Abstract
En viktig mekanisme av monoklonale antistoffer som selektivt målrette insulin-like growth factor type 1 reseptor (IGF-1R) for å hemme tumorvekst er av downregulating reseptoren, uansett om de er i stand til (antagonistisk) eller uskikket (agonistisk) for å blokkere bindingen av beslektede ligander. Vi har utviklet og karakterisert et nytt agonistisk anti-IGF-1R humanisert antistoff, HR1, og brukte Dock-og-Lock (DNL) metode for å konstruere Hex-HR1, den første flerverdige antistoff som omfatter 6 funksjonelle Fabs av HR1, med sikte å styrke styrken på HR1. Basert på kryss-blokkerende eksperimenter, gjenkjenner HR1 en region av cystein-rike domenet på α-subenheten, forskjellig fra epitopene kartlagt for eksisterende anti-IGF-1R antistoffer, men HR1 er lik andre anti-IGF-1R antistoffer i downregulating IGF-1R og inhibering av proliferasjon, kolonidannelsen, eller invasjon av utvalgte cancercellelinjer in vitro, så vel som å undertrykke vekst av RH-30 rhabdomyosarkom xenograft i nakne mus når det kombineres med mTOR inhibitor, rapamycin. Hex-HR1 og HR1 er generelt sammenlignbare i deres bioaktivitet under i-intro og in vivo forhold undersøkt. Likevel, i selektive forsøk med en direkte sammenligning av styrke, demonstrerte Hex-HR1 en sterkere effekt på å hemme celleproliferasjon stimulert av IGF-1 og effektivt downregulate IGF-1R i en konsentrasjon så lav som 20 pm.
Citation: Chang CH, Wang Y, Trisal P, Li R, Rossi DL, Nair A, et al. (2012) Evaluering av en roman Seksverdig humanisert anti-IGF-1R antistoff og dens Bivalent Foreldre IgG i Diverse Cancer Cell Lines. PLoS ONE 7 (8): e44235. doi: 10,1371 /journal.pone.0044235
Redaktør: Zhaozhong Han, Vanderbilt University, USA
mottatt: May 24, 2012; Godkjent: 30 juli 2012; Publisert: 31 august 2012
Copyright: © Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute gi 1R 43CA150742-01 fra USA National Institutes of Health. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært følgende interesser. Selv om en eller flere av forfatterne er ansatt av kommersielle selskaper immunomedics, Inc, IBC Pharmaceuticals, Inc, og Center of Molecular Medicine og immunologi, ikke dette endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Signaler overføres gjennom celleoverflate-vekstfaktorreseptorer ved binding til beslektede ligander er essensielle for regulering normal cellevekst og differensiering, men også bidra til utvikling, spredning, overlevelse, motilitet, og metastase av forskjellige typer av maligne celler, som eksemplifisert ved de godt studert insulin-lignende vekstfaktorer (IGF), og deres hovedsignale reseptor, IGF-1R [1] – [4]. IGF signaleringsakse består også av insulin som en ligand; tre andre homo-reseptorer, IGF-2R, insulinreseptoren isoform A (IRA), og insulinreseptoren isoform B (IRB); tre hybrid-reseptorer, hver dannet av IGF-1R og IRA, IGF-1R og IRB, og IRA og IRB; seks IGF bindende proteiner (IGFBRs); og en gruppe av proteaser som nedbrytes IGFBP å frigjøre IGF. IGF-1 R er en reseptor-tyrosinkinase, som består av to disulfid-bundne ekstracellulære a-subenheter, hver også disulfid-bundet til et trans β-subenheten. Den cytoplasmatiske region av β-subenheten havner en tyrosin kinase domene, samt et forankrings område for medlemmer av insulinreseptoren substratet (IRS) familien, og SH2-inneholdende adapter protein, SHC [5]. IGF-1 binder seg til a-underenhetene i IGF-1R med en høyere affinitet enn IGF-2 [6]. Inngrepet av IGF-1R av IGF induserer autofosforylering av de tre tyrosinrester i kinasedomenet av β-underenheten [7], noe som ytterligere fosforylerer andre tyrosinrester i det cytoplasmatiske domene, og dermed fører til rekruttering av IRS og SHC, med etterfølgende aktivering av både fosfoinositid 3-kinase (PI3K) -Akt og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) trasé [8]. De minimale strukturelle elementer av IGF-1-bindingssetet på IGF-1R er blitt bestemt [9] for å kreve den N-terminale domene L1 (aa 1-150), den C-terminale ende av det cysteinrike område (aa 190- 300), og den C-terminale ende av den α-subenheten (aa 692-702). Til sammenligning ble de funksjonelle epitoper av IGF-2 på IGF-1R kartlagt [10] for å involvere den N-terminale domene L1 og den C-terminale ende av den α-underenheten, men ikke det cysteinrike domene. I tillegg til IGFBP, er biotilgjengeligheten av IGF-2 reguleres også av IGF-2R, som mangler intracellulær kinase-aktivitet og således fungerer som en scavenger reseptor for IGF-2. Selv om IRB gjenkjenner bare insulin, dets spleisevariant, IRA, som er mest uttrykt av tumorer, binder også til IGF-2 [11] med høy affinitet, som resulterer i mitogene effekter og økt overlevelse, motilitet, og invasivitet av kreftceller [12 ]. Kompleksiteten av IGF-signaleringssystemet blir ytterligere forsterket ved evnen til IGF-2 for å stimulere IRA og IRA /IRB, evne til både IGF-1 og IGF-2 for å stimulere IGF-1 R, IGF-1R /IRA, og IGF-1R /IRB, og krysstale mellom IGF-1R og EGFR [13] – [15], som alle synes å utgjøre reaksjonsveier for visse kreftceller å unnslippe IGF-1 R-målrettet terapi, og gi den rasjonelle for cotargeting IGF -1R med IR [16], [17] eller EGFR /HER2 [18], [19] for å forbedre behandlingsvirksomhet.
potensialet for målretting IGF-1R for å behandle kreft ble demonstrert i utgangspunktet ved evnen αIR-3, et mus monoklonalt antistoff (mAb) som blokkerer IGF-1 R-binding [20], til å inhibere in vivo veksten av østrogen-uavhengig MDA-MB-231 human brystcancer-xenograft i nakne mus [21]. To hovedstrategier for IGF-1R-rettet behandling (nemlig blokkere anti-IGF-1R antistoffer og små molekyl hemmere av tyrosin kinase reseptorer) har blitt aktivt fulgt det siste tiåret, noe som resulterer i ulike prekliniske og kliniske studier i ulike kreftformer, som ble gjennomgått med jevne mellomrom [22] – [36]. I tillegg ble potensialet for dual inhibering av IGF-1 og IGF-2 med nøytraliserende antistoffer påvises mer nylig [37].
fleste mAbs utviklet mot IGF-1R hittil var utformet for å skåne IR og selektivt hemme IGF-IR-mediert signalisering ved å blokkere IGF fra bindende. De deler også en felles eiendom for å indusere IGF-1R downregulation via internalisering og degradering [38], noe som kan utilsiktet påvirke insulinsignaleringen på grunn av samtidig nedregulering av hybrid IGF-1R /IR reseptorer [39]. Som oppsummert i tabell S1 i tilleggsinformasjon
Online spill, disse mAbs, foruten å være mus, humanisert eller helt menneske, varierer i strukturelle og funksjonelle egenskaper som inkluderer isotype, epitop, styrke til å hemme eller begge IGF, og affinitet for IGF-1R. Åtte slike mAbs (AVE1642, BIIB022, cixutumumab, dalotuzumab, figitumumab, ganitumumab, R1507, og robatumumab) har vært eller er for tiden i kliniske studier i ulike kombinasjoner. Mens objektive responser ble rapportert fra noen fase II-studier, for eksempel i to studier [40], [41] som viser klinisk nytte i ikke-småcellet-lungekreft (NSLCL) pasienter behandlet med figitumumab, paclitaxel og karboplatin (FPC) to påfølgende fase III studier som evaluerte FPC og en kombinasjon av figitumumab med erlotinib i uselekterte pasienter med avansert NSCLC har blitt suspendert i oktober 2009, på grunn av manglende effekt og større toksisitet enn forventet fra tidligfase data [42]. Derfor, til tross en mengde sterke prekliniske data som støtter begrunnelsen for IGF-1R-målrettet kreftbehandling, generelt skuffende kliniske resultater, som avslørt av figitumumab, R1507 (klinisk utvikling suspendert i desember 2009), og andre [43], har pekt til en fremtidig retning som vil fokusere på identifisering og validering av prediktive biomarkører, samt etterforskningen av mer rasjonelle kombinasjoner med andre legemidler mot kreft for å bekjempe vanlige resistensmekanismer utviklet fra blokade av IGF-1R alene.
Flerverdige antistoffer ofte øke styrken på sine toverdige foreldre, blant annet som følge av høyere binding grådighet til beslektede antigener på målceller. Bruke Dock-og-Lock (DNL) plattform [44], [45] for å generere en seksverdig antistoff, betegnet Hex-HR1, fra sin bivalent forelder, HR1, en roman humanisert antistoff (IgG1,
kappa
) som er rettet mot IGF-1R, men ikke IR, vi utforsket muligheten til å sammenlikne de ulike biologiske aktiviteter som oppvises av Hex-HR1 og HR1 i forskjellige cancercellelinjer, så vel som deres in vivo-effektivitet i en xenograft modell av humant rhabdomyosarkom (RH -30) i nakne mus, med eller uten tilsetning av rapamycin. Vi rapporterer heri som HR1 binder til en region av IGF-1R som ligger i midten av det første halvdel av det cysteinrike område (aa 185 -222), som er forskjellig fra epitopene som er rapportert for en rekke anti-IGF-1 R-mAb [46, 47 og Tabell S1]. Den ulikhet av HR1 til de anti-IGF-1R mAbs i klinisk utvikling omfatter også sin manglende evne til å blokkere bindingen av enten IGF-1 eller IGF-2 til IGF-1R, og en spennende oppførsel å indusere fosforylering av IGF-1R og nedstrøms signalering uten særlig stimulere cellevekst. På den annen side, er HR1 lik andre anti-IGF-1R antistoffer i sin evne til å nedregulere IGF-1R og hemme proliferasjon, kolonidannelsen, eller invasjon av utvalgte cellelinjer in vitro, så vel som å forsinke veksten av RH -30 xenograft i nakne mus når det kombineres med mTOR inhibitor, rapamycin. Hex-HR1 og HR1 er generelt sammenlignbare i deres bioaktivitet på de vilkår som er undersøkt, selv om Hex-HR1 gjorde viser en høyere potens enn HR1 i downregulating IGF-1R og hemme spredning av visse responsive kreftcellelinjer.
Materialer og Methods
Cell Lines, Antibodies, og Reagenser
Alle cellelinjer ble kjøpt fra ATCC, med unntak av RH-30, som ble oppnådd fra DSMZ. Humaniserte antistoffer, omfattende HR1, hPAM4 (anti-mucin), HA20 (anti-CD20), hRS7 (anti-Trop-2), hLL2 (anti-CD22), og HMN-15 (anti-CEACAM6), ble gitt av immunomedics . Rekombinant human IGF-1R (rhIGF-1R), rekombinant humant IGF-1, rekombinant human IGF-2, og mus anti-human IGF-1 R-mAb (MAB391) ble oppnådd fra R fra Santa Cruz Biotechnology for 2C8, 1H7, 3B7, og C-20; fra Millipore for 24-57 og 24-31; og fra Invitrogen for 17-69, 24-60, og 1-2. Fosfor-spesifikke antistoffer og andre primære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling eller Santa Cruz Biotechnology. Pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoff og One Solution Cell Proliferation assay (MTS) ble oppnådd fra Promega. FITC- eller TRITC-konjugerte sekundære antistoffer var fra Jackson Immunoresearch Laboratories. PhosphoSafe Ekstraksjonsreagens og RIPA buffer brukes til cellelyse ble hentet fra EMD Biosciences og Cell Signaling, henholdsvis. Cellekultur media, kosttilskudd, og storfe transferrin (holo form) ble kjøpt fra Invitrogen. Rapamycin (Sigma-Aldrich) ble oppløst i DMSO, delt i porsjoner og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Protein Assay Dye Reagent Concentrate var fra Bio-Rad. Alle andre kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma.
Cell Culture
maligne cellelinjer ble rutinemessig opprettholdt ved 37
o C i 5% CO
2 i RPMI 1640 medium supplert med 10 % varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 1% Glutamax i, 1% HEPES, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% natriumpyruvat (referert til som 10% RPMI). For CAPAN-1, ble 20% FBS anvendt (20% RPMI). Dyrkningsmediet ble endret minst en gang i uken og bare celler med færre enn 50 passasjer ble brukt til eksperimenter.
Generering av R1
Tre BALB /c mus ble hver immunisert intraperitonealt med 15 ug av rhIGF-1R (Met1Asn932), som omfatter en blanding av både behandlet og ubehandlet ekstracellulære domene av human IGF-1R, i fullstendig Freunds adjuvans. Ytterligere immuniseringer i ukomplett Freunds adjuvans ble utført 14, 21 og 28 dager etter den innledende immuniseringen. Hybridomer ble dannet ved å fusjonere miltceller fra de immuniserte mus med P3 x 63Ag8.653 myelomceller. En hybridom-klon (C-11), hvis supernatant viste bindingsaktivitet for IGF-1R, men ikke IR, ble isolert og ekspandert i kultur for å oppnå mus antistoff betegnet R1 eller MR1.
Generering av CR1
Chimerization av R1 for å oppnå CR1 ble utført som følger. V
H og V
K gener av R1 ble klonet ved 5′-RACE. DNA-sekvensene av de klonede V
H og V
K gener ble bestemt med ektheten bekreftet av N-terminal protein sekvensering som viste en eksakt match av de første 15 N-terminale aminosyrene med de tilsvarende aminosyrer utledet fra DNA-sekvenser (tabell S2). Det klonede V
H og V
K gener ble innført i
pdHL2
vektor for å danne
cR1pdHL2
, som ble anvendt for å transfektere SPE-26-celler, en variant ofSp2 /0-Ag14 utviklet. Transfektanter ble selektert med 0,075 pM metotreksat (MTX), og screenet ved hjelp av ELISA av humant Fc-bindende aktiviteter. Høyere produserende kloner ble ytterligere utvidet for å få de to beste kloner (709.2D2 og 710.2G2), hvorfra CR1 ble produsert i batch kulturer og renset ved Protein A kromatografi.
Generering av HR1
humanisering [48] fra CR1 til HR1 ble oppnådd ved poding av CDR’ene på de humane rammeverkregionene av hMN-14. For enkelte ramme stillinger, ble murine rester av R1 beholdes, som resulterer i aminosyresekvensene av HR1 V
H (fig S1A) og HR1 V
K (figur S1B). Syntetiske gener som koder HR1 V
H og HR1 Vk ble manipulert inn
pdHL2
å få
hR1pdHL2
, ekspresjonsvektoren for HR1. Etterfølgende forsøk på å sikre produksjonen klon (711.3C11) for HR1 var lik de som er beskrevet ovenfor for CR1, med unntagelse av at de positive kloner ble utvalgt for binding aktivitetene til både humant Fab og rhIGF-1R.
Generation of Hex -hR1 av DNL
C
H1-DDD2-Fab-HR1 og C
H3-AD2-IgG-HR1 ble produsert som fusjonsproteiner i SpESF celler [49] transfektert med de respektive vektorer som beskrevet for C
H1-DDD2-Fab-HA20 og C
H3-AD2-IgG-HA20 [50]. Heks-HR1 ble oppnådd som følger. C
H1-DDD2-Fab-HR1 ble blandet med C
H3-AD2-IgG-HR1 i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, med 1 mM EDTA, i et molart forhold på 4,2 for å bevirke konjugering av de fleste, om ikke alle, C
H3-AD2-IgG-HR1 til C
H1-DDD2-Fab-HR1, og dermed redusere den potensielle co-rensning av C
H3-AD2-IgG- HR1 med det endelige produktet ved protein A-kolonnekromatografi. DNL Reaksjonen ble initiert ved å tilsette redusert glutation (GSH) til 1 mM, etterfulgt av tilsetning av oksydert glutation (GSSH) til 2 mm på den neste dag, og etter en ytterligere inkubering over natten ble Hex-HR1 renset fra den resulterende løsning ved protein A kromatografi.
Purity, størrelse og Mass Analyser
Størrelse-utelukkelse høy ytelse væskekromatografi (SE-HPLC) ble utført på en Beckman System Gold Modell 116 med en BioSep-SEC-S3000 -kolonne (300 x 7,80 mm) av Phenomenex ved bruk av 0,04 M PBS (pH 6,8) pluss 1 mM EDTA som den mobile fase for å bestemme molekyl integritet og produktrenhet av mAbs og HexAbs. De gjennomsnittlige hydrodynamiske diameter på HR1 og Hex-HR1 ble bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) med en kontrakt til Microtrac. Elektrospray ionisering flukttiden (ESI-TOF) væskekromatografi /massespektrometri (LC-MS) ble utført på en 1200-serier HPLC kombinert med en 6210 TOF MS (Agilent Technologies). I korthet, HR1 eller Hex-HR1 ble redusert med 50 mM tris (2-karboksyetyl) fosfin i 30 min og løses ved omvendt fase HPLC (RP-HPLC), ved anvendelse av en 20-min gradient av 30-80% acetonitril i 0,1% vandig maursyre med en Jupiter C4 5μ kolonne (Phenomenex). For TOF MS ble kapillær og fragmentor spenninger satt til 5500 og 250 V, henholdsvis.
Konkurranse Binding Studier
Homogene polystyren mikroperler belagt med rhIGF-1R å tjene som surrogater av celler uttrykkende IGF-1R ble benyttet i alle konkurrerende bindingsstudier. Å sammenligne bindende affinitet, varierende konsentrasjoner av umerket MR1, CR1, og HR1 ble blandet med en konstant mengde Alexa Fluor 532-merket CR1 (532-CR1). De belagte kuler ble tilsatt til en endelig tetthet på 2 x 10
5 partikler /ml og blandingene ble inkubert ved romtemperatur (RT) i 1 time med forsiktig vugging. Den bundne 532-CR1 ble bestemt ved å måle median fluorescensintensitet (MFI) på 2000 perler på en Guava PCA System (Millipore).
For å avgjøre om CR1 kan blokkere bindingen av IGF-1 eller IGF-2 til IGF-1R, forskjellige konsentrasjoner (0-670 nM) av CR1, IGF-1 eller IGF-2 ble blandet med en konstant mengde av
125I-IGF-1 eller
125I-IGF-2. De belagte perler ble deretter tilsatt, inkubert ved romtemperatur i 1 time med forsiktig vugging, vaskes og telles for radioaktivitet.
For å undersøke den bindende regionen av HR1 på IGF-1R, en panel av kommersielt tilgjengelige anti-IGF -1R mAbs, med sine epitoper til IGF-1R kartlagt (unntatt MAB391), ble evaluert som konkurrenter for å blokkere HR1 fra binding til rhIGF-1R-belagte perler. I disse eksperimentene, R1, CR1, HR1, MAB391, 24-60, og αIR-3 ble hver merket med R-fykoerytrin (PE) og inkuberes med et umerket antistoff av interesse ved varierende konsentrasjoner.
Binding til Cell Surface IGF-1R
Hver prøve ble fremstilt i duplikat for å inneholde 2 x 10
5-celler og 10 ug /ml av et testantistoff i et sluttvolum på 200 ul. Etter inkubering ved 4 ° C i 45 minutter, ble prøvene vasket to ganger med PBS-1% BSA, etterfulgt av tilsetning av FITC-GAH IgG (H + L), og en ytterligere inkubasjon ved 4 ° C i 45 minutter i mørk. Prøvene ble deretter vasket to ganger med PBS-1% BSA, resuspendert i 500 ul PBS-bufret formalin, og analysert på FACScan.
Cell Proliferation Assay
Alle inkubasjoner av celler ble utført ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. Cellene ble løsnet med trypsin, vasket tre ganger med PBS for å fjerne alle spor av serum og resuspendert i et serumfritt medium inneholdende 10 ug /ml bovint transferrin (SFM-TRF). Celler ble sådd ut på 1,0 x 10
3 celler /50 ul /brønn og inkubert over natten. På dagen etter hver test artikkel i SFM-TRF var 5-ganger fortynnet i serie fra 400 nM til 0,001 nM og 50 pl av hver konsentrasjon ble tilsatt i triplikat til brønnene, slik at de endelige konsentrasjoner av test artikkelen varierte fra 200 nM til 0,0005 nm. Ubehandlede kontrollceller mottok bare 50 ul av SFM-TRF. Etter inkubering i 1 time, utpekte brønnene mottok 100 ul av hver testartikkel ved samme konsentrasjon i SFM-TRF inneholdende 50 ng /ml IGF-1. Platene ble så inkubert i en tidsperiode som indikert, og antallet levedyktige celler i hver brønn ble bestemt ved bruk av MTS-analyse i henhold til produsentens protokoll.
kolonidannelse analyse av celler dyrket i monolagskultur
DU 145 celler ble frittliggende med trypsin og belagt i 60 mm-retter (1 × 10
3 celler) i 10% RPMI supplert med 1% penicillin /streptomycin (P /S). Test artikler ble tilsatt, og medium inneholdende testartiklene ble erstattet hver fire dager Etter 14 dager ble cellene fiksert i 4% para-formaldehyd og farget med 5% Giemsa-løsning. Kolonier større enn 50 celler ble nummerert under et mikroskop. I et separat eksperiment, ble testartiklene ikke tilsettes til den etterfølgende medium.
kolonidannelse analyse av celler dyrket i soft agar
Basal-agar (0,5%) ble fremstilt ved å blande 1% agar ( ved 40 ° C) med et like stort volum av 2 x 10% RPMI og tilsatt til hver brønn (0,5 ml) i en 24-brønns plate. Celler i 2 x 10% RPMI ble blandet med et like stort volum av 0,7% agarose og tilsatt (0,5 ml) til toppen av basen agar for den endelige celletall på 1250 pr brønn i 0,35% agarose. Celler ble foret med 0,5 ml av 10% RPMI tilsatt til hver brønn ukentlig. Behandlede brønner inneholdt testartiklene i agarose /cellelaget ved begynnelsen og i etterfølgende foring. Når koloniene var klart synlig ved mikroskopi på ubehandlede kontrollbrønner, ble mediet fjernet og de kolonier farget med krystallfiolett. Kolonier ble talt under et mikroskop og gjennomsnittlig antall ble bestemt fra fem forskjellige synsfelt i brønnen.
immunoblotanalyse
Med mindre annet er angitt, ble cellene sultet i serumfritt medium for 24 time, behandlet, og lysert i iskald temperatur i en buffer som angitt. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bio-Rad Protein Assay, og prøver (15 til 30 ug ligger i hvert kjørefelt) ble separert på 4-20% Tris-glysingeler, overført til PDVF eller nitrocellullose membraner, blokkert med TBST-buffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) som inneholdt 5% fettfri melk, vasket med TBST-buffer, og inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer. Membranene ble deretter vasket i TBST fire ganger (en gang i 15 min og tre mer i 5 min hver), inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved RT, vasket i TBST-buffer fire ganger som beskrevet ovenfor, deretter påvist med Super signal~~POS=TRUNC West Dura Utvidet Varighet substrat (Thermo Scientific) i henhold til instruksjonene gitt av produsenten. Immunoavtrykket signaler ble visualisert med en chemiluminescence system (Thermo Scientific). Digitale bilder ble behandlet av Carestream (Carestream Molecular Imaging).
nedregulering av IGF-IR
Celler i 10% RPMI ble sådd på 1 × 10
6 per 100-mm fatet og dyrket over natten for vedlegg. På neste dag ble mediet erstattet med friskt 10% RPMI inneholdende en testartikkel av interesse ved indikerte konsentrasjoner og cellene ble ytterligere inkubert i 24 timer, eller en forutbestemt tid. For analyse ved Western blot, ble behandlet cellene vasket med kald PBS, skrapt fra skålene, oppsamlet og sentrifugert ved 4 ° C ved 2000 rpm i 5 min. Cellene fra pelletene ble lysert i 10 min på is i RIPA-buffer eller en buffer bestående av 25 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton og 1 x Complete, EDTA-fri Protease Inhibitor cocktail (Roche Diagnostics ). Lysatene ble klaret ved sentrifugering, undersøkt med hensyn til proteinkonsentrasjon og analysert ved immunblotting. For analyse ved flowcytometri, ble behandlede cellene vasket to ganger i PBS, inkubert med PE-merket 1H7 i 1 time, vasket to ganger med PBS, resuspendert i 500 ul PBS, og analysert på FACScan.
Fosforylering av IGF -IR og Akt
Cells (5 × 10
5 per brønn) ble dyrket i 10% RPMI i 6-brønners plater over natten for vedlegg. Etter to vaskinger med serumfritt medium, ble cellene inkubert i 4 timer i serumfritt medium og behandlet med testartiklene ved indikerte konsentrasjoner for en bestemt tid. Cellene ble deretter stimulert med IGF-I i 10 minutter, vasket med PBS, lysert med 200 ul av RIPA-buffer i 5 min ved romtemperatur, og behandlet for immunoblot-analyse.
Matrigel Invasion Assay
produsentens protokoll på BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (BD Biosciences) ble fulgt under anvendelse av 24-brønners-formatet, som gir 12 innsatser, hver inneholdende en 8-um porestørrelse membran med et tynt lag av Matrigel basalmembran matrise. Før bruk ble den 24-brønnsammenstillingen fjernet fra lagring ved -20 ° C og fikk oppvarmes til romtemperatur. Det indre av innsatsene og bunnen av brønnene ble rehydrert med varm (37 ° C) bikarbonat-baserte dyrkningsmedium i 2 timer, og omhyggelig fjernet. Celler (0,5 ml på 5 x 10
4 /ml) i serumfritt medium ble anbragt i innsatsen (øvre kammer) og brønnen (nedre kammer) ble fylt med 0,5 ml 10% RPMI. Etter 2 timer ble testartiklene tilsatt til cellene i det øvre kammer og inkuberingen fortsatt i 20 timer, på hvilket tids celler som forble i Matrigel eller festet til den øvre side av membranen ble fjernet med bomulls tips. Celler på den nedre side av membranen ble fiksert i metanol, farget enten med Wright-Giemsa beis eller Hoechst 33258, og undersøkt under et fluorescerende mikroskop.
Immunofluorescence Mikros
-celler dyrket på dekkglass ble vasket, fiksert med 4% formalin, vasket, inkubert med primære antistoffer i 1 time ved RT, vasket med PBS og omsatt med FITC- eller TRITC-konjugerte sekundære antistoffer ved RT i 40 min. Etter vasking ble prøvene farget med Hoechst 33258, montert, og undersøkt under et fluorescerende mikroskop.
In vivo Effekt
Dame åtte uker gamle SCID mus (Taconic Farms) ble brukt. Hver mus ble injisert subkutant med 5 × 10
6 RH-30 celler. Når tumorer nådde ca 0,2 cm
3 i størrelse, ble dyrene delt inn i seks grupper på 10 mus hver injisert i.p. to ganger i uken i fire uker med HR1 (1 mg), Hex-HR1 (0,82 mg), rapamycin (5 mg /kg), HR1 (1 mg) pluss rapamycin (5 mg /kg), Hex-HR1 (0,82 mg) pluss rapamycin (5 mg /kg), og saltløsning (inneholdende 2% DMSO), henholdsvis. En stamløsning av rapamycin ble fremstilt i saltløsning (inneholdende 2% DMSO) ved 1 mg /ml og 100 pl ble administrert til hver mus per injeksjon. Tumorer ble målt og musene veid to ganger ukentlig. Dyrene ble avlivet når tumorer nådde 2 cm
3. En annen studie for å sammenligne effekt av HR1 og Hex-HR1 gitt ved molare ekvivalente doser (0,33 mg vs 0,82 mg) også ble utført. Protokoller for dyrestudier ble godkjent av CMMI Institutional Animal Care og bruk komité.
Statistical Analysis
For in vitro-studier, den statistiske forskjellen mellom to populasjoner ble bestemt av Student
t
-test. Statistisk analyse for tumorvekst data var basert på areal under kurven (AUC) og median overlevelsestid ved hjelp av en to-halet
t
-test for å vurdere betydningen mellom alle de forskjellige behandlingsgrupper og kontroller, med unntak av saltvann kontroll, som en one-tailed
t
-test ble brukt. Overlevelseskurver ble analysert ved Kaplan-Meier plott (log-rank analyse), ved hjelp av Prism GraphPad programvarepakken (v4.03 Advanced Graphics Software, Inc.). En verdi på
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Kjente Egenskaper av R1, CR1 og HR1
Foreldre R1 ble vist. for delvis å inhibere bindingen av
125I-merket IGF-1 (
125I-IGF-1) til den humane brystkreftcellelinjen MCF-7L (en sublinje av MCF7) sammenlignes med MAB391 (tabell S3). Chimerization av R1 syntes å forbedre affiniteten av R1 for rhIGF-1R immobilisert på polystyren-kuler, som vist ved en konkurranseanalyse i hvilken bindingen av R1 merket med en fluorescerende probe (Alexa 532) ble målt ved strømningscytometri i nærvær av varierende konsentrasjoner av CR1 eller R1 (figur S2). Antistoffer produsert av de to kloner av CR1 viste samme affinitet på 0,1 nM (figur S3) og var spesifikke for immobilisert rhIGF-1R, men ikke immobilisert rhIR (figur S4). Imidlertid CR1 mislyktes i å blokkere bindingen av IGF-1 eller IGF-2 til immobilisert rhIGF-1R i vulsten assay (fig S5), i motsetning til den tidligere observasjon at dens motstykke murine kan delvis inhibere bindingen av
125I- IGF-1 til MCF-7l-celler. Vellykket humanisering ble demonstrert ved den tilsvarende potens av HR1 og CR1 til å konkurrere med 532-CR1 for binding til rhIGF-1R-immobiliserte perler (fig S6). På den annen side, vulsten analysen viste også HR1 var ineffektiv til å inhibere bindingen av
125I-IGF-1 til den immobiliserte rhIGF-1R (figur S7). Basert på resultatene fra de kryssblokkeringsforsøk (tabell 1 og 2), ble de epitop av HR1 utledet til å ligge mellom aminosyrerestene 185 og 222 i midt første halvdel av det cysteinrike domene. Intriguingly, selv om MAB391 hadde ingen virkning på bindingen av PE-merket R1 til immobilisert rhIGF-1R (figur S8A), R1 vesentlig redusert bindingen av PE-merkede MAB391 (figur S8B), noe som tyder på at R1 kan inhibere bindingen av MAB391 til immobilisert rhIGF-1R allosterisk.
molekylær karakterisering av HR1 og Hex-HR1
SE-HPLC og DLS profiler av HR1 og Hex-HR1, vist i fig. 1A og 1B, respektivt, angir deres høye grad av homogenitet. For HR1, ble det observert en enkelt topp ved 8,51 min. Heks-HR1, som omfatter et par av stabiliserte dimerer av HR1 Fab etterfølgende til en fullstendig HR1 IgG i karboksylsyreenden enden av de to tunge kjeder, viste også bare en større topp ved 7,43 min. De partikkelstørrelser på HR1 og Hex-HR1 var stort sett monodisperse, med den gjennomsnittlige hydrodynamiske diametre på 10,34 nm og 15,83 nm, respektivt.
Som vist i tabell 3, at massen av hver av polypeptidene omfattende HR1 og Hex-HR1 bestemt ved LC /MS var konsistent med den masse beregnes ut fra deres avledet aminosyresekvens og forutsagt post-translasjonelle modifikasjoner, inkludert N-bundet glykosylering og amino-terminale pyroglutamat på den tunge kjeden av HR1 og Hex-HR1, og FD-DDD2 kjede av Hex-HR1. For både HR1 og Hex-HR1,
kappa
kjeden, som ikke er endret, ga en nesten identisk masse observert innen 20 ppm av den anslåtte masse. For HR1, ble den tunge kjede detektert som flere isoformer, inkludert de av karboksyl-terminale lysin varianter og forskjellige glykoformer. For Hex-HR1, den AD2-smeltet tung kjede var intakt, med overveiende G0F og G1F glycoforms. Den HR1-Fd-DDD2 komponent i Hex-HR1 også matchet av den anslåtte massen innenfor 0,1 ppm, uten ekstra posttranslasjonelle modifikasjoner foruten amino-terminal pyroglutamate.
Uttrykk for IGF- 1R i Diverse Cancer Cell Lines
Positiv binding av HR1 og Hex-HR1 ble demonstrert i MCF7- (brystkreft), DU 145 (prostatakreft), ME-180 (livmorhalskreft) og RH-30 (rhabdomyosarkom) ved strømningscytometri (tabell 4). Basert på det observerte midlere fluorescensintensitet (MFI), uttrykket nivåer av IGF-1R varierte blant disse fire cellelinjer, med den relative overflod av reseptoren i RH-30 økte nesten to ganger i DU-145 eller ME-180, og ca 3 ganger i MCF7-. I lys av det antall av overflate IGF-1RS per celle som er rapportert for RH-30 [51] og MCF7 [52] for å være 20 600 og 43 000, henholdsvis, ville det være en 2,3-gangers økning i MCF7 sammenlignet med RH-30 , noe som stemmer godt med tre-dobling estimert fra MFI data. Fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
