Abstract
Molecular subtyper av serøs eggstokkreft har nylig blitt beskrevet. Ved hjelp av data fra uavhengige datasett inkludert over 900 primærtumorprøver, viser vi at dereguleringen av
La-7
veien er spesifikt knyttet til C5 molekylære subtype av serøs eggstokkreft. DNA kopiantall og genuttrykk av
HMGA2
, alleler av
La-7
,
LIN28
,
LIN28B
,
MYC
MYCN
,
DICER1
, og
RNASEN
ble målt ved hjelp av microarray og kvantitativ revers transkriptase PCR. Immunhistokjemi ble utført på 127 prøver ved hjelp av microarray og anti-HMGA2 antistoffer. Fluorescens in situ hybridisering av bakterielle kunstige kromosomer hybridiserte til 239 ovarietumorer ble brukt til å måle trans på
LIN28B
locus. Short interfering RNA knockdown i eggstokkene cellelinjer ble brukt til å teste funksjonaliteten foreninger observert. Fire molekylære undergrupper (C1, C2, C4, C5) av høy grad av serøs eggstokkreft ble robust representert i hvert datasett og viste lignende mønster av pasientens overlevelse. Vi fant svært spesifikk aktivering av en vei som involverer
MYCN
,
LIN28B
,
La-7 Hotell og
HMGA2
i C5 molekylære subtype definert av
MYCN
forsterkning og over-uttrykk, over-uttrykk for
MYCN
mål inkludert
La-7
repressor
LIN28B
, tap av
Let -7
uttrykk og
HMGA2
forsterkning og over-uttrykk.
DICER1
, en kjent
La-7
målet, og
RNASEN
var over-uttrykt i C5 svulster. Vi så ingen bevis for trans på
LIN28B
locus i C5 svulster. Den rapporterte samspillet mellom
LIN28B Hotell og
La-7
ble rekapitulert av siRNA knockdown i eggstokkreft cellelinjer. Våre resultater knytte deregulering av
MYCN Kjøpe og nedstrøms mål, inkludert
La-7 Hotell og onkoføtal gener, med serøs eggstokkreft. Vi definerer for første gang hvordan elementer i et oncogent reaksjonsvei, som omfatter flere gener som bidrar til stamcelle fornyelse, er spesielt endres på en molekyl subtype av serøs eggstokkreft. Ved å definere driverne av en molekylær subtype av serøse eggstokkreft vi tilby en ny strategi for målrettet terapeutisk intervensjon
Citation. Helland Å, Anglesio MS, George J, Cowin PA, Johnstone CN, Hus CM, et al . (2011) Deregulering av
MYCN
,
LIN28B Hotell og
LET7
i en Molecular Undergruppe av Aggressive høyverdig Serous eggstokkreft. PLoS ONE 6 (4): e18064. doi: 10,1371 /journal.pone.0018064
Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore
mottatt: 18 november 2010; Godkjent: 18 februar 2011; Publisert: 13 april 2011
Copyright: © 2011 Helland et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AOCS var støttet av United States Army Medical Research og forsyningskommando i henhold DAMD17-01-1-0729, The Cancer Council Tasmania, The Cancer Foundation of Western Australia og National Health and Medical Research Council of Australia. Denne forskningen ble støttet av en viktoriansk biovitenskap Computation Initiative (VLSCI) tilskudd på sin Peak Computing Facility ved University of Melbourne, et initiativ fra den viktorianske regjeringen, og også med tilskudd fra Radiumhospitalet Foundation og Fredriksen Foundation for Ovarian Cancer Research . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
styring av eggstokkreft er i overgangen. Det er i økende grad tydelig at eggstokkreft er en kompleks serie av forskjellige tumortyper [1], noe som krever behandling som er rettet mot molekylære egenskaper som er felles for de undergrupper av sykdommen. Høy grad av serøs eggstokkreft (HG-SOC) står for et flertall av sykdomsrelaterte dødsfall. Mens responsrater er høy til platina-taxan basert adjuvant kjemoterapi, har det vært liten bedring i pasientens overlevelse i løpet av det siste tiåret eller mer, til tross for omfattende klinisk undersøkelse [2]. PARP-inhibitorer som utnytter svakheter i homolog rekombinasjon reparasjon [3], [4] har vist betydelige løftet, spesielt hos kvinner med germline
BRCA1
eller
BRCA2
mutasjoner. HG-SOC er for tiden behandlet som en enkelt enhet. En dypere forståelse av molekylære driverne av denne sykdommen er avgjørende hvis mer effektive behandlingsformer skal utvikles [2]. Nylig, genekspresjon profilering avslørt lite verdsatt mangfold innen HG-SOC ved opptegning fire forskjellige molekylære subtyper. En undergruppe (C1) ble definert av en reaktiv stroma signatur, å korrelere med omfattende desmoplasia i slike prøver. Svulster med C2 signaturen var preget av intra-svulst infiltrasjon av immunceller, mens C4 svulster hadde en relativt lav uttrykk for stromale gener og høye nivåer av sirkulerende CA125. C5 subtype reflekterte en mesenchymale celle genuttrykk signatur, og disse svulstene hadde sparsom immun celle infiltrasjon og var assosiert med lave nivåer av sirkulerende CA125 [5]. De genetiske hendelser som gir opphav til hver molekylær subtype av HG-SOC og kontrollere deres kliniske atferd er foreløpig ukjent.
La-7
s er en familie på tolv sekvens relaterte mikro (mi ) RNA fordelt over åtte genomiske klynger som ofte nedregulert i kreft [6], [7], [8].
La-7
har dukket opp som en del av en kompleks og viktig regulerende nettverk i kreft, som redusert uttrykk fører til re-uttrykk for en rekke onkoføtal proteiner [6], [9]. Som med andre mirnas,
La-7
molekyler gjenkjenner og binder seg til sine mål-sekvenser, noe som resulterer i både translatorisk undertrykkelse og mRNA-forfall [10], [11], [12]. På cellenivå,
La-7
har omfattende effekter på differensiering og selvfornyelse [13].
HMGA2
genet er et mye preget målet for
La-7
familie av miRNAs [6], [9], [11], [14] og koder for et DNA-bindende og kromatin modifisere protein som regulerer både differensiering og stamcelle fornyelse [15]. Ekspresjon i høyt nivå av HMGA2 har også vært knyttet til dårlig resultat i en rekke faste cancere, inkludert kreft i eggstokkene [16]. Balansen mellom
HMGA2 Hotell og
La-7
uttrykket har vært knyttet til vedlikehold av en udifferensiert tilstand i kreftceller [9], [14]. En negativ feedback loop som involverer høyt nivå uttrykk for
La-7
repressors,
LIN28 Hotell og
LIN28B
, har vært assosiert med flere maligniteter [14], [17 ], [18]. De onkogener c-myc og N-myc er positive regulatorer av
LIN28 Hotell og
LIN28B
henholdsvis [19], [20]. Derfor deregulering av ulike sider ved en sti som involverer MYC proteiner,
La-7
repressors
LIN28 Kjøpe og
LIN28B
, ulike
Let-7
alleler og onkoføtal mål som
HMGA2
har blitt rapportert i en rekke kreftformer.
Vi har benyttet genomisk datasett fra over 900 HG-SOC å tyde trasé som styrer denne sykdommen. Vi viser at C5 subtype av HG-SOC er definert av
Let7 Hotell og
MYCN
de-regulering, presentere en ny mulighet for målrettet terapeutisk intervensjon i eggstokkreft.
metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av Human Forskningsetiske etiske~~POS=HEADCOMP komiteer på Peter MacCallum Cancer Centre, Queensland Institute of Medical Research, University of Melbourne og alle deltakende sykehus. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne i denne studien.
Genomisk datasett
Microarray genuttrykk data er innhentet fra fire kohorter, referert til som AOCS, TCGA, NCI og Norge. Den AOCS datasettet (n = 285) ble generert ved hjelp av Affymetrix U133 2,0 matriser og er tilgjengelig på Gene Expression Omnibus (GEO). Kreft Genome Atlas datasett (TCGA, n = 476) ble generert ved hjelp av Affymetrix HTHGU133a arrays, og innhentet gjennom TCGA data portal. NCI datasettet (n = 185) ble generert på Affymetrix U133a arrays og hentet fra Michael Birrer, Massachusetts General Hospital. Det Norge datasett [21], [22] (n = 64) ble generert ved hjelp av tilpassede cDNA arrays og innhentet gjennom laboratoriet av en av oss (A.H.). Kliniske detaljer for hver datasettet er oppsummert i tabell S1.
Pasienter og prøver
Prøver for immunhistokjemi og RNA valideringsstudier ble hentet fra den australske Ovarian Cancer Study (AOCS), en populasjonsbasert kohort av kvinner med ovarialcancer rekruttert mellom 2002-2006 [5]. Alle pasienter signert en institusjonelt godkjent pasientinformasjon og samtykkedokument. Detaljer om prosesser for pasienten periodisering, samling av klinisk oppfølging informasjon, patologisk vurdering, isolering av nukleinsyrer, og utarbeidelse av microarray er beskrevet tidligere [5].
bioinformatiske analyser
En detaljert beskrivelse av multippel bioinformatiske analyser som brukes i denne rapporten er gitt i supplerende metoder S1.
kvantitativ real-time polymerase chain reaction (Q-RT-PCR)
Måling av uttrykket av gener ble utført som tidligere beskrevet [23], ved bruk av enten TaqMan genekspresjon assays (Applied Biosystems) eller SYBR grønn (Applied Biosystems). PCR-amplifikasjon ble utført i triplikat for hver prøve. Endogene kontroller
HPRT1 Hotell og
ACTB
ble inkludert for alle analyser og relativ kvantifisering av mRNA uttrykk ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [24]. Uttrykket av modne miRNAs for
La-7
lene ble bestemt ved hjelp av en TaqMan miRNA analyse (Applied Biosystems) etter produsentens anvisninger. Ytterligere detaljer, inkludert primere og syklustider, er gitt i supplerende metoder S1.
Immunohistochemistry og fluorescens in situ hybridisering
HMGA2 protein uttrykk ble målt i HG-SOC prøver på en vev microarray (n = 127), som beskrevet i Methods Tilsetnings S1. Scoring var som følger: 0 – ingen /svak eller moderat atom uttrykk, 1 – mindre enn 10% tumorceller med sterk nukleær farging, 2 – 10-50% tumorceller med sterke kjernefarging, 3 – mer enn 50% tumorceller med sterke kjerne farging. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) for bakteriell kunstig kromosom (BAC) sonder til meta kjerner ble som tidligere beskrevet [17].
Funksjonelle analyser i cellelinjer
knockdown (KD) til målet mRNA ble oppnådd ved hjelp Dharmacon On-Target Plus Smartpools (Dharmacon, Thermo-Scientific) for alle gener unntatt
MYCN
, som ble rettet ved hjelp av Qiagen siRNA Hs_MYCN_3 (Qiagen). Kontroller inkludert Dharmafect1 alene, Dharmacon ikke stanse kontroll basseng,
GAPDH
smartpool, og All-Stars negativ kontroll (Qiagen) for
MYCN
analyser. Detaljer om cellekultur og KD transfeksjonsteknologier vilkår er gitt i supplerende metoder S1.
Resultater
Molecular subtyper av HG-SOC
Vi har utviklet en klassifikator basert på de molekylære subtyper (C1, C2, C4, C5) identifisert i vår tidligere studie av 215 svulster fra den australske Ovarian Cancer Study (AOCS) [5]. Ved hjelp klassifikator og en overvåket læringsprosedyre, ble prøvene delt inn i en av de fire molekylære subtyper i datasett fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) (n = 476), Norge (n = 64) [21], [22] og National Cancer Institute (n = 185) [25] (figur 1A, Tabell S1). Konsistente mønstre av genekspresjon og klinisk resultat ble observert på tvers av datasett. C5-tumorer ble konsistent assosiert med dårlig resultat sammenlignet med C2 subtype (figur 1 B-D). Vi merker oss at det var noe variasjon i den relative hyppigheten av de molekylære undergrupper i de ulike datasett og dette kan ha sammenheng med forskjeller i inklusjonskriteriene som brukes i hver studie.
(A) Heatmap av genuttrykk data tatt fra AOCS, TCGA, NCI og Norge datasett viser at svulster er klassifisert i 4 molekylære undergrupper. Gener er gruppert etter Pearson korrelasjon og prøvene er bestilt av molekylær subtype. Mens den opprinnelige k-means fra Tothill et al. er vist for AOCS årsklasse, ble en veiledet læring prosedyre som brukes for klassifisering av svulster i andre datasett (se utfyllende metoder S1). (B) Kaplan-Meier-overlevelseskurver for prøver er plottet. Total overlevelse blir anvendt som sluttpunkt i alle fire datasett. Cox proporsjonal fare modell blir brukt til å beregne statistisk signifikans av forskjell i overlevelse mellom alle fire grupper. Log-rank test p-verdi er rapportert. (C) Prøver fra alle datasett ble kombinert for å estimere overlevelsesegenskaper. Undertyper, ble sammenlignet til C5, og log rank test p-verdien som er gitt i tabellen. (D) Kaplan-Meier-kurver er plottet å skildre overlevelsesfunksjonen av prøver i de fire forskjellige undergrupper etter å kombinere prøvene.
HMGA2 over-uttrykk og La-7 nedregule
For å identifisere subtype-spesifikke trasé vi fokusert på C5 svulster, som er preget av redusert sirkulerende CA125 immunoreaktivitets, begrenset immun celle infiltrasjon, en udifferensiert fenotype [5], og dårlig samlet pasient overlevelse (figur 1B).
HMGA2
er sterkest i løpet uttrykt C5-spesifikke genet (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, NCI p 0,0001, to-sidig Mann-Whitney test; figur 2A, Tabell S2). Andre markører for en udifferensiert fenotype som er svært C5-spesifikke inkluderer
DACH1
,
PAX2
,
LAMA1
,
MYCN
,
SOX11
, samt høy mobilitet gruppemedlemmene
TOX Hotell og
TCF7L1
.
La-7
målgener, inkludert
HMGA2
er spesielt deregulert i C5 molekylær subtype av høy klasse serøs kreft. (A) mRNA uttrykk for
HMGA2
er betydelig høyere i C5 molekylær subtype. (B) Immunhistokjemisk analyse av HMGA2 uttrykk i eggstokkreft prøver viser konsistent over-uttrykk i C5 svulster. Eksempel på sterk (3+) farging (øverst) og ingen farging (nederst) panel. (C) En kjerne sett av
La-7
regulerte målgener (onkoføtal gener) identifisert ved Boyerinas et al [6] er overrepresentert i C5 gen signatur. (D)
La-7
målgener hentet fra TargetScan5.0 er anriket i C5 svulster. Betydningen av overlapping mellom C5-spesifikk og
La-7
målgenet settene ble bestemt ved ensidig Fishers eksakte test. Bar plott som viser sammenhengen er vist. (* Indikerer p 0,0001)
Immunhistokjemisk analyse viste også at C5 svulster konsekvent uttrykke høye nivåer av HMGA2 protein (~95% på 3+,. P = 0,02, to-sidig Fishers eksakte test, figur 2B og Tabell S3). På proteinnivået, sterkt uttrykkende tumorer var også til stede i andre undertyper, om enn på et lavere frekvens. Disse funnene tyder på at en bestemt mekanisme for å regulere
HMGA2
mRNA uttrykk eller stabilitet opererer hovedsakelig i C5 svulster, og at post-transkripsjonsmekanismer kan påvirke HMGA2 protein uttrykk i andre undergrupper.
HMGA2
forsterkning var mer vanlig i C5 svulster (p = 0,005, Mann-Whitney test; Tabell S4). Dette kan imidlertid ikke gjøre rede for flertallet av prøvene viser C5-spesifikke over-uttrykk, som
HMGA2
er betydelig uttrykt i C5 prøver uten forsterkning av
HMGA2
locus (figur S1). Derfor, mens
HMGA2
forsterkning er mer vanlig i C5 svulster, forsterkning-uavhengig mekanisme (e) må redegjøre for C5-spesifikke overuttrykk av mRNA og protein.
HMGA2
er den mest spådd målet for
La-7
familie av mikroRNA (miRNA) i genomet [6], [9], [11], [14], noe som tyder på redusert
Let -7
uttrykk som et alternativ forklaring på mønsteret av
HMGA2
uttrykk i C5 svulster. I samsvar med dette, observerte vi C5-spesifikke overuttrykk av andre genet normalt trykt av
La-7
, inkludert en kjerne sett av tolv onkoføtal gener som er definert av Boyerinas
et al.
[6 ] (Figur 2C; p = 4,8 × 10
-8, to-sidig Fishers eksakte test). En uavhengig avledet genet sett av 100 mest høyt rangert
La-7
målgener beregnet med en miRNA mål prediksjon modell [26] ble også betydelig anriket i C5 subtype (p 0,0001, ensidig Fishers eksakte test) (figur 2D).
Vi deretter målt direkte uttrykk for
La-7
familie i AOCS prøver ved hjelp av en TaqMan analysen og sammenlignet resultatene med miRNA microarray data fra TCGA datasett. Vi fant ut at
La-7b
,
-7d
, og
-7i
var betraktelig i uttrykt i C5 svulster sammenlignet med andre undertyper i både AOCS og TCGA kohorter ( tabell 1).
La-7c
,
-7e Hotell og
-7F
ble også betraktelig i uttrykt i C5 i enten TCGA eller AOCS datasett. Forskjellen mellom de to kohortene med disse alleler kan relateres til følsomhet for analysen plattformen som brukes, miRNA mikromatriser for TCGA og TAQMAN analyser for de AOCS prøver.
Deregulering av Let-7
Vi har utforsket mulige årsaker til lav-nivå uttrykk for
Let-7
alleler. Genomiske slettinger, analysert av SNP-baserte arrays i TCGA datasettet, viste at tap involverer kromosom regionen 22q13.31, som omfatter
La-7b Hotell og
La-7a3
, var mer vanlig i C5 svulster (p = 0,018) (tabell S5). Selv om tap av 22q13.31 kan forklare redusert uttrykk for
La-7b
i enkelte svulster, ville det ikke hensyn til effektene observert med andre
La-7
alleler, som er fordelt over 8 loci og er mer sannsynlig å bli de-regulert i
trans
. Defekter i miRNA behandling maskiner, inkludert reduserte nivåer av dicer (
DICER1
) og drosha (
RNASEN
), har vært knyttet til dårlig utfall i HG-SOC [27], men høyere uttrykk av
DICER1
ble observert i C5 subtype (figur S2).
DICER1
nivåer har vist seg å være negativt regulert av
La-7b product: [28], [29] en mulig forklaring på den C5-spesifikke over-uttrykk for
DICER1
.
Lin28 og Lin28B negativt regulere
La-7
nivåer ved å binde seg til terminalen ledd av forløperne til
La-7
familie miRNA, og dermed blokkerer behandling i modne miRNAs [17], [30], [31], [32]. Vi fant at uttrykket av
LIN28B
, men ikke
LIN28
ble høyanriket i C5 svulster (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, to-sidig Mann Whitney test, figur 3A og Figur S2). Trans mellom
HACE1 Hotell og
LIN28B
har blitt foreslått å resultere i de-regulering av
LIN28B Hotell og resultere i lavere
Let-7
nivåer [17 ]. FISH på en TMA av 239 ovarietumorer, inkludert 73 av kjent molekyl subtype funnet bevis for omorganisering mellom
HACE1 Hotell og
LIN28B
i bare en enkelt kjerne fra en HG-SOC svulst med ukjent molekylære subtype (Tabell S6), noe som tyder på denne mekanismen for
LIN28B
oppregulering er sjelden i ovarialcancer.
(A) boksplott skildre differensial uttrykk for
LIN28B Hotell og
MYCN
i ulike molekylære undergrupper av serøs eggstokkreft AOCS datasett. (B) DNA kopiantall nivåer og uttrykk nivåer av
MYCN
er sterkt korrelert. C5 prøver (kodet i rødt) er hovedsakelig fordelt i øvre høyre hjørne av tomten. Prøver med segmentert kopinummerlogg forhold større enn 0,3 ble ansett for å ha en gevinst på
MYCN Hotell og prøver med segmentert log ratio mindre enn -0,3 ble ansett for å ha et tap. Fishers eksakte test ble brukt for å beregne statistisk signifikans av foreningen. (C) Association mellom
MYCN
mål og C5 gensettene.
MYCN
mål ble ekstrapolert fra skjæringspunktet mellom to gen lister (1) gener som er bundet av N-myc i mus embryonale cellelinjer og (2) gener med to gangers økning i uttrykket etter transfeksjon av N-myc i mus embryonale celler (se utfyllende metoder S1). Ved hjelp av data fra AOCS eller TCGA genuttrykk setter gener ble klassifisert som høy eller lav i C5 tumorer versus alle andre svulster (C1-C4) på p 0,001 ved tosidig t-test. Betydningen av overlapping mellom C5 gensettene og
MYCN
gensettene ble bestemt av en ensidig Fishers eksakte test. Bar plott som viser sammenhengen er vist.
Deregulering av
MYCN
Nylig har både c-myc og N-myc har vist seg å positivt regulere
LIN28 Hotell og
LIN28B
uttrykk [19], [20], men vi fant ingen forskjell i uttrykk for
MYC
mellom C5 og ikke-C5 svulster. Interessant, gevinst på
MYC
var mer vanlig i ikke-C5 svulster (p 0,01) (Tabell S4). I motsetning
MYCN
ble betydelig uttrykt i C5 svulster (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, to-sidig Mann Whitney test, figur 3A). I TCGA datasett der både eksemplar nummer og uttrykk data var tilgjengelige,
MYCN
kopiere nummer gevinst ble høyanriket i C5 subtype (p 0,0001, to-sidig Mann-Whitney test, figur 3B). Mens det var en signifikant sammenheng mellom
MYCN
kopiere nummer og genuttrykk, noen C5 prøve etter uttrykt
MYCN
uten genamplifisering, noe som tyder på andre mekanismer av subtype spesifikk regulering. Ytterligere bevis av N-Myc-aktivitet ble oppnådd ved å undersøke ekspresjon av kjente målgener i AOCS og TCGA kullene [33]. I begge datasett ble det observert en betydelig anrikning i ekspresjon av N-myc målgener i C5-tumorer (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, ensidig Fishers eksakte test, figur 3C), inkludert trans-aktivering av
LIN28B
.
MYCN Hotell og
HMGA2
uttrykk ble også sterkt signifikant korrelert (Figur S3). Vi observerte svært spesifikke deregulering av enkelte medlemmer av
MYCN-Lin28B-Let7
veien i C5 svulster, samt et bredere sett av
MYCN Hotell og
Let7
transkripsjons mål . For å forstå i hvilken grad den
Let7
vei definerer C5 svulster, brukte vi en nylig beskrevet signalveien konsekvensanalyse (SPIA) [34] for å sondere andre signalveien avhengigheter. Blant 87 signalveier testet,
Let7
var den mest betydelig regulert vei i C5 tumorer (Tabell S7). Signatur gener for alle undergrupper er presentert i tabell S8.
Funksjonell analyse av spredningsveier foreninger
For å utforske den funksjonelle betydningen av våre funn i primære svulster, vi søkte genomiske data fra 40 eggstokkcellelinjer. A2780 og CH1 tilnærmes C5 svulster tettest, som begge uttrykte lave nivåer av
La-7
alleler, og høye nivåer av
HMGA2 Hotell og
LIN28B plakater (figur S4A, S4B ). Imidlertid uttrykte bare CH1
MYCN
, verken linjen viste forsterkning av
MYCN
locus, og begge sterkt uttrykt
LIN28
, den paralogue av
LIN28B
(Figur S4B, S4C). Etter systematisk knock-down av
LIN28
,
LIN28B Hotell og
MYCN
vi overvåket uttrykk for
Let-7
alleler. I både A2780 og CH1 celler, kombinert siRNA knock-down (KD) av begge
LIN28 Hotell og
LIN28B
resulterte i oppregulering av praktisk talt alt la-syv familiemedlemmer (figur s5a-B ), i samsvar med tidligere rapporter [17], [31]. KD av
LIN28B
var generelt ikke så stor som
LIN28 plakater (maksimalt oppnådde 70% KD, sammenlignet med 90% KD) og var assosiert med mindre innvirkning på
La-7
uttrykk. Legg spesielt merke
La-7
oppregulering etter
LIN28 /LIN28B
KD var ikke umiddelbar; til tross for
LIN28 Hotell og
LIN28B
mRNA undertrykkes innen 48 timer,
La-7
oppregulering var ikke oppdages før 96 timer. KD på
MYCN
RNA var vanskelig å oppnå (supplerende metoder S1) i CH1-cellelinjen. I beste fall en reduksjon på 60% mRNA uttrykk ble oppnådd (figur S5b) og liten effekt på
LIN28B
eller
La-7 ble observert
uttrykk. Verken KD av
LIN28
,
LIN28B
, eller
MYCN
hatt en betydelig effekt på HMGA2 protein eller mRNA uttrykk (figur S5C). Men som observert hos noen C5 svulster, CH1 celler har forsterkning av
HMGA2 plakater (figur S4B), noe som tyder på denne cellelinjen har en alternativ mekanisme HMGA2 over-uttrykk.
Diskusjoner
en omfattende serie av gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter i cellelinjer har vist en funksjonell interaksjon mellom N-myc og Lin28B [20]; Lin28B og la-7 [17], [30], [31], [32]; og la-7 og HMGA2 og andre onkoføtal-proteiner [6]. Her har vi vist at hver bane element er spesifikt uttrykt på en måte som ville forklare den dyp over-ekspresjon av HMGA2 og andre onkoføtal-proteiner i en stor andel av C5-tumorer (figur 4, tabell S9). Få eller over-uttrykk for
MYCN
har ikke tidligere vært forbundet med serøs eggstokkreft. Mens en grad av forsterkning er ikke så høy som vanligvis er beskrevet i neuroblastom [35], finner vi betydelig over-ekspresjon av N-myc målgener i C5 tumorer som støtter visning det er funksjonelt aktiv. Nyere data viser at selv lave nivå kopiantall gevinst på
MYCN
kan betydelig påvirke pasientens utfall i medulloblastoma [36].
MYCN
overuttrykk var svært C5-spesifikke og mekanismer i tillegg til forsterkning vil trolig bidra til dette
Hver hendelse er betydelig anriket i C5 versus ikke-C5 høy klasse serøs svulster.:
MYCN
forsterkning p 0,0001;
MYCN
over-uttrykk p 0,0001; over-uttrykk
MYCN
rettet p 0,0001;
LIN28B
over-uttrykk p 0,0001; under-uttrykket
La-7
alleler p 0,01 til 0,0001;
HMGA2
forsterkning p 0,001,
HMGA2
over-uttrykk p 0,0001 (TCGA data). Kumulativt tap av Let-7b, og /eller gevinst på HMGA2, og /eller gevinst på MYCN oppstå i 77,8% av prøvene i C5 subtype (p 0,0001, tosidig Fishers eksakte test; Tabell S4).
Det er sannsynlig at flere mekanismer føre til
HMGA2
subtype bestemt uttrykk inkludert
MYCN
forsterkning, tap av spesifikk
La-7
alleler inkludert
Let -7b
, og forsterkning av
HMGA2
selv. For eksempel, i CH1 celler
LIN28 Hotell og
LIN28B
er begge over uttrykk og undertrykke
La-7
uttrykk, men disse cellene viser også
HMGA2
forsterkning. Vi har også funnet en signifikant sammenheng mellom C5 molekylære fenotype og tap av
La-7b
. Uttrykket av
La-7b
ble redusert i begge AOCS og TCGA datasett, og det er verdt å merke seg at blant
La-7
alleler,
La-7b
har vært tidligere rapportert som i henhold til uttrykk i HG-SOC [37]. Selv om de ulike alleler av
La-7
synes å målrette svært like sekvenser, tilstedeværelsen av flere uavhengige gener, deres differensial uttrykk under utvikling [7] og våre data antyder de utfører selektive roller.
den over-uttrykk for
MYCN Hotell og
Let-7
mål i C5 svulster legger vekt på den funksjonelle betydningen av forsterkning og over-uttrykk for
MYCN
og betydelig reduksjon i uttrykket av
Let-7
alleler. Knockdown av
LIN28 Hotell og
LIN28B
uttrykk resulterte i re-uttrykk for
La-7
gi ytterligere bevis for en kjede av interaksjoner i ovarietumorer. Men andre etablerte interaksjoner ble ikke observert i eggstokkreft cellelinjene som ble testet her. Selv om for eksempel
HMGA2
er et veldefinert mål av
La-7 product: [6], både i gevinst og tap-av-funksjon eksperimenter, restaurering av
La-7
uttrykk ikke merkbart påvirke
HMGA2
uttrykk. Disse funnene kan forklares med begrenset eksperimentell undertrykkelse av
LIN28B Hotell og
MYCN
, det faktum at verken CH1 eller A2780 cellelinjer trofast phenocopy alle de molekylære defekter sett C5 svulster, og forsterkning av
HMGA2
i CH1 celler. Vi merker oss også at
La-7
uttrykk ble restaurert bare etter en lengre periode (96 h) av siRNA-mediert knockdown av
LIN28 Hotell og
LIN28B
, noe som tyder på at det er vanskelig å gjenoppta veien når det har blitt nedregulert. Ytterligere validering av våre funn vil kreve cellelinjer avledet fra C5-svulster som nærmere deler de molekylære egenskaper av deres primære motstykker.
Selv om elementene i denne reaksjonsvei er tidligere blitt vist å være de-regulert i ovarialkreft [37 ], [38], er vår rapport den første til å vise fullstendig sti avbrudd og sin tilknytning til en bestemt subtype av HG-SOC. Vår analyse viser at
La-7
veien er unikt fremtredende blant signaliserer hendelser forstyrret i C5 svulster, og ser ut til å forme sin transkripsjonen profil. Identifiseringen av molekyl subtyper av brystkreft [39], [40] og visse hematologiske kreftformer som diffus stor B-celle lymfom [41], [42], [43] har gitt kraftig startpunkter for å oppdage undertypespesifikke bilførere sykdom. Samtidig nedregulering av
La-7 Hotell og utvidet
HMGA2
uttrykk resulterer i mindre differensierte svulster med stamcellelignende egenskaper [6], [9], [13], [14], [15]. Disse observasjonene stemmer overens med den lave ekspresjon av differensieringsmarkører i C5-tumorer [5], inkludert
MUC16
, målet for CA125 antistoffet anvendt klinisk for eggstokkreft diagnose og prognose. Vårt arbeid for første gang, definerer en bane i HG-SOC som er forbundet med og ser ut til å drive biologisk og klinisk virkemåten til en tydelig molekyl subtype av eggstokkreft, noe som tyder på en målrettet terapeutisk tilnærming i denne gruppen av pasienter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
HMGA2 genet er signifikant oppregulert i C5 svulster fra TCGA. (A) mRNA uttrykk for
HMGA2
basert på alle prøver fra TCGA (B) HMGA2 er over-uttrykt i prøvene uten forsterkning av HMGA2 locus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0018064.s001
(TIF)
Figur S2.
Ekspresjon av et antall C5-spesifikke gener, målt ved hjelp av QRT-PCR. Dette gjøres for å validere microarray uttrykket data fra AOCS kohort. Boksplott som viser forholdet mellom uttrykk nivåer av disse genene og molekylær subtype (C5 eller Non-C5) vises, p-verdier er beregnet ut Wilcox på rank sum test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0018064.s002
(TIF)
Figur S3.
HMGA2 og MYCN uttrykk nivåer. (A) HMGA2 og MYCN uttrykk nivåer er korrelert i TCGA prøver.
