Abstract
Innledning
ROBO1 er en membran protein som bidrar til tumormetastase og angiogenese. Vi har tidligere rapportert at
90Y-merket anti-ROBO1 monoklonalt antistoff (
90Y-anti-ROBO1 IgG) viste en antitumor effekt mot ROBO1-positive svulster. I denne studien har vi utført en biodistribusjon studie og radioimmunterapi (RIT) mot ROBO1-positive småcellet lungekreft (SCLC) modeller.
Metoder
For biodistribusjon studien,
111In- -merket anti-ROBO1 monoklonalt antistoff (
111In-anti-ROBO1 IgG) ble injisert i ROBO1-positive SCLC xenograft mus via halevenen. For å evaluere antitumor effekter, ble en RIT studie utført, og SCLC xenograft mus ble behandlet med
90Y-anti-ROBO1 IgG. Tumorvolum og kroppsvekt ble målt med jevne mellomrom i hele forsøkene. Tumorene og organer hos mus ble så oppsamlet, og en patologisk analyse ble utført.
Resultatene
Som et resultat av biofordelingen studien, observerte vi tumoropptak av
111In-anti -ROBO1 IgG. Lever, nyre, milt, lunge og viste forholdsvis høy akkumulering av
111In-merket anti-ROBO1. I RIT studien,
90Y-anti-ROBO1 IgG betydelig redusert tumor volum sammenlignet med baseline. Patologiske analyser av tumorer viste koagulering nekrose og dødelig degenerasjon av tumorceller, betydelig reduksjon i antallet av Ki-67-positive celler og en økning i antall av apoptotiske celler. En forbigående reduksjon av hematopoetiske celler ble observert i milt, sternum, og femur.
Konklusjoner
Disse resultater antyder at RIT med
90Y-anti-IgG ROBO1 er et lovende behandling av ROBO1-positive SCLC
Citation. Fujiwara K, Koyama K, Suga K, Ikemura M, Saito Y, Hino A, et al. (2015)
90Y-merket anti-ROBO1 monoklonalt antistoff utstillinger antitumoraktivitet mot småcellet lungekreft xenografter. PLoS ONE 10 (5): e0125468. doi: 10,1371 /journal.pone.0125468
Academic Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 6 oktober 2014; Godkjent: 24 mars 2015; Publisert: 27 mai 2015
Copyright: © 2015 Fujiwara et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) gjennom «Virkemidler for verdensledende Innovativ R D for vitenskap og teknologi (FIRST Program), «initiert av Rådet for Science and Technology Policy (CSTP). Medforfattere Yasutaka Saito, Akihiro Hino og Hiroyuki Kasahara er ansatt av FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd sluttet seg til dette studiet som et samarbeidselskap i Japan Society for Promotion of Science gjennom «Funding program for verdensledende Innovativ R . D på Science and Technology «Det var ansvarlig for radiomerking av antistoffer. Medforfatter Kosuke Suga er ansatt Sankyo LABO SERVICE Co., Ltd. Sankyo LABO SERVICE Co., Ltd gitt støtte i form av lønn for forfatteren KS, men har ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle denne forfatteren er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Co-forfatter Kosuke Suga er ansatt av Sankyo LABO SERVICE Co., Ltd Co- forfatterne Yasutaka Saito, Akihiro Hino og Hiroyuki Kasahara er ansatt av FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd FUJIFILM RI Pharma Co., Ltd sluttet seg til dette studiet som et samarbeidselskap i Japan Society for Promotion of Science gjennom «Virkemidler for verdens~~POS=TRUNC Innovativ R . D på Science and Technology «Det var ansvarlig for radiomerking av antistoffer. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) utgjør ca 15% av alle lungekrefttilfeller viser en høy vekst og tidlig utvikling av utbredt metastaser. Følgelig fleste pasienter med SCLC har hematogene metastaser ved førstegangsdiagnose [1, 2]. Siden SCLC er svært følsom for innledende kjemoterapi og strålebehandling, er disse metoder som vanligvis brukes til å behandle SCLC [1, 3]; imidlertid, er den samlede prognosen for pasienter med dårlig SCLC. Den to-års overlevelse for pasienter med begrenset stadium sykdommen er 20-40%, mens 2-års overlevelse for pasienter med avansert sykdom er bare 5% fordi avansert sykdom er vanligvis behandles med kjemoterapi alene [2]. Derfor kreves utvikling av mer effektive SCLC behandlinger for både begrenset stadium sykdommen og omfattende stadium sykdommen (primær lesjoner og metastase).
radioimmunterapi (RIT) er en type strålebehandling ved hjelp av radiomerket tumor-spesifikt monoklonalt antistoff [4-6]. Selv om RIT behandlinger Zevalin og Bexxar har blitt brukt til å behandle residiverende eller refraktær non-Hodgkin lymfom, har suksessen med RIT som behandling for solide svulster vært begrenset. Dette skyldes både den radioresistance av faste tumorer, og den manglende evne til å levere en dose som er tilstrekkelig til å voluminøse tumorer uten å forårsake benmargstoksisitet [4, 7]. Nylig, Yoshida et al. rapporterte at RIT viser signifikant terapeutisk effekt for SCLC xenotransplantater [8]. Den kliniske studien av anti-CEA radioimmunterapi i SCLC er igangsatt [3]. SCLC har høy Radiosensitivity, selv om det er sannsynlig å bli metastatisk. RIT kan angripe både primær og metastatisk kreft på grunn RIT middel er levert til alle deler av kroppen via blodsirkulasjonen. Dette tyder på at RIT har potensial til å bli en effektiv behandling for SCLC.
Den menneskelige homolog av
Drosophila
Roundabout genet,
ROBO1
, er en membran protein og en reseptoren slit2 [9]. Slit2-ROBO1 interaksjoner megle frastøtende signaler i aksoner og vekst kjegler på nevral utvikling [9, 10]. Det har blitt rapportert at ROBO1 bidrar både til tumormetastase og angiogenese [11-13]. Vi har tidligere gjennomført en RIT studie i leverkreft (HCC) rettet mot ROBO1 antigen [14]. Administrasjon av
90Y-merket anti-IgG ROBO1 (
90Y-anti-IgG ROBO1) viste signifikant antitumor-effekter, slik som tumorveksthemming i ROBO1-positiv HCC xenografter. Imidlertid tumorkrympning ble ikke observert, kanskje på grunn av radioresistance av HCC. Derfor fant vi ut at en mer radiosensitive svulst enn HCC ville være en passende terapeutisk mål for
90Y-anti-ROBO1 IgG. SCLC har høy Radiosensitivity sammenlignet med HCC. Xian et al. rapporterte ekspresjon av ROBO1 i humane SCLC-cellelinje NCI-H69 [15]. Derfor har vi valgt SCLC modellen ved hjelp av NCI-H69-cellelinjen som en mer effektiv terapeutisk mål for anvendelse i den foreliggende undersøkelsen.
I denne studien undersøkte vi farmakokinetikken til en
111In-merket anti- ROBO1 IgG (
111In-anti-ROBO1 IgG) i en biodistribusjon studie med SCLC xenograft mus. I tillegg utførte vi RIT bruke en
90Y-anti-ROBO1 IgG, og antitumor effekt og organskader ble evaluert ved patologisk analyse.
Materialer og metoder
Cell kultur og dyremodeller
ROBO1-positive SCLC cellelinje NCI-H69 (ATCC HTB-119) ble innhentet fra American Type Culture Collection [15]. Hann BALB /c nakne mus (5 uker gamle) ble kjøpt fra Clea Japan, Inc. (Tokyo, Japan). NCI-H69-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% Co
2. For NCI-H69 tumorbærende dyremodeller, NCI-H69-celler (2 x 10
6), i et volum på 200 pl, ble inokulert subkutant inn i høyre flankene av hann BALB /c nakne mus. Mus ble deretter analysert 4 uker etter inokulering. Musene ble avlivet ved fjerning av blod etter isoflurananestesi. Alle dyrestudier ble godkjent av Animal Care komité University of Tokyo (godkjent Nummer: P10-017).
Antistoffer
monoklonalt antistoff mot humant ROBO1 ble generert som tidligere beskrevet [16] . Anti-ROBO1 IgG er et mus IgG2b. Det gjenkjenner humant ROBO1 og som ikke kryssreagerer med murin ROBO1. For immunhistokjemisk (IHC) analyse, brukte vi anti-ROBO1 IgG A7241A (A7241A) [16]. For flowcytometri, ble biodistribusjon studien og RIT studien, anti-ROBO1 IgG B5209B (B5209B) brukes [14]. En negativ kontroll, IgG 3423 (Institute of Immunology, Tokyo, Japan), ble anvendt i flowcytometri. Dette monoklonale antistoff reagerer spesifikt med hepatitt-B-overflateantigenet [17]. Videre er det ikke reagerer med humane membranproteiner.
Flowcytometri og IHC
spesifisitet B5209B for ROBO1 antigen ble evaluert ved hjelp av flowcytometri. NCI-H69-celler ble inkubert med B5209B eller en negativ kontroll IgG 3423 i 1 time ved en konsentrasjon på 0,3 ug /ml i fortynningsbuffer (1% BSA, 0,1 mM EDTA i PBS). Samtidig, for å demonstrere spesifisiteten av B5209B, ble blokkerende eksperimenter utført ved å tilsette oppløselige ROBO1 ved en konsentrasjon på 100 ug /ml. Cellene ble deretter vasket to ganger med fortynningsbuffer og omsettes med R-Phycoerythrin-konjugert anti-mus-IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) fortynnet til 1: 200 med fortynningsbuffer. Til slutt, ble cellene vasket to ganger med fortynningsbuffer og analysert ved flowcytometri (Guava EasyCyteTM Plus-systemet; Millipore, Billerica, MA, USA).
ekspresjon av ROBO1 i NCI-H69-xenografter ble evaluert ved hjelp av IHC. NCI-H69 tumor vevsprøver ble fiksert i 4% paraformaldehyd over natten ved 4 ° C. De ble innleiret i parafin, og 3-5 um tykke seksjoner ble erholdt. Vevssnitt ble deparaffinized og vannes ut. Antigen gjenfinning ble utført i 10 mM tris-1 mM EDTA-buffer (pH 9,0) i en trykkoker i 20 min. Endogen peroksidase ble stanset ved bruk av 0,3% hydrogenperoksid-metanol i 30 minutter, og deretter prøvene ble blokkert med 5% normalt geiteserum i 1 time. Prøvene ble inkubert med A7241A (10 ug /ml) over natten ved 4 ° C og deretter behandlet med et sekundært antistoff (Enkel flekk MAX-PO, Nichirei, Tokyo, Japan) ved romtemperatur i 30 min. For å visualisere peroksidaseaktivitet, 0,2 mg /ml 3,3′-diaminobenzidin (DAB, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ble anvendt som substratet i 0,05 M Tris-HCl-buffer (pH 7,6) inneholdende 0,01% H
2O
2. Nukleær farging ble utført med hematoksylin.
Radiomerking
Vi har kjøpt 1, 4, 7, 10-tetraazacyklododekan-1, 4, 7, 10-tetraeddiksyre (DOTA) fra Macrocyclics (Dallas, TX, USA),
111InCl
3 ble oppnådd fra Nordion, Inc. (Vancouver, Canada), og
90YCl
3 ble oppnådd fra Eckert og Ziegler (Braunschweig, Tyskland).
B5209B ble konjugert med DOTA og radiomerket med
111In og
90Y som tidligere beskrevet [14]. Vi rapporterte at immunoreactive brøkdel av radiomerket B5209B ikke svekker konjugering med intakt B5209B [14].
Biofordeling studie
NCI-H69 xenograft (300,7 ± 125 mm
3) mus var tilfeldig delt inn i 5 grupper (n = 3 per gruppe). Hver mus ble injisert med 40 uCi
111In-B5209B (80 mikrogram) via halevenen. Musene ble avlivet etter 6, 24, 48, 72 og 144 timer etter injeksjon. Blod, hjerte, lunge, lever, nyre, milt, mage, ble tarm, muskler, lårbenet, brystbenet, og tumor oppsamlet, veid og målt for radioaktivitet. Prosentandelen av injisert dose pr gram vev (% ID /g) ble beregnet for hvert organ.
tumor absorberte dosen for
90Y-B5209B ble beregnet fra dataene i biofordelingsstudier
111In- B5209B. Tumor akkumulering på forskjellige punkter tome ble plottet mot tiden, hvorfra arealet under kurven (AUC) ble beregnet. Tumor absorbert dose ble estimert basert på en MIRD-stil mus dosimetri modell [18]. Den absorberte dosen til organer i en 70-kg referanse mann ble estimert fra våre biodistrubution data ved hjelp av MIRDOSE3 datamaskinprogram [19].
Terapeutisk studie
NCI-H69 xenograft mus ble tilfeldig delt inn i to grupper (n = 3 per gruppe). Mus ble injisert via halevenen med saltoppløsning eller 200 uCi
90Y-B5209B (70 ug). Tumor volumer for kontroll og
90Y-B5209B gruppene var 310.5 ± 128,6 mm
3 og 273,5 ± 153,6 mm
3, henholdsvis. Tumorvolumet og kroppsvekt ble målt to ganger i uken inntil 4 uker etter injeksjon. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av følgende formel: 0,5 x (korteste diameter)
2 x (lengste diameter). Tumorvekst (%) ble beregnet ved anvendelse av formelen: (tumorvolumet ved hvert tidspunkt) /(tumorvolum på dag 0) x 100. Mus ble avlivet når tumorstørrelsen var 1.500 mm
3 eller kroppsvekten redusert med 20% fra opprinnelig vekt.
Patologisk undersøkelse
NCI-H69 xenograft mus ble tilfeldig delt inn i 5 grupper (n = 3 per gruppe). Mus ble injisert via halevenen med 200 uCi
90Y-B5209B. Musene ble avlivet på dag 0, 7, 14, 21, og 28 etter injeksjonen, og deretter vevsprøver fra NCI-H69 tumoren, lever, nyre, lunge, hjerte, tarm, milt, bukspyttkjertel, brystbenet og lårbenet ble oppnådd fra musene.
Alle prøvene ble fiksert i 4% paraformaldehyde natten ved 4 ° C. De ble innleiret i parafin, og 3-5-mikrometer tykke seksjoner ble oppnådd. Sternum og femur ble avkalkes før innstøping i parafin. Slide seksjoner, unntatt lårbenet og sternum, ble deparaffinized, dehydrert, og farget med hematoxylin og eosin. Lårbenet og sternum seksjonene ble farget med Giemsa løsning.
Terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) og Ki-67 farging ble utført på NCI-H69 seksjoner for å undersøke status for svulst apoptose og celle spredning, henholdsvis.
apoptose ble oppdaget ved hjelp ApopTag Plus Peroxidase In Situ apoptose Detection Kit (Chemicon International, INC, Billerica, MA), i henhold til produsentens instruksjoner.
Ki-67 farging ble utført som tidligere beskrevet [14].
apoptotiske og proliferative celler ble kvantifisert ved å bestemme prosentandelen av TUNEL- og Ki-67-positive celler, respektivt, som tidligere beskrevet [14].
Statistisk analyse
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Midler ble sammenlignet med Student
t
-test. P-verdier av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
spesifisitet B5209B å ROBO1 antigen
NCI-H69 celler utstilt gjennomsnitts fluorescensstyrkene 35,29 og 7,80 med B5209B og negativ kontroll IgG 3423, respektivt (figur 1a og 1b). Binding av B5209B ble hemmet ved å legge løselig ROBO1.
(a) flowcytometrisk analyse med B5209B (fylt histogram) i NCI-H69 cellelinje. Åpne histogrammer angir blokkerer forsøkene som brukes løselig ROBO1. (B) flowcytometrisk analyse med IgG 3423 (fylt histogram). Åpne histogrammer angir blokkerer forsøkene som brukes løselig ROBO1. (C) Immunhistokjemisk analyse av ROBO1 med A7241A i NCI-H69 xenograft. (Skala bar = 100 nm).
ROBO1 uttrykk i NCI-H69 xenografter
uttrykk for ROBO1 i NCI-H69 xenografter ble bekreftet ved IHC ved bruk A7241A. Farging med A7241A ble observert på cellemembranene, som ROBO1 uttrykkes på celleoverflaten (fig 1c).
Biofordeling studie
biodistribusjon studie ved hjelp av
111In-B5209B ble utført ved hjelp av NCI-H69 xenograft mus (fig 2). Den tumoropptak av
111In-B5209B var 3,46 ± 0,3%, 6,42 ± 0,5%, 5,70 ± 2,5%, 9,37 ± 2,0% og 10,1 ± 1,3% ID /g ved 6, 24, 48, 72, og 144 h etter injeksjonen, respektivt. Den maksimale tumoropptak av
111In-B5209B skjedde ved 144 timer etter injeksjon. Høy retensjon av sporstoff i blodet ble observert med 19,2 ± 2,1% ID /g ved 6 timer, men denne ble redusert til 6,55 ± 0,5% ID /g ved 144 timer.
111In-B5209B viste høyt opptak i lever, nyre og milt med 5,78 ± 0,9%, 4,73 ± 0,4%, og 5,13 ± 0,4% ID /g ved 144 h, henholdsvis.
Resultater representerer de beregnede prosentandel av den injiserte dose per gram vev (% ID /g).
dosen absorbert av tumorer som ble behandlet med 200 uCi
90Y-B5209B ble beregnet til å være 10,5 Gy. Dosene som absorberes av lever, nyre, milt og benmarg ble estimert fra våre biofordelingsstudier data til å være 2,1 mGy /MBq, 3,8 mGy /MBq, 1,3 mGy /MBq, og 0,4 mGy /MBq, henholdsvis i en 70-kg mannlig henvisning gjenstand for
90Y-B5209B.
RIT studie
Den terapeutiske effekten av
90Y-B5209B ble undersøkt i NCI-H69 xenograft mus (fig 3a). Tumorene hos saltløsningsgruppen viste rask vekst. En mus i saltvann gruppe ble avlivet på dag 20 fordi svulsten volumet nådd 1.500 mm
3. I
90Y-B5209B gruppe, redusert tumorvolumet til 19,3 ± 6,1% på dag 13, sammenlignet med den opprinnelige volum på dag 0. Tumor volum viste signifikante forskjeller mellom gruppene fra dag 9 og fremover (p 0,01), selv om ingen Det ble ikke observert signifikant forskjell på dag 0, 2, eller 6. tumor~~POS=TRUNC veksten~~POS=HEADCOMP ble observert på dag 20.
(a) tumor vekstkurve, (b) Gjennomsnittlig kroppsvekt av NCI-H69 xenograft mus (åpen firkant, saltvann, svarte trekanter,
90Y-B5209B). ** P 0,01 (t-test).
Animal kroppsvekt ble målt etter injeksjon (Fig 3b). Selv om den gjennomsnittlige kroppsvekten redusert til 89,5 ± 4,7% av den opprinnelige verdien i
90Y-B5209B gruppe, denne endringen var forbigående. Musene i gruppen med saltløsning, viste ingen signifikant reduksjon i kroppsvekt. På dag 6, kroppsvekt signifikant forskjellig mellom gruppen med saltløsning og den
90Y-B5209B gruppe (p 0,01). På dag 9, kroppsvekt viste ingen signifikant forskjell mellom de to gruppene.
patologisk analyse
Vi evaluerte deretter antitumoreffekten av patologisk analyse. På dag 0, tumorceller var det god vekst forbundet med hyalinized fibrøst stroma (figur 4a)
(a) NCI-H69 tumor på dag 0, opprinnelig forstørrelse x 400.; (B) NCI-H69 tumor på dag 7, opprinnelig forstørrelse x 400; (C) NCI-H69 tumor på dag 0, opprinnelig forstørrelse x 400; (D) NCI-H69 tumor på dag 0, opprinnelig forstørrelse x 400; (E) NCI-H69 tumor på dag 0, opprinnelig forstørrelse x 400. Skala bar = 100 um.
På dag 7, observerte vi massiv nekrose koagulering, apoptotiske celler, og celle degenerasjon, definert av celle legeme hevelse, cell nuclear hevelse, og kromatin kompakte (fig 4b).
på dag 14, i tillegg til koagulering nekrose og degenerering celle, vi også observert histiocyte aggregering og fibrose i nekrotiske områder (figur 4C).
På dag 21 ble nekrotiske områder ikke observert, mens histiocyte aggregering og fibrose ble observert (figur 4d). Selv om antallet degenereres cellene redusert sammenlignet med dag 14, har vi fortsatt observert mange degenereres cellene.
På dag 28, få degenereres cellene ble observert (figur 4e). Karakteristikken av cellelegemet og kjernen, slik som form og størrelse, ikke ble endret og syntes å være de samme som de som ble observert på dag 0.
S1 Fig viser Ki-67 farging og TUNEL-farging. Prosentandelen av Ki-67-positive celler på dag 7 ble redusert signifikant (27,2 ± 3,4%) sammenlignet med dag 0 (55,0 ± 13,9%; p 0,01; figur 5). Prosentandelen av TUNEL-positive celler på dag 7 økt betraktelig (8,83 ± 1,2%) sammenlignet med dag 0 (4,46 ± 1,1%, p 0,01; figur 5)
Ki-67:.-Forhold på Ki -67-positive celler; TUNEL: forholdet mellom TUNEL-positive celler. * P 0.01 (elevenes t-test).
Det ble ikke observert synlige patologiske endringer i den normale organer, unntatt milten, sternum, femur, og leveren.
På dag 7, milten viste en nedgang i antall både hematopoetiske celler i den røde masse og lymfocytter i hvit pulpa (figur 6a). På dag 14, regenerative øyene, består av en blanding av erytroblast og granulocytiske celler, ble observert i den røde massen av milten. I hvit pulpa av milt, celletettheten av lymfocytter var i samme størrelsesorden som den som ble observert på dag 7. På dag 21, hematopoetiske celler, inkludert erytroblaster, granulocytter, megakaryocytter og var signifikant økt i den røde masse av milten . Dessuten ble det observert en liten økning av lymfocytter i hvit pulpa. På dag 28, den celletetthet på hematopoietiske celler så ut til å være den samme som den som ble observert på dag 0 i den røde pulpa av milt og lymfocytter ble signifikant økt i hvit pulpa.
(a) Spleen, opprinnelige forstørrelse × 400, skala bar = 100 mikrometer. (B) Sternum, opprinnelig forstørrelse × 400, skala bar = 100 mikrometer. (C) Femur, opprinnelig forstørrelse × 400, skala bar = 100 mikrometer. (D) Lever, opprinnelig forstørrelse × 400, skala bar = 100 mikrometer.
Vi deretter utført Giemsa farging av sternum og femur (Fig 6b og 6c). På dag 7, sternum benmargen viste en bemerkelsesverdig reduksjon i antall av hematopoetiske celler. Modne granulocytter gjort opp de aller fleste av de gjenværende hematopoetiske celler. I lårbens benmargen, observerte vi en liten nedgang i antallet av megakaryocytter, mens det var ingen synlig reduksjon i antall erytroblaster og granulocytter. Skadene på femoral benmarg var mild i forhold til det som ble observert i sternum benmargen. På dag 14 ble det regenerative øyer observert i sternum benmargen, og få megakaryocytes var til stede. Femoral benmargen, viste en økning i megakaryocytter, og celletettheten av hematopoetiske celler så ut til å være den samme som den som ble observert på dag 0. På dag 21, viste sternum benmargen en betydelig økning i antallet av hematopoetiske celler. På dag 28, celletettheten av hematopoetiske celler i brystbenet benmargen syntes å være den samme som den som ble observert på dag 0.
på dag 7, utposning av hepatocytter tall ble observert i leveren (fig 6d) , mens dette ikke ble sett på dag 14. i tillegg, karakteristikk av hepatocytter syntes å være de samme som de som ble observert på dag 0.
Diskusjoner
denne studien er den første til å vise at
111In-B5209B akkumuleres innenfor NCI-H69 xenografter, og
90Y-B5209B har betydelige antitumor effekt mot NCI-H69 xenografter.
for å vurdere spesifisiteten av B5209B for ROBO1, vi utført en blokkering studie ved hjelp av flowcytometri. Bindingen av B5209B ble inhibert ved tilsetning av oppløselige ROBO1, selv om den samme behandling ikke hemmer bindingen av IgG 3423. Derfor B5209B spesifikt gjenkjenner den ROBO1 antigen.
Vi brukte
111In-anti-ROBO1 så en biodistribusjon surrogat å forutsi in vivo atferd av
90Y-anti-ROBO1; Dette var fordi det har blitt rapportert at
111In og
90Y-merkede antistoffer, proteiner og peptider som er biologisk ekvivalent med hensyn til deres opptak i tumorer og andre viktige organer [20].
bekreftet at B5209B har spesifisitet for ROBO1 antigen. I tillegg
111In-B5209B i NCI-H69 øket opptaket av gradvis over tid, og den maksimale opptak av svulster var 10,1 ± 1,3% ID /g ved 144 timer. Opptaket av radiomerkings til normale organer som ikke uttrykker ROBO1, så som lever, nyre og milt, viste relativt høy opphopning. Imidlertid opptak av hvert organ enten nedsettes gradvis over tid eller forble konstant. Disse opptaks atferd forskjellig fra opptaket observert i tumorer. Derfor resultatene av vår blokkering og biodistribusjon studie støtte som
111In-B5209B mål spesifikt ROBO1. Det er forventet at
90Y-B5209B ville akkumuleres i NCI-H69 xenotransplantater, på grunn av tilsvarende bindingsaffinitet [14].
Selv
111In-B5209B viste relativt høy opphopning i lever, nyre, og milt, bindingsspesifisiteten av
111In-B5209B kan ikke forklare denne høy opphopning, fordi disse organer ikke uttrykker ROBO1 [16]. Dette fenomenet kan forklares ved tilstedeværelsen av gjenværende
111In-B5209B i blodet og Fcy eller FcRn-reseptor-mediert opptak av endotelcellene i disse organene [21, 22].
injisert 200 uCi av
90Y-B5209B inn NCI-H69 xenograft mus, og svulsten volum av NCI-H69 xenografter betydelig redusert etter behandling med
90Y-B5209B. Etter
90Y-B5209B administrering, observerte vi patologiske endringer i tumorceller, deriblant degenerasjon, koagulasjon nekrose, en økning av apoptotiske celler, og en reduksjon av Ki-67-positive celler. Disse endringene er vanlige patologiske forandringer i behandlede tumorvev. Dermed disse resultatene tyder på at
90Y-B5209B besitter betydelig antitumor virkning når de brukes i RIT.
Dessverre, observerte vi tumorveksten på dag 20 i
90Y-B5209B gruppe. I den patologiske undersøkelsen, redusert celledegenerasjon ble observert fra dag 21 til dag 28. Det var ingen nekrotisk område på dag 21, selv om histiocyte aggregering og fibrose ble observert på den tiden, og disse er immunresponser mot nekrotiske celler. Histiocytter svelges nekrotiske celler, og fibroblaster reparere den regionen. I tillegg har de morfologiske egenskapene til cellelegemer og kjerner på dag 28 viste seg å være den samme som de som ble observert på dag 0. Disse resultatene tyder på at antitumor-virkningene av RIT avtok på dag 21. For å oppnå fullstendig remisjon eller forlenget overlevelse ved hjelp av
90Y-B5209B, forbedring eller utvidelse av disse antitumor effekter er nødvendig. Kombinasjonsbehandling med RIT, kjemoterapi og poly ADP ribose polymerase hemmer resulterer i forlenget overlevelse sammenlignet med hver behandling alene [23, 24]; derfor har kombinasjonsterapi et potensial til å levere mer effektive antitumoraktivitet. Bruken av lange halveringstid nuklide kan oppnå forbedring av terapeutiske virkninger.
90Y er et nyttig terapeutisk β
– emitter som har høy maksimal energi (2,3 MeV) og en lang (maks vevspenetrasjon 11 mm) [25]. Imidlertid er halveringstiden forholdsvis kort (2,7 dager). Sammenlignet med
90Y,
177Lu har lavere maksimumsenergi (0,5 MeV) og en kortere rekkevidde (maks vevspenetrasjon 1,6 mm), men den har en lengre halveringstid (6,7 dager) [26]. Dermed kan bruk av
177Lu forlenge perioden med antitumor effekter og begrense organskader på grunn av sin korte rekkevidde. I tillegg har det blitt rapportert at
177Lu RIT er mer effektiv enn med
90Y RIT i behandlingen av små lesjoner ( 1000 mm
3) [27, 28].
177Lu RIT kan være mer effektivt for de relativt små svulster som vi brukte i denne studien.
Yoshida et al. rapporterte om effekten av radioimmunterapi ved bruk av
90Y-anti-c-kit antistoff for SCLC [8]. Den
90Y-anti-c-kit antistoff oppnådde en komplett behandlingsrespons for SCLC xenografter. De to studiene skilte seg på flere måter, for eksempel rettet mot proteinet, antistoffet som brukes, og tumorvolumet. Tumorvolumet anvendt i vårt studium (273,5 ± 153,6 mm
3) var mer enn 50 ganger større enn tumorvolumet brukes in2 deres studie (4,4 ± 3,2 mm
3). Forskjellen i tumorvolumet kan forklare forskjellene i terapeutisk effekt observert mellom de to studiene, fordi tumorvolumet er den viktigste faktoren i å bestemme behandlingsresultat i strålebehandling [29]. Dessuten er tilgjengeligheten av RIT behandling er avhengig av tilstedeværelse eller fravær av mål-protein ekspresjon. Derfor, er en større variasjon av target-proteiner for RIT å foretrekke.
90Y-B5209B har verdi som en terapeutisk kandidat for behandling av ROBO1-positive SCLC fordi c-kit er ikke alltid uttrykt i SCLC.
Vi observerte vekttap, nedsatt hematopoetiske celler og utposning hepatocytter. Disse forholdene var forbigående, noe som indikerer at 200 uCi
90Y-B5209B var under den maksimale tolererte dose i NCI-H69 xenograft mus. Det er nødvendig å utføre den doseeskaleringsstudie for bestemmelse av en dødelig dose og optimal terapeutisk dose. Betraktning av den absorberte dosen til de vanlige organer er viktig for å bestemme den terapeutiske stråledose hos pasienter. I denne studien, beregnet vi absorbert dose på organer i en 70-kg referanse mann fra våre biofordelingsstudier data. Dosene som absorberes av lever, nyre, milt og benmarg ble 2,1 mGy /MBq, 3,8 mGy /MBq, 1,3 mGy /MBq, og 0,4 mGy /MBq, respektivt. I en klinisk studie av
90Y-Zevalin akseptable absorberte doser for normale organer og rød marg var under 20 Gy og 3 Gy, henholdsvis [30]. De maksimale tolererte doser, beregnet fra doser absorberes av lever, nyre, milt og benmarg, var 9,5 GBq, 5,3 GBq, 15,4 GBq, og 7,5 GBq, henholdsvis. Derfor er estimert maksimal terapeutisk dose
90Y-B5209B 5,3 GBq. Det er imidlertid rapportert at biofordelingen av det radiomerkede antistoff viser et avvik mellom dyremodeller og hos pasienter [31]. Videre B5209B reagerer på menneskelig ROBO1 men ikke overfor murine ROBO1. Det er nødvendig å utføre en biodistribusjon studie med
111In-B5209B hos pasienter å anslå nøyaktig dosimetri.
Det ble observert en forskjell i graden av skade mellom sternum og femur. Imidlertid akkumulering av
111In-B5209B har ingen forskjell mellom de to i vårt studium biodistribusjon. Dette tyder på at oppbyggingen av
90Y-B5209B til disse organene er ikke en hovedfaktor av forskjellen i graden av ødeleggelse mellom de to. Vi har tidligere forklart at denne forskjellen kan skyldes intervallet forskjell fra blod basseng og høy akkumulering områder som tumor, lever og milt [14]. Dette tyder på at graden av bivirkninger i RIT har potensial til å endre seg avhengig av en metastatisk stilling. Derfor er det nødvendig å identifisere fokale posisjoner før injeksjonen av
90Y-merkede RIT middel for estimering av bivirkning.
I milten, observerte vi regenerative øyer sammensatt av erytroblast og granulocytiske celler på dagene 14 og 21, sammen med en betydelig økning i antall av hematopoetiske celler, inkludert megakaryocytter. Disse resultatene antydet at regenereringen av hematopoietiske vev startet på dag 14-20, og skade på hematopoietiske vev var forbigående med denne behandlingen. Økningen av megakaryocytter ble observert etter at økningen i erytroblaster og granulocytter. I tillegg observerte vi en reduksjon i megakaryocytter, uten erytroblaster og granulocytter, i femur. Kashiwakura et al. rapporterte at kolonidannende enhet megakaryocytter er mer radiosensitive enn andre myeloide stamceller [32]. Derfor kan den høye radiosensitiviteten av kolonidannende enhet megakaryocytter forklare disse fenomener.
På dag 7, observerte vi en utposning av hepatocytter i leveren.
