Abstract
kodende RNA (ncRNAs) er den dominerende produkt av eukaryote transkripsjons. Disse produktene varierer fra korte microRNAs (mirnas) til lange intergeniske ikke-kodende RNA (lincRNAs). Sirkulære RNA består av exonic sekvenser representere en studerte form for ncRNA som ble oppdaget mer enn 20 år siden. Ved hjelp av en TaqMan-basert revers transkriptase polymerase chain reaction assay, analyserte vi forholdet mellom
CIR-ITCH
uttrykk og endetarmskreft (CRC) i totalt 45 CRC og sammenkoblede vevsprøver tilstøtende ikke-tumor. Vi fant ut at
CIR-ITCH
uttrykk ble vanligvis nedregulert i CRC forhold til peritumoral vev. Dette resultatet, samt flere oppfølgingsforsøk viste at
CIR-ITCH
kan øke nivået av
ITCH
, som er involvert i hemming av Wnt /β-catenin veien . Derfor våre resultater viste at
CIR-ITCH
spiller en rolle i CRC ved å regulere Wnt /β-catenin veien
Citation. Huang G, Zhu H, Shi Y, Wu W, Cai H, Chen X (2015)
CIR-ITCH
spiller en hemmende rolle i tykktarmskreft ved å regulere Wnt /β-catenin Pathway. PLoS ONE 10 (6): e0131225. doi: 10,1371 /journal.pone.0131225
Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Suzhouuniversitetet, KINA
mottatt: 24 april 2015; Godkjent: 30 mai 2015; Publisert: 25 juni 2015
Copyright: © 2015 Huang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Wenzhou Science and Technology Bureau Natural Science Foundation (Y20140700 Dr. XC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en ondartet svulst som ligger i tykktarmen eller endetarmen [1, 2]. CRC er fortsatt en viktig årsak til kreftdødelighet i den utviklede verden, hovedsakelig på grunn av sin tilbøyelighet til å spre [3]. CRC utgjør et stort folkehelseproblem, som det er den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den nest vanligste hos kvinner. Det har vært mange komparative studier som viser epigenetiske forandringer tett knyttet til forekomst og utvikling av CRC. Selv om CRC forskningen prestasjoner er bemerkelsesverdig, den etiologiske faktorer og mekanismer som ligger under patogenesen CRC utvikling ser ut til å være komplekse og heterogene.
Nylig har sirkulært RNA, en type av ikke-kodende RNA som vanligvis ikke opptrer ved koding av et protein, ble funnet å være nært knyttet til kreftutvikling [4]. Sirkulært RNA er vanligvis sammensatt av mer enn en ekson, og er vanligvis anriket med funksjonell mikroRNA (miRNA) bindingsseter; for eksempel
CDR1
inneholder flere bevarte bindingsseter for miRNA-7 (MIR-7). Nylig, en studie rapporterte at
CIR-ITCH
er en sirkulær RNA som spenner over flere eksoner av Ubiquitin (Ub) protein ligase (E3) (ITCH) [5-7]. Artikkelen indikerte at
CIR-ITCH
havner mange miRNA bindingsseter som kan binde til 3′-UTR av
ITCH
, inkludert de for MIR-7, MIR-17, MIR-214 , MIR-128 og MIR-216b [5, 8]. Studiet av mirnas er mer moden enn den sirkulære RNA; mirnas er 21-nukleotid lange ikke-kodende RNA som har viktige roller i en rekke biologiske prosesser i både planter og dyr [9]. Moden mirnas spiller viktige regulatoriske roller i cellevekst, spredning, differensiering og celledød.
CIR-ITCH
spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av ESCC [7].
kløe
«s mål, inkludert p63, p73, og Notch1, er vanligvis forbundet med tumordannelse og kjemosensitivitet, viser tilkobling av ITCH til kreft biologi [10]. Tidligere forskning diskutert sirkulært RNA anti-kreft aktivitet i maligne melanom cellelinjer [11]. Men det er ingen rapporterte studier på de funksjonelle rollene til sirkulære RNA i CRC.
I denne studien har vi en hypotese om at
CIR-ITCH
spiller en tilsvarende rolle i CRC. For å teste denne hypotesen, har vi utviklet en metode for å avgrense transkripsjons forskjeller i
CIR-ITCH
mellom CRC og paret tilstøtende ikke-neoplastiske vev.
Materialer og metoder
Study fagene
Alle fag i denne studien var homogene Han-kinesere. Førtifem CRC og tilhørende paracancerous vevsprøver ble oppnådd fra pasienter på The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College (Wenzhou). Det var ingen restriksjoner på alder, stadium av CRC, sex eller histologi. Ved rekruttering, ga hvert fag skriftlig informert samtykke ved å planlegge et intervju der de fikk et strukturert spørreskjema. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Wenzhou Medical College. De kliniske karakteristika av alle pasienter er listet opp i tabell 1.
Cell kultur
Den menneskelige CRC cellelinjer HCT116 og SW480 ble kjøpt fra Celle Bank of Type Culture Collection av Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology og ble passert for mindre enn 6 måneder.
Byggingen av den sirkulære RNA plasmid
Vi konstruerte sirkulære RNA plasmid brukt i denne studien. Konstruksjonen Metoden ble tidligere utgitt [8]. Den resulterende konstruksjon (
pcDNA3
.
1-CIR-ITCH
) ble verifisert ved direkte sekvensering.
RNA ekstraksjon og sanntids kvantitativ polymerase chain reaction
Total RNA ble isolert fra celler og vev ved hjelp av TRIzol reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Den relative genekspresjon av
cir-klø
ble bestemt ved anvendelse qPCR, som er basert på den TaqMan-metoden.
GAPDH
ble anvendt som en indre standard kontroll, og alle reaksjoner ble utført in triplo [12, 13]. Primerne anvendt for qPCR forsterkning er den fremre GCAGAGGCCAACACTGGAA, omvendt TCCTTGAAGCTGACTACGCTGAG, sonden CCGTCCGGAACTATGAACAACAATGGCA.
RNase R fordøyelse
RNase R nedbrytningsreaksjon ble utført ved å følge tidligere publiserte prosedyrer. Fordøyelse og utfellingsreaksjoner ble gjentatt to ganger med et forhold på 3 U enzym /mg RNA [14].
Forbigående transfeksjoner og luciferase-analyser
HCT116 og SW480-celler ble transfektert med reporteren plasmider som er beskrevet ovenfor ved bruk av Lipofectamine 2000. Celler ble ko-transfektert med mirnas i henhold til produsentens instruksjoner [15]. Hver gruppe inkludert 6 replikater, eller tredoble uavhengige eksperimenter ble utført.
Actinomycin D analysen
HCT116 og SW480 celler ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000 og ble ko-transfektert med mRNA som angitt i 24 timer . Cellene ble deretter eksponert for actinomycin D. Cellene ble høstet, og stabiliteten i
cir-klø
mRNA ble analysert ved hjelp av kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR). Analysen ble utført i overensstemmelse med den foregående artikkelen.
Western blot
Western blot-analyse for å vurdere Wnt3a, β-catenin og β-handling ekspresjon ble utført som tidligere beskrevet [16].
celleviabilitet analysen
cellen levedyktighet ble målt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (CCK-8) system i henhold til produsentens instruksjoner. Det var 6 replikater for hver gruppe, og forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
Statistiske analyser
Sammenhengen mellom uttrykket av
CIR-ITCH
og
ITCH
genet i CRC vev ble bestemt ved bruk av enveis variansanalyse og lineære regresjonsmodeller. Forskjeller mellom gruppene ble vurdert av en sammenkoblet, 2-tailed t-test. En
P
-verdi av. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Identifikasjon av sirkulære RNA
To sett med
ITCH
primere ble konstruert for denne studien: en divergerende apparatet for å forsterke bare sirkulær form og en konvergent satt til å forsterke de lineære former. Vi har bekreftet at den sirkulære formen ble amplifisert ved hjelp av de divergerende primere. cDNA og genomisk DNA ble anvendt som kontroller. Som forventet ble ingen forsterkning observert ved anvendelse av de divergerende primere på genomisk DNA. GAPDH ble anvendt som lineær kontroll (Fig 1 A).
(A) Konvergerende primere kan forsterke sirkulære og lineære RNA RNA. Divergerende primere forsterke sirkulære RNA bare i cDNA sammenlignet med genomisk DNA (gDNA). GAPDH er lineær kontroll. (B)
CIR-ITCH
ble uttrykt på et høyere nivå i ca 75,6% av CRC tilstøtende vev i forhold til å matche CRC vev. Uttrykket nivået av
CIR-ITCH
ble analysert ved QRT-PCR basert på Taq-mann og normalisert til
GAPDH
. Data er representert som middelverdi ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (C) tilfeldige primere og oligodT primere ble brukt henholdsvis i revers transkripsjon eksperimenter. Den spådde
CIR-ITCH
er fraværende i poly (A) beriket prøver. (D) Den antatte
CIR-ITCH
er reagere mot å RNase R behandling. 2-tailed t-test ble brukt i testen forskjellene mellom grupper * p 0,05 sammenlignet med kontroll.
Uttrykk for
CIR-ITCH
i CRC og de omkringliggende vev
Vi brukte avvikende sett med primere og utnyttet en TaqMan-basert QRT-PCR-analyse for å bekrefte tilstedeværelsen av den sirkulære RNA i 45 CRC-vevet og ikke-sammenkoblet cancervev.
CIR-ITCH
ble uttrykt på et høyere nivå i ca 75,6% av CRC vev sammenlignet med de matchet ikke-kreft prøver (figur 1B).
Karakterisering av
cir -ITCH
i CRC celler
Vi konstruerte en vektor for å uttrykke
CIR-ITCH
i cellene etter forrige undersøkelse og deretter utført eksperimenter. De konstruerte plasmider ble transient transfektert i HCT116 og SW480 celler.
I revers transkripsjon eksperimenter, vi brukte tilfeldige primere og oligo (DT) primere. De sirkulære produkter ble tømt i polyA-anrikede prøver, sammenlignet med de lineære produkter. Ved bruk av oligo (dT) primere, uttrykket mengde (normalisert til GAPDH) lineær
ITCH
var betydelig høyere enn for sirkulær
ITCH plakater (figur 1C) [11].
Vi brukte enzymet RNase R, en høyt processive 3′-5 «exoribonuclease, for å teste våre spådommer av sirkulære RNA egenskaper. Dette eksonuklease forringer lineære RNA-molekyler i en 3»-5 «retning, men det fungerer ikke på rund RNA [17, 18]. Som forventet, i motsetning til de lineære styre RNA, som ble degradert, den forutsagte sirkulære RNA var bestandig overfor RNase R behandling (Fig 1 D).
Interaksjon mellom
cir-klø
og miRNA
Nylig har sirkulære RNA blitt identifisert som en rikelig klasse av regulatoriske transkripsjoner som fungerer som miRNA svamper [5, 8]. Miranda programmet ble brukt til å forutsi målet miRNA. Sekvensen av de antatte microRNAs bindingsseter ble presentert i tabell 2. Vi fant at MIR-7, MIR-20a, og MIR-214 kan binde seg til 3′-utranslaterte område (UTR) av
ITCH Hotell og
CIR-ITCH
. Derfor satt vi
ITCH
bindende sekvens i psiCHECK-2 og konstruert luciferasepreparater journalister for disse 3 mirnas av forbigående co-trans dem inn i HCT116 cellene. Konstruksjonen hadde betydelig redusert luciferase aktivitet for MIR-7, MIR-20a, og MIR-214 på en konsentrasjonsavhengig måte i kontroll HCT116-celler (1 pmol miRNA-7: 1,02 ± 0,028 versus 1,236 ± 0,068,
P
= 0,05; 40 pmol miRNA-7: 0,808 ± 0,052 versus 1,236 ± 0,068,
P
= 0,02; 1 pmol miRNA-20a: 2,09 ± 0,123 versus 2,498 ± 0,068,
P
= 0,02; 40 pmol miRNA-20a: 1,887 ± 0.11versus 2,498 ± 0,068,
P
= 0,006; 1 pmol miRNA-214: 1,511 ± 0,059 versus 1,88 ± 0,043,
P
= 0,03; 40 pmol miRNA-214: 1,38 ± 0,058 versus 1,88 ± 0,043,
P
= 0,006). Lignende resultater ble funnet når vi gjentok de samme eksperimentene i kontroll SW480 celler.
Vi gjorde samme eksperiment i
CIR-ITCH
hyper-uttrykk celler. Resultatene viste at det var ingen signifikante forskjeller i luciferase aktivitet når psiCHECK-2-
ITCH
-binding nettsted med MIR-7 og MIR-20a ble transfektert inn i HCT116 og SW480 celler, men at det var en signifikant forskjell Mir-214 (1 pmol miRNA-7: 1,147 ± 0,041 versus 1,236 ± 0,042,
P
= 0,069; 40 pmol miRNA-7: 1,138 ± 0,015 versus 1,236 ± 0,042,
P
= 0,12; 1 pmol miRNA-20a: 2,424 ± 0,017 versus 2,526 ± 0,058,
P
= 0,11; 40 pmol miRNA-20a: 2,345 ± 0,04 versus 2,526 ± 0,058,
P
= 0,069 ; 1 pmol miRNA-214: 1,539 ± 0,038 versus 1,877 ± 0,039,
P
= 0,001; 40 pmol miRNA-214: 1,407 ± 0,051 versus 1,877 ± 0,039,
P
= 0,004) ( 2A).
(A) Relativ luciferase aktivitet av psiCHECK-to-ITCH konstruerer ko-transfektert med MIR-20a, MIR-7, MIR-214 og hemmer i HCT116 og SW480 celler. I
CIR-ITCH
hyper-uttrykk celler, var det ingen signifikante forskjeller i luciferase aktivitet når psiCHECK-2-
ITCH
-binding nettsted med mirnas ble transfektert inn HCT116 og SW480 celler. Seks replikater for hver gruppe og eksperimentet gjentas minst tre ganger. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. (B) HCT116 og SW480 celler etter transfektert med
CIR-ITCH Kjøpe og Kontrollceller ble henholdsvis transfektert med MIR-20a, MIR-7 og inhibitor i 24 timer og ble deretter videre eksponert for actinomycin D for 1, 2 og 3 timer. Cellene ble høstet og stabiliteten
cir-klø
mRNA ble analysert ved hjelp av QRT-PCR i forhold til tid 0 etter blokkering ny RNA-syntese med actinomycin D; data er gjennomsnitt ± SEM, normalisert til
GAPDH
.
HCT116 og SW480-celler transfektert med konstruerte plasmid ble behandlet med aktinomycin D i nærvær av en eller 40 pmol av MIR-7 og MIR-20a, og det totale RNA ble høstet ved de indikerte tidspunkter. Resultatene viser at i kontrollceller,
CIR-ITCH
nivåer holdt seg på 20-30%; Men det var lite endring i
CIR-ITCH
nivåer i HCT116 cellene etter inkubasjon med actinomycin D. Vi gjentok disse eksperimentene i SW480 celler med samme resultat (figur 2B).
Association of
CIR-ITCH Hotell og
ITCH
i CRC
Nylig
CIR-ITCH
ble rapportert å regulere genuttrykket gjennom sin rolle som en miRNA svamp, og dermed beskytte mirnas «målgener. Derfor testet vi sammenhengen mellom
CIR-ITCH Hotell og
ITCH
i ytterligere 15 par med CRC adjuvant ikke-kreft vev. Resultatene viste at pasienter med høyere
CIR-Itch
uttrykk nivåer i CRC vev hadde en betydelig oppregulering av lineær
ITCH product: (R
2 = 0,32,
P
0,01; fig. 3A)
(A) de lineære sammenhenger mellom
CIR-Itch
uttrykk nivåer og lineær
ITCH
ble testet. Den relative uttrykket verdien ble normalisert ved
GAPDH
uttrykk nivå. (B) En TCF luciferase reporter-analysen ble utført. Luciferase-aktiviteten ble normalisert til den Renilla luciferaseaktivitet. (C) Et proteinnivåer Wnt3a og β-catenin ble undersøkt i CRC-celler (HCT116-celler og SW480-celler) ved hjelp av Western blot. (D) mRNA nivået av
c-myc Hotell og
cyclinD1
ble oppdaget av kvantitativ RT-PCR etter transfektert med
CIR-Itch
eller Kontrollceller i CRC celler. (Øverste er
c-myc Hotell og jo lavere er
cyclinD1
) Dataene er gjennomsnitt ± SEM og representant for tre uavhengige eksperimenter. (E) HCT116 og SW480-celler ble sådd ut i 96-brønners plater etter å ha blitt transfektert, og celleformering ble utført daglig i 3 dager ved bruk av CCK-8-analyse. Seks replikater for hver gruppe og forsøket gjentatt tre ganger. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. *
P
. 0,05 sammenlignet med kontroller
CIR-ITCH
er involvert i reguleringen av Wnt /β-catenin signalveien in vivo
ITCH protein ubiquitinates den fosforylerte formen for Dvl2 og fremmer sin degradering, og dermed begrenser kanonisk Wnt signal [19]. For ytterligere å verifisere om
CIR-ITCH
regulerer Wnt /β-catenin signalveien i CRC celler, brukte vi en β-catenin /TCF-responsive luciferase reporter analysen. Resultatene viste at overekspresjon av ITCH inhiberte TOP flash-aktiviteten på en doseavhengig måte (figur 3B). Den β-catenin og Wnt3a nivåer ble analysised ved hjelp av western blot i celler med
ITCH
hyperekspresjon, og som vist i figur 3C, var det en tydelig nedgang i β-catenin nivå, mens det var ingen forandring i Wnt3a uttrykk. Vi testet uttrykk for
c-myc Hotell og
cyclinD1
, to målgener av Wnt /β-catenin signalveien, i celler transfektert med
CIR-ITCH
. Deres uttrykk ble også undertrykt (Fig 3D).
CIR-ITCH
modulerer cellevekst
Vi utførte CCK-8-analyser for å teste effekten av
kretsene ITCH
på celleproliferasjon i CRC celler. Vi observerte en konsekvent reduksjon i cellen spredning av HCT116 (28% -39% reduksjon) og SW480 celler (15% -33% reduksjon) når
CIR-ITCH
ble overexpressed på fysiologiske nivåer gjennom CCK-8 analyser sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3E).
Diskusjoner
i denne studien identifiserte vi
CIR-ITCH
i CRC og fant ut at det ble dramatisk ned- reguleres i CRC vev ved hjelp av en TaqMan-baserte revers transkriptase polymerase chain reaction assay, noe som indikerer potensialet funksjon av
cir-klø
i CRC. En rekke forsøk vist sammenhengen mellom
CIR-ITCH Hotell og mirnas, viser at
CIR-ITCH
spiller en viktig rolle som en miRNA svamp i ferd med CRC utvikling.
Tusenvis av lincRNAs har blitt identifisert hos mennesker og mus, og mange er nært knyttet til utviklingen av ulike typer kreft, slik som esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) og livmorkreft [20, 21]. Sirkulært RNA er en type lincRNA som spiller en rolle i tumorutvikling. Så vidt vi vet,
ITCH
er en av E3 ubiquitin protein ligaser som er spesielt rettet mot p73 [22], Dvl2 [19], og Notch1 [23], som alle er vanligvis forbundet med tumordannelse og kjemosensitivitet.
Selv om funksjonene til mirnas er langt fra å bli fullt ut forstått, er det anslått at ca 30% av protein-kodende gener blir styrt av mirnas [24], og noen studier har antydet at miRNA kan binde seg til den tre «-UTR av
ITCH
å redusere sin uttrykk [25]. Memczak et al. (2013) og Hansen et al. (2011) foreslo at cerebellar degenerasjon relaterte protein 1 (CDR1) locus havner 70 konserverte kampene til MIR-7 frø. Denne slående trekk foreslått at sirkulært RNA har en mulig funksjon som en svamp miRNA [5, 8, 26]. Tidligere forskning har vist at
CIR-ITCH
fungerer som en svamp for MIR-7, MIR-17, og MIR-214, mens i denne studien, fant vi at i CRC cellelinjer, MIR-7 og MIR-20a nedregulerer
ITCH
uttrykk ved å binde seg til sin 3′-UTR. Videre er disse mirnas alltid næret av
CIR-ITCH
. I vår studie,
CIR-ITCH
ikke opptre som en svamp for MIR-214. Så vidt vi vet, ektopisk uttrykk for MIR-214 undertrykker spredning, migrasjon og invasjon in vitro, mens MIR-214 knockdown fremmer spredning, migrasjon og invasjon i CRC cellelinjer [27].
mirnas har lenge vært assosiert med kreft. Forhøyet MIR-7 ekspresjon er blitt beskrevet i en rekke forskjellige tumortyper, inkludert CRC, og har vært implisert i onkogenese, klassifisering, og progresjon av kreft [28]. MIR-20a bidrar til økt spredning og invasivitet av CRC celler [29]. Basert på denne informasjonen, våre data bekrefte våre forgjengeres arbeid. Fra ovennevnte data, ble det vist at
CIR-ITCH
deltar i utviklingen av CRC gjennom regulering av miRNA aktivitet.
Aberrant regulering av Wnt signalveien har dukket opp som et utbredt tema i kreft biologi, og det er avgjørende for utbruddet og progresjon av menneskelig CRC. Omtrent 90% av sporadiske tykktarm kreft viser avvik Wnt signal [30].
CIR-ITCH
fungerer som en miRNA svamp og øker nivået av
ITCH
, som er involvert i Wnt /β-catenin veien. Ifølge tidligere forskning, kan ITCH fremme ubiquitinering og nedbrytning av fosforylert Dvl2 og derfor hemme kanonisk Wnt signalering [19]. En β-catenin /TCF-responsive luciferase reporter-analysen ble brukt til å undersøke hvorvidt et enkelt gen regulerer Wnt /β-catenin signalveien. Vår studie og andre tidligere resultater rapportert at overekspresjon av
CIR-ITCH
undertrykte betydelig relativ TCF transkripsjonen aktivitet.
onkogener
c-myc Hotell og
cyclinD1
er effektor-proteiner av karyomitosis signal, som kan utløse og regulere transkripsjon av gener som er knyttet til proliferasjon. De er ofte overuttrykt i mange humane tumorer, inkludert CRC [31]. Våre resultater viste at i celler transfektert med
CIR-ITCH
, uttrykk for
c-myc Hotell og
cyclinD1
ble markert redusert. Derfor foreslår vi at
CIR-ITCH
har en hemmende effekt på den kanoniske Wnt veien.
CIR-ITCH
spiller en anti-tumor rolle ved å kontrollere miRNA aktivitet, og den har en hemmende rolle i den kanoniske Wnt veien, hemme
c-myc Hotell og
cyclinD1
uttrykket.
i sammendraget, vår nåværende studie indikerer at miRNA svamp
CIR-ITCH
representerer en ny generasjon teknologi for miRNA hemming.
CIR-ITCH
er involvert i Wnt /β-catenin vei, og ved å hemme denne veien, det spiller en rolle i CRC.
Takk
Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet fra Wenzhou Science and Technology Bureau Natural Science Foundation (Y20140700).
