Abstract
Androgen ablasjon terapi er den primære behandling for metastatisk prostatakreft. Imidlertid 80-90% av pasientene som mottar androgen ablasjon til slutt utvikle tilbakevendende tumorer i 12-33 måneder etter behandling med en median total overlevelse tid på 1-2 år etter tilbakefall. LNCaP er et vanlig cellelinje etablert fra et menneske lymfeknute metastatisk svulst i prostata adenokarsinom. Vi har tidligere etablert to tilbakefall androgen reseptor (AR) rik androgen-uavhengig LNCaP underlinjer 104-R1 (androgen utarmet for 12 måneder) og 104-R2 celler (androgen utarmet for 24 måneder) fra AR-positive androgen-avhengige LNCaP 104-S celler. LNCaP 104-R1 og 104-R2 ligner AR-positive hormon-ildfast residiverende svulster hos pasienter som får androgen ablasjon terapi. Androgen behandling stimulerer spredning av 104-S-celler, men fører til veksthemming og G1 cellesyklus arrest i 104-R1 og 104-R2 celler. Vi undersøkte protein uttrykk profilen forskjell mellom LNCaP 104-S vs. LNCaP 104-R1, 104-R2, PC-3 og DU-145 celler samt undersøkt følsomheten av disse prostata kreft celler til forskjellige cytostatika og lite molekyl inhibitorer. Sammenlignet med 104-S-celler, 104-R1 og 104-R2-celler uttrykker høyere nivåer av protein av AR, PSA, c-Myc, Skp2, BCL-2, P53, p-MDM2 S166, Rb, og p-Rb S807 /811 . Den 104-R1 og R2 104-celler uttrykker høyere andel av p-Akt S473 /Akt, p-EGFR /EGFR, og p-Src /Src, men lavere forhold av p-ERK /ERK enn 104-S-celler. PC-3 og DU-145 celler uttrykker høyere c-myc, Skp2, Akt, akt1, og fosfor-EGFR men mindre fosfor-Akt og fosfor-ERK. Overekspresjon av Skp2 økt motstand av LNCaP celler til kjemoterapi narkotika. Paclitaxel, androgen, og hemmere for PI3K /Akt, EGFR, Src, eller BCL-2 ser ut til å være potensielle muligheter for behandling av avansert prostatakreft. Vår undersøkelse gir begrunnelsen for målretting Akt, EGFR, Src, Bcl-2, og AR signale som behandling for AR-positive tilbakefall prostatakreft etter hormonbehandling.
relasjon: Lin H-P, Lin C-Y, Hsiao P-H, Wang H-D, Sheng Jiang S, Hsu J-M et al. (2013) Forskjell i Protein Expression profil og kjemoterapi narkotika Response av ulike Progresjon stadier av LNCaP underlinjer og andre menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (12): e82625. doi: 10,1371 /journal.pone.0082625
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 16 juli 2013; Godkjent: 25 oktober 2013; Publisert: 05.12.2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd CS-101-PP-14 og CS-102-PP-14 (National Health Research Institutes), NSC 99-2320-B-400-015-My3 og NSC 101-2325-B-400-014 ( National Science Council), og DOH101-TD-C-111-004 (Department of Health) fra Taiwan for CPC og DOH102-TD-M-111-102001 (Department of Health, Taiwan) for HJK. CYL støttes av DOH101-TD-C-111-004. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Tilsvarende forfatter Dr. Chih-Pin Chuu er en PLoS ONE Editorial styremedlem, men bekrefter vi at dette ikke endrer vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ifølge den nyeste statistikken i 2008 (GLOBOCAN 2008 database, versjon 1.2 ), er prostatakreft den nest hyppigst diagnostisert kreft i menn og den femte vanligste kreft sammenlagt i verden. Statistikken av American Cancer Society anslår at 238,590 nye tilfeller av prostatakreft vil bli diagnostisert og ca 29 720 mennesker vil dø av prostatakreft spesifikke dødsfall i USA i 2013. Forekomst av prostatakreft øker stadig i nesten alle land [1]. Prostatakreft er diagnostisert i svært få mennesker yngre enn 50 år. Omtrent 85% av pasientene blir diagnostisert er over 65 år gammel [1]. Kirurgi er ofte vellykket for organ-begrenset prostatakreft. Androgen ablasjon terapi, foreslått av Dr. Charles B. Huggins, er den primære behandling for metastatisk prostatakreft. Imidlertid vil de fleste prostatakreftpasienter androgen ablasjon terapi til slutt utvikle tilbakevendende, kastrering-resistente svulster innen 1-3 år etter behandling med en median total overlevelse på 1-2 år etter tilbakefall [2,3]. Det finnes ingen effektiv standardbehandling for tilbakefall avanserte prostatakreft. Kjemoterapi er vanligvis brukes til behandling av metastatisk hormon-refraktær prostatakreft [4]. Vanlig brukte cellegifter for prostatakreft inkluderer etoposid, paclitaxel, vinblastin, og mitoksantron. Etoposid og mitoxantron er type II topoisomerase-inhibitorer [4,5]. Vinblastine binder tubulin og hemmer dannelsen av mikrotubuli [4]. Paclitaxel forstyrrer mitotisk spindelenheten, kromosom segregering, og celledeling. Paclitaxel stabiliserer også microtubule polymer og beskytter den mot demontering [4]. Kjemoterapi narkotika behandlinger føre til reduksjon av PSA, radiografisk respons, forbedring av smerte og bedring av urin symptomer i en undergruppe av pasienter [4]. Men disse medikamentene viser liten effekt på å forlenge overlevelse [4]. Uønskede bivirkninger av disse kjemoterapeutika inkludere giftige dødsfall, slag, trombose, nøytropeni, ødem, dyspné, sykdomsfølelse og tretthet [4]. Alternativ behandling er i nød.
LNCaP er et vanlig cellelinje etablert fra et menneske lymfeknute metastatisk svulst i prostata adenokarsinom [6]. LNCaP celler uttrykker androgen reseptor (AR) og prostataspesifikt antigen (PSA). Tidligere dyrket vi androgen-sensitive LNCaP 104-S-celler i androgen fattige forhold
in vitro
å etterligne pasienter som får androgen ablasjon terapi [7-9]. De fleste 104-S-celler døde etter 3 måneder. En liten populasjon av celler kalt 104-R1 dukket opp etter 10 måneder. Disse cellene prolifererer regelmessig i fravær av androgen [7-9]. Atten-tjue måneder etter androgen utarming, 104-R1 cellene ga opphav til en raskere voksende befolkning av celler som kalles 104-R2 celler [7-9]. Under overgangen fra 104-S-celler i 104-R1 og R2 104-celler, mRNA-ekspresjon, protein overflod, og transkripsjonelle aktivitet av AR øke flere folder [7-14]. Spredning av 104-R1 og R2 104-celler er androgen-uavhengige, men blir undertrykket ved fysiologiske konsentrasjoner av androgen [7-9,11-14]. Androgen behandling undertrykker c-myc og Skp2, og dermed fører til G1 cellesyklus arrest i 104-R1 og 104-R2 celler. Våre LNCaP prostata kreft progresjon modell ligner kliniske situasjoner der AR-positive prostatakreft gjentas etter androgen deprivasjon [13,15,16]. PC-3 og DU-145 celler tilhører NCI60 og var AR-negative prostatakreftceller etablert fra human prostata adenokarsinom metastatisk til bein [17] og hjernen [18], henholdsvis. Vi har således benyttet LNCaP progresjon modell, PC-3 og DU-145-celler i denne studien for å karakterisere forskjellen av proteinekspresjon profil mellom androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostata kreftcelle. Vi undersøkte profilen til 33 forskjellige proteiner involvert i cellesyklusregulering, celleoverlevelse, Akt signalisering, og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signalering i 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3 og DU-145 celler. Vi sammenlignet også den forskjell i følsomheten av disse prostatakreftceller for behandling med flere cytostatika og lavmolekylære inhibitorer for å bestemme hvilken medikament eller inhibitor er mer effektive til å undertrykke proliferasjonen av avansert prostatakreftceller. Våre observasjoner foreslått at Akt, EGFR, Src, Bcl-2, og AR signalveier er potensielle terapeutiske mål for AR-positive kastreringsresistent prostatakreft.
Materialer og metoder
Cell Kultur
LNCaP prostatakreft celleunderlinjer (104-S, 104-R1, og 104-R2-celler) og PC-3 var gaver fra Dr. Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, USA). LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2 celler ble samlet inn LNCaP FGC klone (ATCC CRL-1740). Disse LNCaP underlinjer og PC-tre cellene er blitt beskrevet i tidligere publikasjoner [7-12,14,19-24]. DU-145 celler ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (Hsinchu City, Taiwan). Disse cellelinjer ble passert, og opprettholdt som tidligere beskrevet [7-12,14,19-24]. R1881 (17β-hydroxy-17α-metylestra-4,9,11-trien-3-on) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Kjemi
EGFR-hemmer Gefitinib (Iressa, ZD-1839) og Src inhibitor Saracatinib (AZD0530) ble kjøpt fra Selleckchem (Houston, Texas, USA). BCL-2-hemmer ABT 737 (CAS 852808-04-9) ble kjøpt fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Andre forbindelser ble kjøpt fra Sigma.
Cell Proliferation Assay
Relativ celle nummer ble analysert ved å måle DNA innhold av cellelysatene med fluorescerende fargestoff Hoechst 33258 (Sigma) som beskrevet tidligere [10,14 , 19,20,22-25]. Middelverdien og standardavvik representerte gjennomsnittet av octuplicate (8 brønner) av et representativt eksperiment.
flowcytometrisk analyse
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5-celler i 10-cm skåler i 10 ml media i 24 timer. Etter 96 timer i kultur i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av androgen, ble cellene fjernet med trypsin og fiksert i 70% etanol i PBS over natten ved -20 ° C. Fikserte celler ble vasket med PBS, ble behandlet med 0,1 mg /ml RNase A i PBS i 30 minutter, og deretter suspendert i 50 ug /ml propidiumjodid i PBS. Cellesykkelprofiler og fordelinger ble bestemt ved flowcytometrisk analyse av celler ved hjelp av en BD FACScan flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Cellesyklus distribusjon ble analysert ved hjelp av ModFit LT programvare (Verity Software House, Topsham, ME, USA) som beskrevet [8,9,14,20,22,23,25].
Real-Time Kvantitativ Polymerase Chain reaksjon
RNA ble isolert og spesifikke mRNA ble kvantifisert som beskrevet [10-12,19,21,26]. Sekvensene til primere og prober for androgenreseptoren (AR) og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble beskrevet tidligere [9,12,26]. Primer og probe sekvenser brukes for PSA kvantifisering ble beskrevet av Gelmini et al [27]. Alle transkripsjonsnivåer ble normalisert til GAPDH nivåer i hver prøve.
Western blotting analyse
Celler prøver ble lysert i SDS lysis buffer (240 mM Tris-acetat, 1% SDS, 1% glyserol, 5 mM EDTA pH 8,0, 0,1 mM ditiotreitol) inneholdende proteaseinhibitorer 1 mM 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl-fluorid (AEBSF), 0,8 uM aprotinin, 40 μMbestatin, 14 pM E-64, 20 uM leupeptin, 15 pm pepstatin A (Sigma -Aldrich, P8340) og fosfatase hemmere cantharidin, bromotetramisole og mikrocystin LR (Sigma-Aldrich, P2850). Proteiner ble separert på 8-12% SDS-PAGE-geler og uttrykk nivåer av proteiner ble bestemt ved Western blotting ved hjelp av følgende antistoffer: akt2, β-aktin og GAPDH var fra Novus (Littleton, CO, USA). Total Akt, fosfo-Akt Ser473, fosfo-Akt Thr308, phodpho-p42 /44 MAPK-Thr202 /Tyr204, EGFR, p-MDM2, p53, Src, fosfo-Src Tyr527, Rb, og p-Rb Ser807 /811 var fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Fettsyre syntase (FAS), AR og c-myc antistoffer ble kjøpt fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Skp2, p21, og P27 antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Ptil var fra DAKO (Elostrup, Danmark). BCL-2 var fra BD (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Bad, MDM2, akt1, p42 /44 MAPK, fosfor-EGFR Tyr1173, fosfor-EGFR Tyr1148, fosfor-EGFR Tyr1086, fosfor-EGFR Tyr1069, fosfor-EGFR Tyr1045, og fosfor-EGFR Tyr 845 var fra Millipore (Billerica, MA, USA). α-tubulin var fra Sigma. β-aktin, α-tubulin, og GAPDH ble brukt som lasting kontroll. Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin og anti-mus IgG sekundære antistoffer var fra Santa Cruz. Signalet fra pepperrot peroksidase merkede sekundære antistoff ble påvist ved forbedret kemoluminescens reaksjon (ECL western blotting deteksjon kit) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). GAPDH, α-tubulin, og β-actin ble brukt som laste kontroller. Intensiteten av båndene for ulike proteiner ble kvantifisert med Epson Stylus TX130 bruker FN-SCAN-IT gel 6.1 software.
Sekvensering av AR ligandbindende domene i LNCaP underlinjer
Total RNA ble isolert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Hilden, Tyskland). cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Waltham, Massachusetts, USA). Den kodende sekvens for ligand-bindende domene av AR ble amplifisert med KOD-pluss-kit (Toyobo, Osaka, Japan), ved bruk av primerpar 5′-ctgaaactacaggaggaagg-3 «(fremover) og 5′-tgcagaggagtagtgcagag-3» (revers) . Amplifikasjon ble utført ved å bruke en berørings ned termisk protokoll: 8 sykluser med 94 ° C i 15 s, 55 til 47 ° C i 30 s (redusert glødetemperaturen 1 ° C per syklus), 68 ° C i 1 minutt, etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 15s, 47 ° C i 30 sekunder, 68 ° C i 1 minutt, og en avsluttende forlengelsestrinn ved 68 ° C i 3 minutter. PCR produktene ble gelrenset (FAVORGEN, Ping-Tung, Taiwan) og direkte sekvensering på en DNA Sequencer. Sekvenser data ble avsatt til GenBank (innlevering ID: 1664456; BankIt1664456 SEQ1 KF720403; BankIt1664456 Seq2 KF720404; BankIt1664456 Seq3 KF720405).
Data Analysis
Data er presentert som gjennomsnittet +/- SD av minst tre forsøk, eller er representativt for forsøk gjentas minst tre ganger. Students t-test (to-halet, uparet) ble anvendt for å vurdere den statistiske signifikans av resultater fra proliferasjonsanalyse eksperimenter. En Excel-tillegg program ED50V10 ble brukt til å beregne halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50).
Resultater
Androgene responsen LNCaP underlinjer
Den største forskjellen mellom LNCaP 104-R1 eller 104-R2 celler med foreldre 104-S-celler er deres reaksjon på androgen behandling. Behandling av LNCaP 104-S-celler med fysiologisk konsentrasjon av androgen (0,1, 1, 10 nM R1881) [28] stimulert cellulær proliferasjon. Imidlertid androgen behandling trykkes proliferasjon av 104-R1 og R2 104-celler (figur 1A). I fravær av androgen, vekstraten til 104-R1 og R2 104-celler var 1,8-2,3 bretter høyere enn 104-S-celler (figur 1A). Androgen behandling (0.1, 10 nM R1881) økte cellepopulasjonen i S-fasen og nedsatt cellepopulasjonen i G1 fase i 104-S-celler. Imidlertid redusert androgen-cellepopulasjonen i S-fasen og forårsaket G1 cellesyklusarrest i både 104-R1 og R2 104-celler (figur 1B). IC
50 av R1881 beregnet å undertrykke 104-R1 og 104-R2 celler var 14,9 og 13,2 nM. PC-3 og DU-145 celler ikke uttrykker AR og ikke svare på androgen behandling, vi dermed ikke har PC-3 og DU-145 celler i disse forsøkene.
Spredning av LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler som vokser i 10% CS-FBS DMEM pluss 0, 0,1, 1 eller 10 nM syntetisk androgen R1881 i 96 timer ble bestemt ved 96-brønners spredning måle det totale DNA-innhold pr brønn ved bruk av Hoechst 33258 fluorescens . Relative celleantall ble normalisert til den for 104-S-celler uten R1881 behandling. Trippel stjerner (***) representerer celletallet er statistisk signifikant forskjellig (P 0,001) sammenlignet med den samme celletype uten R1881 behandling. Kolonner representerer bety for 24 gjentak; søylene representerer standardavvik. (B) Celle syklus fordeling av LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler ble behandlet med 0, 0,1, og 10 nM R1881 i 96 timer ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri. Stjerne (*), doble stjerner (**), og trippel stjerner (***) indikerer statistisk signifikant forskjell på
P
0,05,
P
0,01 og
P
0,001, respektivt, sammenlignet med den samme celletype uten R1881 behandling.
Uttrykk for AR og PSA mRNA i LNCaP underlinjer
I likhet med våre tidligere observasjoner [7-9,14], 104-R1 og 104-R2 celler uttrykker høyere AR mRNA enn 104-S-celler når androgen er fraværende (figur 2A). I tillegg observerte vi at 0,1 nM R1881 øket ekspresjon av AR mRNA i alle 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler, mens 10 nM R1881 bare økt AR mRNA i 104-S og 104-R1 celler (figur 2A ). Transkripsjonen aktivitet av AR i 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler ble sammenlignet ved å undersøke den androgene induksjon av mRNA-ekspresjon av AR målgen prostata spesifikt antigen (PSA). PSA-mRNA-nivåer økte med R1881 behandling doseavhengig, men var mye høyere i 104-R1 og R2 104-celler enn i 104-S-celler (figur 2B). Behandling av 104-S-celler med 0,1 nM R1881 forårsaket en 2,3 ganger økning av PSA mRNA. Men R1881 på 0,1 nM forårsaket en ca 6,3 og 9,0 ganger økning av PSA mRNA i 104-R1 og 104-R2 celler, henholdsvis. Behandling med 10 nM R1881 forårsaket en 6,8 ganger økning av PSA mRNA i 104-S-celler, men forårsaket en ca 22,1 og 32,0 ganger økning av PSA mRNA i 104-R1 og 104-R2 celler, henholdsvis (figur 2B). Når R1881 var fraværende, PSA mRNA nivået var høyere i 104-R1 og 104-R2 celler enn at i 104-S-celler. PC-3 og DU-145 celler ikke uttrykker AR og ikke svare på androgen behandling, vi dermed ikke har PC-3 og DU-145 celler i disse forsøkene.
Ekspresjon av AR (A) og PSA (B) mRNA ble påvist med kvantitativ real-time PCR i 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler ble behandlet med 0, 0,1, og 10 nM R1881 i 96 timer. Stjerne (*), doble stjerner (**), og trippel stjerner (***) indikerer statistisk signifikant forskjell på
P
0,05,
P
0,01 og
P
0,001, respektivt, sammenlignet med den samme celletype uten R1881 behandling. Nummertegn (#) og (###) indikerer statistisk signifikant forskjell på
P
0,05 og
P
0,001, henholdsvis for 104-R1 eller R2 104-celler sammenlignet med 104-S-celler i fravær av R1881.
AR ligandbindende domene i LNCaP underlinjer
LNCaP celler uttrykker en mutant AR (T877A) som viser avslappet ligandbindende spesifisitet [29,30]. Som 104-R1 og 104-R2 celler viste større androgene respons (figur 2B), bestemt vi om det finnes flere mutasjoner i 104-R1 og 104-R2 andre enn T877A celler. Sekvensering av cDNA fra LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler (figur 3A, 3B) antydet at alle tre LnCap underlinjer inneholde mutasjonen T877A på AR. Det var ingen ytterligere mutasjon i 104-R1 og R2 104-celler sammenlignet med foreldre 104-S-celler. Jo større androgene responsen kan skyldes høyere AR ekspresjonsnivået i 104-R1 og R2 104-celler (figur 2B).
Sekvens av LBD av AR i 104-S, 104-R1, og 104-R2 celler basert på fremover primer (A) og revers primer (B) ble vist. Rød pil indikerte punkt mutasjon T877A på LBD av AR i LNCaP celler.
Profilering av cellesyklusregulering proteiner i LNCaP underlinjer, PC-3 og DU-145 celler
Protein ekspresjonsnivået av AR er høyere i LNCaP 104-R1 og 104-R2 i forhold til LNCaP 104-S-celler i fravær av androgen. Behandling med både 0,1 og 10 nM syntetiske androgener R1881 svakt øket AR-proteiner i alle LnCap underlinjer (figur 4). DU-145 og PC-3 celler uttrykker ikke AR (figur 4). Alle tre LNCaP underlinjer, men ikke DU-145 og PC-3 celler uttrykker PSA proteiner. Androgen behandling indusert produksjon av PSA protein. PSA-proteinnivået var mye høyere i 104-R1 og R2 104-celler sammenlignet med 104-S-celler når de behandles med 10 nM R1881. Behandling med 0,1 nM R1881 bare indusert PSA ekspresjon i 104-R1 og R2 104-celler, men ikke 104-S-celler. Induksjonen fold av PSA-proteinet ved androgen behandling var lik den induksjon fold av PSA mRNA (figur 2B, Figur 4).
Protein uttrykk for AR, PSA, c-myc, Skp2, p21
Cip1, p27
Kip1, BCL-2, Bad, p53, MDM2, fosfor-MDM2 Ser166, Rb, fosfo Rb Ser807 /811, GAPDH, α-tubulin, og β-aktin i LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler ble behandlet med 0, 0,1, eller 10 nM R1881 i 96 timer ble analysert ved Western blotting. GAPDH, α-tubulin, og β-actin ble brukt som lasting kontroll. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Disse proteiner ble også undersøkt i PC-3 og DU-145-celler i fravær av androgen. Tallene representerer kvantifisering av band av enkelte protein kvantifiseres ved ImageJ og FN-SCAN-IT gel 6.1 software.
Når androgen er fraværende, 104-R1 og 104-R2 cellene uttrykte høyere nivåer av c-myc , Skp2, BCL-2, P53, fosfor-MDM2 Ser166, Rb, og fosfor-Rb Ser807 /811, men mindre p27
Kip proteiner i forhold til 104-S-celler. Androgen behandling øket protein ekspresjon av Skp2, c-Myc, Rb, og fosfo-Rb Ser 807/811, og P53 i 104-S-celler, men redusert ekspresjon av disse proteinene i 104-R1 og R2 104-celler. Expression of P27
Kip ble redusert med androgen i 104-S-celler, men ble indusert i 104-R1 og 104-R2 celler. Androgen behandling redusert P21
Cip overflod i alle LNCaP underlinjer. BCL-2 protein uttrykk i 104-R1 og 104-R2 celler var høy, men BCL-2 protein var knapt synlig i 104-S-celler. Androgen behandling redusert BCL-2 i 104-R1 og R2 104-celler. MDM2 i 104-S-celler er svakt økt med androgen, men ble ikke påvirket av androgen i 104-R1 og R2 104-celler. BAD protein-ekspresjon ble ikke påvirket av androgen behandling i 104-R1 og 104-R2 LnCap underlinjer (figur 4). 0,1 nM R1881 litt redusert BAD protein i 104-S-celler. DU-145 og PC-3 celler uttrykte høyere c-myc og Skp2 men lavere p27
Kip sammenlignet med 104-S-celler når androgen var fraværende. Sammenlignet med 104-S-celler, DU-145 celler uttrykte høyere p53 og lavere BAD protein. PC-3 celler uttrykte høyere BCL-2, fosfor-MDM2 S166, Rb, og fosfor-Rb S807 /811, men lavere BAD, P53, og MDM2 i forhold til 104-S-celler.
Profilering av Akt og EGFR signalanlegg proteiner i LNCaP underlinjer, PC-3 og DU-145 celler
Akt og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signaliserer spiller viktige roller som regulerer spredning og utviklingen av prostatakreft. Sammenlignet med 104-S-celler, 104-R1 og 104-R2 cellene uttrykte høyere proteinnivå akt2 og fosforylering av tyrosinene på EGFR (Tyr 1173, Tyr 1148, Tyr 1069, Tyr 1045, og Tyr 845), men uttrykte lavere proteinnivå Akt, akt1, fosfor-EGFR Tyr 1086, fosfor-Akt Thr308, fosfor-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr 204, Src, fosfor-Src Tyr527, og EGFR (figur 5). Androgen behandling øket protein ekspresjon av akt2 i alle tre underlinjer, så vel som fosfo-EGFR Tyr 1148, 1069 Tyr, Tyr 1045, og Tyr 845 i 104-S-celler. Androgen redusert fosfor-Akt Ser473, fosfor-Akt Thr308, og fosfor-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr 204 i 104-S-celler, men ikke i 104-R1 og 104-R2 celler. Androgen litt økt fosforylering av Akt (Thr308 og Ser473) i 104-R1 og 104-R2 celler. Proteinekspresjon av total Akt, akt1, p42 /44 MAPK, og EGFR ble ikke påvirket av androgen behandling. Sammenlignet med 104-S-celler, DU-145 og PC-3 celler uttrykte høyere Akt og akt1 og tilsvarende nivå av p42 /44 MAPK. Imidlertid er proteinnivået av fosfo-Akt T308 og S473, så vel som fosfo-p42 /44 MAPK var meget lav i DU-145 og PC-3-celler. Selv om PC-3-celler uttrykte mindre Src-protein, fosfo-Src Tyr527 var forholdsvis høy i PC-3-celler, sammenlignet med 104-S-celler. Protein nivået av fosfor-EGFR Tyr1045 og Tyr845 var høyere i DU-145 og PC-3, sammenlignet med 104-S-celler.
Protein uttrykk for total Akt, akt1, akt2, fosfor-Akt Ser473, fosfo Akt Thr308, p42 /44 MAPK, fosfor-p42 /44 MAPK Thr202 /Tyr204, EGFR, og annerledes fosforylering side av tyrosin (Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr1069, Tyr1045, og Tyr845) i LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler ble behandlet med 0, 0,1, eller 10 nM R1881 i 96 timer ble analysert ved Western blotting. Samme GAPDH, α-tubulin, og β-aktin, som vist på figur 3 ble brukt som kontroll lasting. Disse proteiner ble også undersøkt i PC-3 og DU-145-celler i fravær av androgen. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Tallene representerer kvantifisering av band av enkelte protein kvantifiseres ved ImageJ.
Vi har merket en interessant funn når vi normalisert fosfo-protein av Akt, EGFR, og Src av deres totale protein overflod. 104-R1 og R2 104-celler uttrykker relativt høyt forhold mellom fosfo-Akt /Akt, fosfo-Src /Src, fosfo-EGFR /EGFR, men lavere forhold av fosfo-ERK /ERK (tabell 1). Under økende tilstand (0,1 nM R1881 for 104-S; 0 nM R1881 for 104-R1 og 104-R2 celler), forholdet mellom fosfor-Akt /Akt, fosfor-Src /Src, og fosfor-EGFR /EGFR i 104-R1 og 104-R2 celler var 1,6 til 2 ganger, 02.02 til 03.09, og 1,7 til 10 ganger høyere. Forholdet mellom p-Akt /Akt ble ikke påvirket veldig mye av androgen i alle tre LnCap underlinjer. Androgen redusert forholdet mellom p-Src /Src i 104-R1 og R2 104-celler, men ikke 104-S-celler. Androgen svakt øket forhold av p-EGFR /EGFR i 104-S-celler. Androgen redusert forholdet mellom p-EGFR /EGFR på Tyr1148, Tyr1069, og Tyr 1045 i 104-R1 og Tyr1069 og Tyr845 i 104-R2 celler. Androgen øket den forholdet mellom fosfo-EGFR Tyr1173 /EGFR og fosfo-EGFR Tyr1045 /EGFR i 104-R2-celler. Sammenlignet med 104-S, DU-145 og PC-3 celler uttrykte svært lave fosfor-Akt /Akt og fosfor-ERK /ERK-forhold, men høyere fosfor-EGFR Tyr1045 /EGFR og fosfo-EGFR Tyr845 /EGFR-forhold. PC-3 celler også uttrykt relativt lav andel av fosfor-EGFR /EGFR av Tyr1173, Tyr1148, Tyr1086, Tyr 1069, men svært høy andel av fosfor-Src /Src i forhold til 104-S-celler.
LNCaP 104-S
LNCaP 104-R1
LNCaP104-R2
DU-145
PC-tre
R1881 (nM)
0
0.1
10
0
0.1
10
0
0.1
10
0
0
AktS47310.70.71.41.51.21.11.21.30.00.1T30810.80.70.91.10.90.60.71.00.00.0SrcY52710.91.13.52.32.32.02.01.31.05.0EGFRY117311.41.92.72.53.014.025.025.01.30.6Y114811.71.96.04.04.516.016.014.01.10.5Y108611.01.01.01.01.03.03.02.00.90.5Y106911.41.38.35.05.019.014.010.00.70.5Y104513.52.99.79.07.326.030.033.04.62.0Y84511.51.44.74.04.517.013.09.02.31.8ERK1/2T202/Y20410.70.50.50.50.60.30.10.10.40.0Table 1. Forholdet mellom fosfor-Akt /Akt, fosfor-Src /Src, fosfor-EGFR /EGFR og fosfo-ERK /ERK for LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3 og DU-145 -celler.
Kvantifisering av proteinet fra figur 4 og figur 5 ble benyttet for beregning av forholdet. Verdiene i tabell 2 viser forholdet mellom fosfo-protein i løpet av totalt protein overflod. CSV Last ned CSV
Mønster av protein uttrykk profil i tre LNCaP underlinjer, DU-145, og PC-tre
Profilen til proteinforandringer i henhold til behandling av 0, 0,1 og 10 nM R1881 i 104-S, 104-R1, og 104-R2-celler ble oppsummert i varmen kartet i figur 6. det er interessant å legge merke til at mønsteret av protein ekspresjon av 104-S-celler som ble behandlet med 10 nM R1881 var mer lik 104-R1 og 104-R2 celler behandlet med androgen (0,1 og 10 nM R1881). Mønsteret av protein ekspresjon av 104-S-celler uten androgen behandling var svært forskjellig fra alle andre prøver som ble testet (figur 6).
Protein ekspresjonsprofilen av LNCaP 104-S, 104-R1, og 104-R2 cellene ble behandlet med 0, 0,1, eller 10 nM R1881 i 96 timer, så vel som i DU-145 og PC-3-celler i fravær av androgen analysert i figur 3 og figur 4 ble slått sammen og samlet i to varmevekskartdiagrammer ved bruk av Cluster 3.0 Utforsker (https://genome-www.standford.edu). Rød og grønn farge representerer den økning og reduksjon av protein overflod, respektivt. Lysere farge indikerer større endring av protein overflod.
Følsomhet for LNCaP underlinjer, DU-145, og PC-3 celler til kjemoterapi narkotika
Vi neste fast veksten responsen av LNCaP 104-S, 104-R1, 104- R2, DU-145, og PC-3 celler til fire brukte kjemoterapi narkotika av prostatakreft. IC
50 av paclitaxel for alle tre LnCap underlinjer var lik (figur 7 og figur 8). Sensitiviteten av 104-R1 og R2 104-celler til etoposid, mitoksantron, og vinblastin, var lik. 104-R1 og R2 104-celler var mer resistente mot behandling av etoposid, mitoksantron, og vinblastin sammenlignet med 104-S-celler (tabell 2). DU-145 og PC-3 celler var mer motstandsdyktig mot alle fire kjemoterapi narkotika sammenlignet med 104-S-celler.
LnCap 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3 og DU-145-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av etoposid (A) eller paclitaxel (B) i 72 timer. Relative celleantall av LNCaP-celler ble bestemt ved Hoechst fargestoff 33258-baserte 96-brønn assay proliferasjon som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleantall ble normalisert til kontroll (dimetylsulfoksyd) for hver cellelinje. Triple stjerner (***) representerer statistisk signifikant forskjell
p
. 0,001 mellom den behandlede gruppen og kontroll (ingen behandling) gruppe
LNCaP 104-S, 104- R1, R2-104, PC-3 og DU-145-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av mitoxantron (A) eller vinblastin (B) i 72 timer. Relative celleantall av LNCaP-celler ble bestemt ved Hoechst fargestoff 33258-baserte 96-brønn assay proliferasjon som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleantall ble normalisert til kontroll (dimetylsulfoksyd) for hver cellelinje. Triple stjerner (***) representerer statistisk signifikant forskjell
p
. 0,001 mellom den behandlede gruppen og kontrollgruppen
LNCaP 104-S
LNCaP 104-R1
LNCaP 104-R2
PC-3
DU-145
etoposide12.352.002.492.76paclitaxel11.181.072.923.43mitoxantrone13.523.383.382.28vinblastine11.321.453.231.83AG147811.841.410.501.69Gefitinib11.090.991.791.32LY29400211.491.332.953.73Saracatinib11.110.901.870.77BCl-2 inhibitor11.151.030.571.12Table 2. Forhold av IC
50 for LNCaP 104-R1, 104-R2, PC-3 og DU-145 celler i forhold til 104-S-celler.
IC
50 fra Figurene 7-10 ble anvendt for beregning av forholdet. IC
50 av 104-S-celler for alle ulike inhibitorer ble satt til en for sammenligning. CSV Last ned CSV
Følsomhet for LNCaP underlinjer, DU-145, og PC-3 celler til kinase hemmere og BCL-2-hemmer
I forhold til LNCaP 104-S-celler, 104-R1 og 104-R2 celler var mer resistente mot behandling av PI3K-inhibitor LY294002 og EGFR-inhibitor AG1478 (Figur 9, Figur 10, tabell 2). Sensitivitet på 104-R1 og 104-R2 celler til EGFR-hemmer Gefitinib og BCL-2-hemmer ABT 737 var lik som 104-S-celler. 104-R2-celler var litt mer følsom for behandling av Src-inhibitor Saracatinib. Sammenlignet med 104-S-celler, PC-3 og Du-145-celler var mer motstandsdyktige mot de fleste medikamenter som skal testes. Men PC-3 celler var mer følsomme for behandling av AG1478 eller ABT 737 mens DU-145 celler var mer følsomme for Saracatinib.
LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3, og DU-145-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av AG1478 (A) eller Gefitinib (B) i 72 timer. Relative celleantall av LNCaP-celler ble bestemt ved Hoechst fargestoff 33258-baserte 96-brønn assay proliferasjon som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleantall ble normalisert til kontroll (dimetylsulfoksyd) for hver cellelinje. Triple stjerner (***) representerer statistisk signifikant forskjell
p
0,001 mellom den behandlede gruppen og kontrollgruppen.
LNCaP 104-S, 104-R1, 104-R2, PC-3 og DU-145 celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av LY294002 (A), Saracatinib (B), eller ABT 737 (C) i 72 timer. Relative celleantall av LNCaP-celler ble bestemt ved Hoechst fargestoff 33258-baserte 96-brønn assay proliferasjon som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleantall ble normalisert til kontroll (dimetylsulfoksyd) for hver cellelinje.
