingen tilsvarende genet symbol i tabellen. De resterende 21 genet symboler ble kartlagt til plus2 probesets bruker
annmap
. Multi-kartlegging probesets ble fjernet.
Tewari
et al
signaturen ble tatt fra den andre tabellen av den opprinnelige artikkelen [8]. Førti-ni av de 60 probesets med en unik genet symbol ble trukket ut og kartlagt til plus2 probesets hjelp annmap. Multi-kartlegging probesets ble fjernet.
Unsupervised analyser (clustering, PCA) av genuttrykk data, signaturanalyse og forskjells uttrykk analyse (
LIMMA product: [27],
RankProd
) ble utført ved hjelp av R. terskelen for differensial uttrykk ved hjelp Rank Product Analysis (
RankProd
) var en Prosent False Positive (PFP) hastighet. 0,01
grafer og statistikker
Resultatene viser gjennomsnittet av biologiske replikat og presisjonsmålinger er standardfeilen for gjennomsnittet med mindre annet er angitt. R verdier indikerer Pearsons produkt-moment-koeffisient. Boksplott ble generert i GraphPad Prism (v6.0): box-whisker parametre: horisontale linjen viser median uttrykk, viser boksen interkvartile området; værhår representerer området. For visualisering av stråleoverlevelseskurver en lineær kvadratisk likning ble montert i R, med strålebiologisk parametre avledet fra DRFIT [28]. R pakke
LIMMA
, ble brukt til å beregne differensial uttrykk verdier for protein profilering data. Der det er hensiktsmessig,
p
-verdier er Benjamini og Hochberg falske funnrate (FDR) korrigert [29]. Hovedkomponentanalyse (PCA) reduserer multi-dimensjonale data (dvs. flere tusen gener) i datapunkter i 2-D plass. Jo nærmere to datapunkter (prøver) jo mer lik prøvene. PC1 (x-aksen) står for mesteparten av variansen i et eksperiment, PC2 (y-aksen) står for den komponenten som representerer den nest høyeste varians.
Resultater
Cervikal karsinom cellelinjer har en rekke Radiosensitivities
Tabell 1 oppsummerer livmorhalskreft cellelinjer. To cellelinjer ble ikke danner kolonier og SF2 verdier for de resterende 14 linjene varierte 0,25 til 0,75 (figur 1). SF2 verdier for seks av de cellelinjer ble publisert av en annen gruppe [30], og rangeringen var identisk i begge studiene. I de 14 cellelinjer, var det ingen korrelasjon på SF2 med plating effektivitet (R
2 = 0,005,
p
= 0,82), dobling tid (R
2 0,0001,
p
= 0,99) eller RNA uttrykk for TP63, en markør for squamous celledifferensiering (
p
= 0,90).
A) Stråling overlevelseskurver som viser overlevende fraksjonen (log10) (y -aksen) etter bestråling med 2, 4, 6, 8 og 10 Gy i 14 cervix cancercellelinjer. Datapunkter er gjennomsnitt og standard feil av 2-3 uavhengige eksperimenter (3-6 replikater per forsøk). Datapunkter er utstyrt med den lineære kvadratisk likning og farget av under (blå) eller høyere (rød) median SF2.
Molekylær karakterisering av Tilsynelatende Homogene Cervikal karsinom cellelinjer viser store forskjeller
p63 ekspresjon (protein og mRNA) ble målt, fordi det diskriminerer mellom skvamøst (p63 +) og ikke-skvamøs (p63-) histologiske typer av livmorhalskreft [21]. Etter transkripsjonen profilering, uten tilsyn clustering av de mest varianten 1000 gener (rangert etter variasjonskoeffisient) separerte linjer i tre klynger (Figur 2A) med cluster 1 (C33a og HCSC1) blir uteliggere. De andre 14 cellelinjer partisjonert som p63- og p63 + klynger med unntak av SKG1 som hadde den laveste TP63 transkripsjon nivået av p63 positive linjer. HCS2 og 778, som ikke danner kolonier i våre forhold, ikke klynge sammen tyder ingen felles transkripsjonen uttrykk forbundet med evnen til å danne kolonier. Disse resultatene tyder på at hoved basale transkripsjons forskjeller mellom de cellelinjer som er knyttet til p63 ekspresjon. Interessant, mens HeLa-celler var den eneste adenokarsinom (AC) i henhold til proveniens informasjon, flere livmorhalsen cellelinjer hadde lignende globale transkripsjons profiler. HCSC1 er «småcellet karsinom «stammer, derfor vi undersøkt om den gruppering av C33a og HCSC1 skyldtes en felles histologisk opprinnelse. Hovedkomponentanalyse (PCA) ved hjelp av den kombinerte gen-ekspresjon fra to genet signaturer, opplært på (i) AC og SCC [21] og (ii) småcellet karsinom [31], viste at HCSC1 og C33a hadde svært lik histologiske genekspresjon ( figur 2B). Figur 2C viser at C33a og HCSC1 hadde lave nivåer av SCC gener og høyere enn gjennomsnittlig nivå av små cellekreft gener. Det er interessant å merke seg at AC-genekspresjon var lav i alle cellelinjer, inkludert HeLa, hvilket antyder at denne signaturen, utvunnet i primær tumor materiale kan ha begrenset anvendelighet i cellelinjer. Disse data tyder på at C33a er histologisk en liten celle carcinoma avledet cellelinje og belyser transkripsjons forskjeller forbundet med histologiske typen som finnes i en relativt homogen enkelt vev opprinnelsesland kohort.
A) Unsupervised hierarkisk clustering av de beste 1000 gener rangert etter variasjonskoeffisienten (fra ekson array-data). Heatmap farges av log
2 uttrykk verdi. Rader representerer gener og kolonner er cellelinjer. x-aksen dendrogram (klynger) viser likheten av cellelinjer og y-aksen Dendrogrammet likheten av gener. Cluster 1 representerer to prøver med de laveste TP63 verdier (p63 negativ). Cluster 2 viser gruppering av de andre p63- cellelinjer inkludert adenokarsinom HeLa. Klynge 3 grupper p63 + cellelinjer, med unntak av SKG1, som er klassifisert med p63-negative celler. B) Prinsipal komponent analyse av de 16 livmorhalskreft cellelinjer basert på SCC (n = 1062), AC (n = 155) og småcellet karsinom (n = 77) genuttrykk. X-aksen viser rektor komponent 1 (PC1) sto for 15,5% av variansen. PC2 vises på y-aksen står for 13,7% av variansen i histologi signatur genuttrykk. Farging representerer p63 protein uttrykk. C) Graf som viser den gjennomsnittlige uttrykk (log2) av SCC, AC og småcellet karsinom signatur. y-aksen er den Exon matrisen avledet median gen ekspresjon, for hver av de tre signaturer. X-aksen viser cellelinje. Cellelinjer rangeres basert på TP63 uttrykk.
Protein Profilering av «Cancer Associated Gener «viser Nøkkel Pathway Forskjeller mellom cellelinjer, men ikke mellom høy og lav SF2 Grupper
Et panel av 24 proteiner ble utvalgt fra en katalog av pre-validerte antistoffer med proteiner involvert i kreft, eller resistens overfor terapi [24]. Noen DNA-skade respons antistoffer som var tilgjengelig, og slik at valget var begrenset til godt validert proteiner forbundet med kreft, slik som p53, Rb, EGFR etc. Som p63 er avgjørende for den proliferative potensial av stamceller i stratifisert epitel [32], vi postulert at p63 + -celler ville uttrykker høyere nivåer av epitel markørprotein E-cadherin, sammenlignet med p63- celler, og dette ble bekreftet av proteinet array (
p
= 0,0001) (figur 3A). Vi sammenlignet også mRNA-ekspresjonsnivået av E-cadherin (Exon-matrisen avledet) med proteinet overflod målt ved hjelp av matrisen (relativ fluorescens intensitet [RFI]; figur 3B). Det var en sterk korrelasjon (R = 0,95,
p
0,001) viser at protein nivåer reflektere transkripsjonsnivåer for E-cadherin. Vi har også oppdaget at høye nivåer av p53-proteinet i C33a-celler sammenlignet med alle andre cellelinjer (figur 3C), på grunn av en kjent mutasjon i
TP53
-genet [33] som resulterer i proteinstabilisering. Disse dataene ga oss stor tillit til protein profilering data. Unsupervised clustering av protein data viste ingen relasjoner med kjente egenskaper (Figur S1). Ranking cellelinjene ved SF2 viste ingen klar visuell struktur til dataene (Figur 3C). De 14 cellelinjer ble delt opp i øvre og nedre Radiosensitivity grupper ved hjelp av medianverdien SF2, som tidligere brukt med kliniske prøver [3], [4]. Fire proteiner ble uttrykt forskjellig (
p
0,05) mellom de to gruppene: mTOR, PTEN, IKB alfa og NFkB, men ingen var signifikant etter falske funnrate (FDR) korreksjon (Figur 3D, Tabell S2 ). mTOR var border signifikant (FDR
p =
0,09) og det var en trend for en moderat sammenheng mellom mTOR og SF2 (R = 0,48,
p
= 0,08, figur 3D). Disse dataene viser at mens det var store forskjeller mellom cellene i form av protein uttrykk og veien aktivisering, ble ingen av proteiner /trasé robust forbundet med SF2 i denne cellelinjen kohort.
A) Histogram viser ZeptoMARK protein-matrise avledet overflod for de 16 cervix kreft cellelinjer. Y-aksen viser E-cadherin proteinnivå (relativ fluorescerende intensitet (RFI) for hver av cellelinjer (x-aksen). Cellelinjer er rangert basert på TP63 uttrykk. Gruppering i p63 negativ og p63 positive cellelinjer bekrefter foreningen av E-cadherin med p63. den p-verdi er T-test avledet sammenligne forskjellen i E-cadherin uttrykk mellom p63 positive og negative grupper, feilfelt vises standardavvik for to biologiske replikater. B) x-y scatterplot viser E- cadherin genuttrykk (Exon array) på y-aksen mot E-cadherin protein uttrykk på x-aksen. Stiplet linje representerer perfekt korrelasjon. Ekson-array-data-punkter representerer gjennomsnittet av flere exonic probesets (n = 19) fra en enkelt Exon uttrykk matrise, hvor protein data er gjennomsnittet av to biologiske replikater. C) Heatmap viser gruppering av proteiner med lignende uttrykk (y-aksen) i ZeptoMARK protein profileringsdata. Cellelinjer rangert etter SF2. Heatmap fargelegging er basert på rad Z-score. D) xy-spredningsdiagram som viser uttrykket (y-aksen) av de 5 beste proteinene fra LIMMA mot SF2 (x-aksen). Tabell oppsummerer resultatene av Limma differensial proteinekspresjon analyse mellom høye og lave SF2 grupper og Pearson korrelasjon av proteinekspresjon (RFI) mot SF2. p-verdier betegne disse proteiner med differensial uttrykk (* p 0,05 eller ** p 0,01) mellom SF2 lave og høye grupper etter LIMMA analyse. Men disse ikke klarer å passere falske funnrate korreksjon.
hode- og halskreft cellelinjer Vis likheter i Global Gene Expression
Tabell 2 oppsummerer 11 HNSCC cellelinjer, som var alt HPV negativ (figur S2). Selv rapportert å være plateepitelkarsinom, tre manglet p63 protein uttrykk ved Western blot (figur S3), og hadde lave transkripsjonsnivåer oppdages av microarray. Den SF2 range (0,3-0,8) var tilsvarende som for livmorhalsen linjer (figur 4A), men HNSCC cellelinjene var mer radioresistant sammenlignet med livmorhalsen (
p
= 0,003). Median SF2, som brukes til å partisjonere cellelinjene var 0,36 for livmorhalsen og 0,61 for HNSCC cellelinjer. Som med cervix cellelinjer, var det ingen forskjell i SF2 mellom cellelinjer som uttrykker høye sammenlignet med lave nivåer av
TP63
(figur 4B) og uten tilsyn hierarkisk clustering fordelt på HNSCC cellelinjene inn i tre grupper reflekterende
TP63
uttrykk (Figur 4C). Den mest avsidesliggende klyngen hadde lavest
TP63
uttrykk, mens de resterende to klynger delt cellelinjer med uttrykket / 6,0 (log
2) TP63. Disse dataene viser at både livmorhalskreft og HNSCC cellelinjer har lignende radiosensitivities og globale transkripsjons profiler, med flertallet av forskjeller knyttet til transkripsjonsfaktoren p63. Som sådan, er det HNSCC kohort en vevstype forskjellig fra livmorhalsen, men bør være en god komparator for SF2 forbundet gener som stammer i livmorhalsen cellelinjer og
vice versa
.
A) Graf som viser den midlere SF2 (log10) (y-aksen) for hver av de 11 cervix kreftcellelinjer (x-akse). Feilsøylene viser standardfeilen for gjennomsnittet av 2-3 uavhengige eksperimenter. B) Diagram som viser at det ikke er noen forskjell i TP63 uttrykk mellom SF2 høye og lave grupper. Bar viser median uttrykk. C) Unsupervised hierarkisk clustering av de beste 1000 gener rangert etter variasjonskoeffisienten (fra U133 array-data). Heatmap farges av log
2 uttrykk verdi. Rader representerer gener og kolonner er cellelinjer. x-aksen dendrogram (klynger) viser likheten av cellelinjer og y-aksen Dendrogrammet likheten av gener. Cluster 1 representerer to prøver med de laveste TP63 verdier (p63 negativ). Klynge 2 viser grupperingen av den andre p63- cellelinjen, sammen med lave TP63 uttrykker linjer. Cluster 3 grupper sammen alle HNSCC linjer med 6,0 (log2 uttrykk) TP63 uttrykk. D) Diagram for å representere den integrerte SF2 analyse av livmorhalsen og HNSCC-cellelinjer. Rank produktanalyse (FDR 0,05) identifisert 96 gener i livmorhalsen kohort uttrykt forskjellig mellom SF2 lav og høy cellelinjer. En identisk analyse i HNSCC cellelinjer identifiserer 97 probesets (42 gener) forskjellig uttrykt mellom SF2 lav og høy cellelinjer. PCA av livmorhalsen gener viser at de er i stand til å separere de cellelinjer ved SF2. PCA av HNSCC-gener er like i stand til å separere prøvene basert på SF2. Venn-diagrammet viser at kun 4/138 gener er felles mellom de to kohortene og av disse bare 2/138 er «sammenfallende» og i forbindelse med den samme retningen (høy SF2 /lav SF2 i både HNSCC og cervix). PCA viser probeset uttrykk for disse to «vanlige» og «kongruente» gener (MGST1 og TFPI) i NCI-60 datasett. NCI-60 øvre PCA viser datapunktene farges av median SF2 og lavere PCA farget for 0,2, tidligere brukt til å partisjonere radiosensitive og radioresistant cellelinjer i dette kullet.
gener uttrykt forskjellig mellom høy og lav SF2 grupper er først og fremst celle~~POS=TRUNC spesifikk og kan ikke stratifisere NCI-60 cellelinjer
Forskjeller mellom cellelinjene partisjonert ved hjelp av median SF2 ble undersøkt ved hjelp av genom-wide uttrykk profilering. Ingen forskjellig uttrykt transkripsjoner ble funnet av
LIMMA
følgende multiple-testing korreksjon. Dette var også tilfelle for lineære modeller med HPV og p63 uttrykk som kovariater, eller i en 3-veis ANOVA. Mens gener ble identifisert som ulikt ble uttrykt (rå p 0,05), ingen bestått falske funn korreksjon. En alternativ metode, Rank Produktanalyse, anvendt til livmorhalsen cellelinjer identifisert 96 differensielt-uttrykte gener (PfP 0,01) (tabell S3). Disse genene separert livmorhalsen prøvene på den første hovedkomponent, og står for 36% av variasjonen (figur 4D), men kan ikke skille HNSCC cellelinjene basert på SF2 (figur S4A). En gjensidig analyse på HNSCC linjene identifisert et tilsvarende antall probesets (n = 97, kartlegging til 42 unike genet symboler, PfP 0,01) forskjellig uttrykt mellom høy og lav SF2 (tabell S4). Disse genene gode resultater i å skille de HNSCC cellelinjer (figur 4D), men ikke klarte å skille cervix linjene (Figur S4B).
