Abstract
Bakgrunn
De ulike mekanismene som er involvert i p120- catenin (p120ctn) isoformer «1/3 regulering av cellesyklusprogresjon er fortsatt ikke klarlagt ennå.
Metoder og funn
Vi fant at både cyclin D1 og cyclin E kan være effektivt restaurert av restitusjon av p120ctn-1A eller p120ctn-3A i p120ctn utarmet lungekreftceller. Når uttrykk for cyclin D1 ble blokkert av co-transfeksjon med siRNA-cyclin D1 i p120ctn utarmet celler gjenopprette p120ctn-1A eller 3A, ble uttrykket av cyclin E litt redusert, ikke økt, noe som tyder på at p120ctn isoformer 1 og 3 kan ikke opp- regulere cyclin E direkte, men kan gjøre det gjennom oppregulering av cyclin D1. Interessant, overekspresjon av p120ctn-1A økt β-catenin og cyclin D1 uttrykk, mens ko-transfeksjon med siRNA målretting β-catenin opphever virkningen av p120ctn-1A på oppregulering av cyclin D1, hvilket antyder en rolle β-catenin som formidler p120ctn-1A er regulerende funksjon på cyclin D1 uttrykk. På den annen side, overekspresjon av p120ctn isoform 3A redusert atom Kaiso lokalisering, og dermed redusere bindingen av Kaiso til KBS på cyklin D1-promoteren og derved øke ekspresjonen av cyclin D1-genet ved å lindre repressoren effekten av Kaiso. Fordi overekspresjon NLS-p120ctn-3A (p120ctn-3A kjernefysiske mål lokaliserings plasmider) eller hemme atom eksport av p120ctn-3 av Leptomycin B (LMB) forårsaket translokasjon av Kaiso til kjernen, er det sannsynlig at den kjernefysiske eksport av Kaiso er p120ctn- 3-avhengig.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at p120ctn isoformer 1 og 3 oppregulerer cyclin D1, og derved cyclin E, noe som resulterer i å fremme celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon i lunge kreftceller trolig via ulike protein meklere, nemlig β-catenin for isoform en og Kaiso, en negativ Transkripsjonsfaktor faktor~~POS=HEADCOMP av cyclin D1, for isoform 3.
Citation: Jiang G, Wang Y, Dai S, Liu Y , Stoecker M, Wang E, et al. (2012) P120-catenin isoformer 1 og 3: Regulering av spredning og Cell Cycle of lungekreft celler via β-catenin og Kaiso Henholdsvis. PLoS ONE 7 (1): e30303. doi: 10,1371 /journal.pone.0030303
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 02.10.2011; Godkjent: 13 desember 2011; Publisert: 20 januar 2012
Copyright: © 2012 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China National (gir 81.071.905 til EnHua Wang, 30901475 til Yan Wang, 81071717 til Shundong Dai, og 30.900.562 til Yang Liu). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i kreftceller, β-catenin, en nøkkelfaktor i den kanoniske Wnt signalveien, akkumuleres i cytoplasma og deretter translocates inn i kjernen for å danne et kompleks med den transkripsjonsfaktor Lef /TCF (Lef, lymfoid forsterker faktor; TCF, T-celle-faktor-protein), som deretter aktiverer Wnt-responsive gener, inkludert cyklin D1 [1]. Tidligere har vi rapportert at en av de p120ctn isoformer, p120ctn-1, kan oppregulerer β-catenin ekspresjon, mens en annen p120ctn isoform, p120ctn-3, kan ikke [2] – [3]. Interessant, isoformer både p120ctn 1 og 3 kan påvirke celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon, som er kjent for å være formidlet av cyklin D1 [2] – [4]. Det er således rimelig å spekulere i at p120ctn-1 regulerer celleproliferasjon og cellesyklus gjennom β-catenin indusert oppregulering av cyclin D1. Men den underliggende molekylære mekanismen som p120ctn-3 regulerer celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon er fortsatt uklart på det nåværende tidspunkt.
Vår tidligere studie viste at Kaiso, en kjernefysisk BTB /POZ-ZF (BTB, Broad komplekse, Tramtrack, Bric en Brac, POZ, koppe og sink finger, ZF, sink finger) transkripsjonsfaktor, kan binde seg til p120ctn i lungekreft vev og lungekreft celler [5]. Selv om det er kjent for å være en komponent av den Kaiso /p120ctn kompleks, kan hver enkelt p120ctn isoform har en forskjellig affinitet, mens binding til Kaiso [6]. Av interesse, arrangøren regionen cyclin D1 inneholder KBS (Kaiso-bindingsseter), en sekvens konsensus DNA som kunne bli gjenkjent av Kaiso [7] – [8]. Derfor kan cyklin D1 også være en potensiell nedstrøms målgen av Kaiso [9] – [10]
Siden den bindende domene av Kaiso med p120ctn er fullstendig overlappes med den bestemte DNA-sekvensen av KBS element på cyclin. D1-promoteren [9] – [11], hypoteser om vi at p120ctn-3 kunne konkurrere med KBS på cyklin D1-genet for å binde seg til Kaiso og oppheve Kaiso-mediert represjon av cyclin D1, og dermed forsterke ekspresjonen av cyclin D1 samt Cyclin E , noe som til slutt ville fremme cellesyklusprogresjon. For å teste vår hypotese i denne studien, vi rekonstituert p120ctn-1A og 3A henholdsvis i p120ctn utarmet celler og overexpressed eller slått ned Kaiso eller β-catenin å teste effekten på uttrykk for cyclin D1 og cyclin E. Formålet var å undersøke potensielle forskjellige molekylære mekanismer som p120ctn-1 og 3 regulerer celleproliferasjon og cellesyklus i lungekreftceller. To delesjonsmutanter av p120ctn isoform en, som varierer i sine N-terminal strukturer, ble bygget for å studere de forskjellige funksjonene p120ctn-1 og 3.
Resultater
Både p120ctn 1A og 3A kunne up-regulere cyclin D1 og cyclin E uttrykk, påvirker celledeling og cellesyklusprogresjon i lungekreftceller
Enten p120ctn fungerer som en tumor suppressor eller en metastase promoter avhenger i stor grad av om uttrykket av E-cadherin er nede -regulated, fullstendig tapt fra den celle-celle kryss eller intakt [12]. Derfor er det viktig å bestemme om E-cadherin er lokalisert på membranen av humane lungekreftceller. I dette studiet bekreftet vi at ingen synlig membranøs lokalisering av enten p120ctn-1/3 eller E-cadherin proteiner i A549 eller SPC cellelinjer (figur S1). De viste i stedet hovedsakelig cytoplasma distribusjon. Etter p120ctn ble slått ned i A549-celler, ble uttrykk for cyklin D1 og cyclin E betydelig redusert ved nivåer på både protein (figur 1A) og transkripsjon (fig S2A). I henhold ble celleproliferasjon effektivt undertrykkes (
p
0,01, figur 1B), angitt med mer G
1 fase celler og mindre S fase celler oppdages (
p
= 0,001 , Figur 1C). Videre kan cyklin D1 og cyclin E effektivt gjenopprettes ved restitusjon av p120ctn-1A eller p120ctn-3A i p120ctn utarmet A549-celler (figur 2A og figur S2B), og celleproliferasjon og cellesyklus kan også bli gjenopprettet, antagelig svarende til repletion av cyclin D1 og Cyclin E (
p
0,05, figur 2B og C). Lignende resultater ble oppnådd i SPC-K2-celler hvori p120ctn ekspresjon ble konstitusjonelt tømt (fig S3).
(A) Resultatene av Western blot-analyse viste at proteinene Cyclin D1 (*,
p
= 0,001) og cyclin E (*,
p
= 0,004) var betydelig redusert etter p120ctn ble slått ned i A549 celler. (B og C) Resultatene av MTT og flowcytometri viste trykkes celle proliferativ evne, øket G
1 faseceller (*,
p
= 0,001) og reduserte S-faseceller (*,
p
= 0,001) ble påvist i A549 celler med slått ned p120ctn. Alle sammenligninger ble gjort til grupper av A549 celler eller celler transfektert med vektor alene.
(A) p120ctn-1A eller 3A plasmider ble transfektert i A549 celler utarmet av p120ctn (SI-P120 + 1A eller si-P120 + 3A), som viser betydelig utvinnes protein nivåer av cyclin D1 (*,
p
0,001, **,
p
0,001) og cyclin E (*
p
0,001, **,
p
0,01). (B og C) Resultatene av MTT og strømningscytometri viste at celleformering ble effektivt gjenopprettet (
p
0,01), G
en faseceller ble signifikant redusert (*,
p
= 0,001, **,
p
= 0,004) og S-fase celler ble betydelig økt (*,
p
= 0,004, **,
p
= 0,028 ) etter p120ctn tømt A549-celler ble transfektert med p120ctn-1A eller 3A. Alle sammenligningene blir gjort til grupper av A549 celler og celler transfektert med vektor alene.
Deretter fant vi at cyclin D1 utarming av siRNA i A549 celler også ført til reduksjon av cyclin E uttrykk ( Figur 3A og figur S4A), undertrykkelse av celleproliferasjon (
p
0,01, figur 3B), heving av G
1 fase celler og reduksjon i S-fase celler (
p
= 0,009, figur 3C), som var sammenlignbare med forstyrrelser av p120ctn. I motsetning til dette ble det ikke observert noen endring i cyklin D1 uttrykk når cyclin E ble oppbrukt av siRNA (figur 3A og figur S4A), noe som tyder på en ensrettet regulerende forhold mellom cyklin D1 og cyclin E. Interessant når siRNA-cyclin D1 ble ko-transfektert med p120ctn isoformen en eller tre inn i cellene utarmet av p120ctn, ekspresjonen av cyclin E ble ikke økt, men noe redusert (figur 3D og fig S4B), og et lignende fenomen ble observert når cyklin D1 ble blokkert av monoklonalt antistoff inkubasjon (100 ng /ml, 48 t) i p120ctn rekonstituerte celler (figur S5). Denne oppdagelse medfører at p120ctn isoformer 1 og 3 kunne ikke oppregulerer cyclin E direkte, men kan gjøre det gjennom oppregulering av cyclin D1. Alle disse resultatene tyder på at p120ctn fremmer cellesyklusutvikling ved opp-regulering av cyclin D1, som deretter øker ekspresjonen av cyclin E.
(A) Cyclin D1 uttømming av siRNA i A549-celler førte til redusert cyclin E uttrykk, men omvendt, uttrykk for cyclin D1 ble ikke vesentlig endret (
p
= 0,944) i celler med slått ned cyclin E av siRNA, tyder på en enveis regulatoriske forhold mellom cyclin D1 og cyclin E. (B og C) cyclin D1 uttømming trykkes celleproliferasjon (
p
0,01), forhøyet G
1 fase celler (
p
= 0,016) og reduserte S fase celler (
p
= 0,009). (D) etter ko-transfeksjon av siRNA-cyclin D1 med p120ctn isoformen 1 eller 3 i cellene tømt for p120ctn i 48 timer, ble ekspresjonen av cyclin E ikke økt, men var svakt redusert. Alle disse resultatene tyder på at p120ctn fremmer cellesyklusutvikling ved opp-regulering av cyclin D1, som deretter øker ekspresjon av cyclin E. Sammenligningen er gjort til kontrollgruppen av celler transfektert med ikke-målrettede siRNA eller vektor alene.
p120ctn isoform en kan opp-regulerer cyclin D1 uttrykk gjennom β-catenin
Siden vi har fått bekreftet at både p120ctn-1A og p120ctn-3A kunne up-regulere cyclin D1, ble det reist spørsmål om underliggende molekylære mekanismer var de samme mellom de to isoformer. For å besvare dette spørsmålet, p120ctn-1A og p120ctn-3A ble henholdsvis transfektert inn p120ctn slått ned SPC celler, som ble utpekt som SPC-K2. Overekspresjon av p120ctn-1A kunne forbedre β-catenin uttrykket (* p = 0,001, figur 4A), men overekspresjon av p120ctn-3A hadde i det vesentlige ingen virkning på β-catenin protein (** p = 0,769, figur 4A). Av interesse, verken p120ctn-en eller tre så ut til å ha effekt på transkripsjon av β-catenin (* p = 0,463, ** p = 0,401, figur 4B).
SPC-K2 celler ble transfektert med p120ctn -1A eller 3A henholdsvis, og ekspresjonen av β-catenin og kaiso ble målt ved western blot (A) og RT-PCR (B). Proteinet uttrykk for β-catenin betydelig høyere (*,
p
= 0,001) i cellene transfektert med p120ctn-1A cDNA, men det viste ingen signifikant endring (**,
p
= 0,769) i p120ctn-3A overekspresjon SPC-K2. Verken p120ctn-1 eller 3 kan påvirke transkripsjon av
β-catenin plakater (*
p
= 0,463, **
p
= 0,401) eller uttrykk for Kaiso. Alle sammenligningene blir gjort til den gruppe av celler transfektert med vektor alene.
Som vist i figur 5, nedregulering av β-catenin av siRNA (si-β-cat) resulterte i redusert cyclin D1 uttrykk i A549, og banket ned p120ctn (si-P120) resulterte i redusert aktiv β-catenin og cyclin D1. Videre kan aktive β-catenin og cyclin D1 nivåer gjenopprettes ved trans p120ctn-1A (SI-P120 + 1A). Men cyclin D1 uttrykk ble ikke gjenopprettet ved co-transfeksjon p120ctn-1A og siRNA -β-catenin (SI-P120 + 1A + si-β-cat), noe som tyder på at p120ctn-1A oppregulert cyclin D1 via β-catenin. Transfeksjon av p120ctn-3A i cellene utarmet av p120ctn (SI-P120 + 3A) kunne ikke opp-regulerer aktive β-catenin nivåer, men kan fortsatt betydelig gjenopprette cyclin D1 uttrykk, noe som tyder på at p120ctn-3 opp-regulerer uttrykket av cyclin D1 uavhengig av β-catenin. I tillegg, når p120ctn-3A ble ko-transfektert inn i A549 celler tømt for både p120ctn og β-catenin (si-P120 + 3A + si-β-cat), cyklin D1 ekspresjon ble betydelig økt sammenlignet med gruppen utarmet på p120ctn og β-catenin uten restituting p120ctn-3A (SI-P120 + si-β-katt); mens, ble ingen endring i aktiv β-catenin nivå observert i p120ctn og β-catenin dual utarmet celler, til tross for deres tilsynelatende restitusjon av p120ctn-3A (SI-P120 + 3A + si-β-cat). Lignende resultater ble oppnådd ved forsøk utført i SPC-celler (figur 5). To interessante funn ble registrert i vår studie. 1). Effekten av p120ctn-1A på cyclin D1 uttrykk syntes å være mer fremtredende enn for p120ctn-3A, siden ekspresjon av cyclin D1 indusert ved restitusjon av p120ctn-3A var alltid lavere enn den som fremkalles ved restitusjon av p120ctn-1A, eller til og med lavere enn ubehandlede celler; 2). Gjenopprettelsen av cyclin D1 indusert ved restitusjon av p120ctn-3A i cellene tømt for både p120ctn og β-catenin (si-p120ctn + 3A + si-β-cat) syntes å være ufullstendig sammenlignet med cellene utarmet av p120ctn alene ( si-P120 + 3A). Forskjellen mellom disse to gruppene kan forklares med det endogene β-catenin i den sistnevnte, som ble undertrykket ved synergistisk siRNA-β-catenin i den førstnevnte.
ekspresjon av aktiv β-catenin og cyclin D1 var betydelig redusert i A549 celler (β-catenin, +
p
0,001, ++
p
0,001, cyclin D1, +
p
= 0,003, + +
p
= 0,004) når β-catenin eller p120ctn ble forstyrret (si-β-katt eller si-P120). Uttrykket av aktive β-catenin (*
p
= 0,001) og cyclin D1 (*
p
0,001) opp igjen når p120ctn-1A uttrykk ble rekonstruert ved p120ctn-1A cDNA transfeksjon ( si-P120 + 1A). Co-transfeksjon av p120ctn-1A og siRNA rettet mot β-catenin (SI-P120 + 1A + si-β-cat) viste ingen endring av cyclin D1 (
Δ
p
= 0,248) uttrykk, noe som antyder at p120ctn-1A oppregulerer cyclin D1 via β-catenin. Restaurering av p120ctn-3A (si-P120 + 3A) ikke øke ekspresjonen av aktiv β-catenin (**
p
= 0,891), men kan fortsatt gjenopprette ekspresjon av Cyclin D1 (**
p
= 0,001), noe som tyder på at p120ctn-3 opp-regulerer uttrykket av cyclin D1 uavhengig av β-catenin. Co-transfeksjon av p120ctn-3A og sirnas målrettet mot p120ctn /β-catenin (si-P120 + 3A + si-β-cat) kunne gi en betydelig økning cyklin D1 ekspresjon i A549-cellelinje sammenlignet med gruppen av p120ctn /β-catenin siRNA transfeksjon alene (SI-P120 + si-β-cat,
ΔΔ
p
0,01), mens co-transfeksjon av p120ctn-3A synes å ha noen innvirkning på nivåene av aktive β -catenin. Lignende resultater ble oppnådd i SPC-celler. Merk, selv om cyclin D1 uttrykk gjenopprettes ved restitusjon av enten p120ctn 1A eller p120ctn 3A, er redningen effekten mer fremtredende ved p120ctn 1A enn ved p120ctn 3A. Forskjellen mellom den gruppen Si-P120 + 3A og gruppen Si-P120 + 3A + si-β-katt kan forklares ved en effekt av endogen β-catenin i førstnevnte. Denne effekten av endogen β-catenin kan også ses i forskjell mellom Si-P120 og P120 + si-si-β-cat i begge cellelinjer. En synergistisk effekt som resulterer i ekstra reduksjon i både β-catenin og cyclin D1 kan sees i den sistnevnte gruppen.
β-catenin ble observert fordeling i A549 og SPC-celler i både kjernen og cytoplasmaet i henhold konfokal lasermikroskopi. Dens signal ble vesentlig svakere i tilsvarende subcellulære soner når p120ctn ble oppbrukt. Overekspresjon av p120ctn-1A resulterte i en sterkere β-catenin signal. I kontrast, har p120ctn-3A ingen merkbar effekt på uttrykk for β-catenin (figur S6).
For å teste funksjonen til disse to isoformer videre, vi tilført to delesjonsmutanter av p120ctn-1, M1 og M2 i den p120ctn utarmet A549 cellen (figur 6). Resultatene viste at M1 kan oppregulerer β-catenin, men M2 kunne ikke, noe som tyder på at N-56-101 aminosyrerester fra p120ctn-en er essensiell for opp-regulering β-catenin. Derfor kan det være på grunn av delesjon av N-56-101 aminosyrerester for p120ctn-3 for å svikte for å regulere nivået av β-catenin protein.
to delesjonsmutanter av p120ctn-1, M1 og M2 ble transfektert i p120ctn utarmet A549 celler. Resultatene viste at M1 kan opp-regulere β-catenin (***
p
0,001), mens M2 kunne ikke (****
p
= 0,175). M1 kan opp-regulerer uttrykket av cyclin D1 (***
p
0,001), men M2 kunne ikke (****
p
= 0,906). Derfor kan det være på grunn av delesjon av N-56-101 aminosyrerester for p120ctn-3 for å unngå å regulere β-catenin. Alle sammenligningene blir gjort til gruppen av celler ko-transfektert med vektor alene.
p120ctn isoform 3 kan opp-regulerer cyclin D1 uttrykk ved å regulere kjernekraft /cytoplasma shuttle av Kaiso
for å teste om Kaiso har en rolle i å regulere ekspresjon av cyclin D1, vi transient transfektert Kaiso inn i A549-celler, som uttrykker bare en mindre mengde av Kaiso. Kaiso overekspresjon førte til redusert cyclin D1 og cyclin E uttrykk (Figur 7A og figur S7A). Tilsvarende, når Kaiso ble slått ned av siRNA, ble det forbedrede cyklin D1 og cyclin E ekspresjon i SPC-celler som uttrykker relativt høye nivåer av Kaiso (figur 7B og fig S7b).
(A) Western blot analyser vise den økte ekspresjon av Kaiso i A549-celler transfektert med Kaiso cDNA. Kaiso overekspresjon bemerkelsesverdig nedregulert ekspresjon av Cyclin D1 (p = 0,000) og Cyclin E (p = 0,003). (B) Western blot analyser viser redusert uttrykk for Kaiso i SPC celler transfektert med Kaiso siRNA. Kaiso forstyrrelser betydelig økt ekspresjon av Cyclin D1 (p = 0,001) og Cyclin E (p = 0,012). Totalt funn tyder på at Kaiso kunne regulere uttrykk for cyclin D1 og cyclin E. (C) Chromatin immunoprecipitation (chip) analysen bekreftet Kaiso monoklonalt antistoff kunne utløse den cyclin D1 genet promoter fragmentet inneholder KBS. Kaiso kan binde seg til KBS av cyclin D1 promoter. Alle sammenligningene blir gjort til gruppen av celler transfektert med vektor alene
Ved hjelp av BLAST å finne den cyclin D1 promotersekvensen. (GenBank: AY439218.1), identifiserte vi den spesifikke Kaiso bindende sekvens (KBS , TCCTGCNA), som ligger i størrelsesorden -1059 bp til -1066 bp. Brikken analysen var så gjennomført og viste at Kaiso var assosiert med KBS på cyclin D1 arrangøren i både A549 og SPC celler (figur 7C).
Samtidig immunoprecipitation ble utført etter cellefraksjonering. Analysene viste at det monoklonale antistoff p120ctn effektivt kunne utfelles Kaiso protein både i cytoplasma og cellekjernen, mens den spesifikke p120ctn-1, 2 monoklonale antistoffer (6H11) kunne ikke gjøre dette (figur 8A og B). Når vi gjentok ko-immunpresipitasjon etter overekspresjon av p120ctn isoformer 1 og 3, henholdsvis, ble det vist at overekspresjon av p120ctn-3A ført til mer Kaiso protein utfelt ved p120ctn monoklonale antistoff, men det var ingen endring etter overekspresjon av p120ctn-1A sammenlignet med kontrollen. Når den spesifikke p120ctn-1, 2 monoklonale antistoffer (6H11) ble brukt, Kaiso kan fortsatt ikke utfelt etter p120ctn-1A betydelig høyere (figur 8C). Siden det er i hovedsak p120ctn isoform 1 og 3 i begge lungekreft cellelinjer, tenkte vi at Kaiso kan binde seg til p120ctn isoform 3, men ikke til p120ctn isoform en in vivo gitt de nevnte resultater.
(A og B) Co-immunoutfellingsstudier analysene viste at p120ctn monoklonalt antistoff (nedre panel av kolonnen til venstre i figur 8A), men ikke spesifikt p120ctn-1,2 monoklonalt antistoff (6H11) (nedre panel av høyre kolonne i figur 8A), kan effektivt å felle ut Kaiso protein både i kjernen og cytoplasma (figur 8B). Imidlertid kan Kaiso monoklonale antistoffet ikke effektivt utfelles p120ctn (øvre panel av midtre kolonne i figur 8A). (C) Co-immunoprecipitation med tilstrekkelig p120ctn mAb etter overekspresjon av p120ctn-1 eller 3 isoform viste at overekspresjon av p120ctn-3 førte til mer Kaiso protein utfelt i A549 celler. Ingen forandring ble registrert da p120ctn isoform 1 ble overuttrykt, sammenlignet med kontrollen. Spesifikk p120ctn-1, 2 monoklonale antistoffer (6H11) kunne ikke utløse Kaiso når p120ctn isoform en betydelig høyere. Legg merke til tilstedeværelsen av p120ctn etter samutfelling med 6H11 men fravær av kaiso i utfellingen, noe som tyder det ikke er noen signifikant interaksjon mellom P120 isoform 1, 2 og kaiso. Siden det er i hovedsak p120ctn isoformer 1 og 3 i begge lungekreft cellelinjer, tenkte vi at Kaiso kan binde seg til p120ctn isoform 3, men ikke å p120ctn isoform en in vivo.
Kaiso er hovedsakelig lokalisert i cytoplasma av SPC-celler som uttrykker relativt høye nivåer av p120ctn. I motsetning til nesten alle Kaiso proteiner er til stede med atomfordeling i SPC-K2-celler, som har p120ctn tømt. Ulike effekter av to p120ctn isoformer på Kaiso subcellulære lokalisering ble undersøkt etter restitusjon av to isoformer henholdsvis i SPC-K2 celler. Restaurering av p120ctn isoform 3 ved transfeksjon av p120ctn-3A indusert Kaiso er cytoplasma distribusjon, mens Kaiso forble hovedsakelig i kjernen av SPC-K2 celler når p120ctn isoform 1 ble gjenopprettet ved transfeksjon av p120ctn-1A (figur S8A). På lignende måte ble Kaiso hovedsakelig er lokalisert i kjernen av A549-celler, som uttrykker bare en mindre mengde av p120ctn. Overekspresjon av p120ctn-1A ikke vesentlig endre fordelingen av Kaiso, mens overekspresjon av p120ctn-3A resulterte i Kaiso eksport fra kjernen (figur S8B). Disse funnene tyder på at et høyt nivå av p120ctn-3A kan være i stand til å fremme kjernefysisk eksport av Kaiso, men p120ctn-1A synes ikke å ha denne funksjonen.
Videre, når A549 celler transfektert med p120ctn-3A ble inkubert med LMB å blokkere atom eksport av p120ctn isoform 3, ble Kaiso notert til å være innesperret i kjernen sammen med p120ctn isoform 3. Tilsvarende overekspresjon av p120ctn-3A ved trans NLS-p120ctn-3A, en p120ctn-3A kjernefysiske mål lokalisering plasmid, inn SPC-K2 celler resulterte i en fordeling av Kaiso hovedsakelig i kjernen (figur S8B).
Vi ytterligere bekreftet cytoplasma og kjernekraft distribusjon av p120ctn og Kaiso ved Western blotting etter cellefraksjonering (figur 9A ). Resultatene var i samsvar med det som ble observert i immunfluorescens forsøkene beskrevet ovenfor.
(A) Transfeksjon av p120ctn-3A i A549 celler betydelig økt Kaiso i cytoplasma (CYTO, *, p = 0,000) og redusert Kaiso i kjernen (NE, *, p = 0,000). Men ingen signifikant forskjell på subcellulære lokalisering av Kaiso ble funnet mellom p120ctn-1A overekspresjon celler og kontrollceller (CYTO, **, p = 0,135, NE, **, p = 0,774). Disse resultater antyder at et høyt nivå av p120ctn-3A kan være i stand til å fremme den kjernefysiske eksport av Kaiso, men p120ctn-1A synes ikke å ha denne funksjonen. Inkubere cellene transfektert med p120ctn-3A med LMB eller trans NLS-p120ctn-3A i A549 celler økte atom p120ctn-3A (*, p = 0,000, eller +, p = 0,000) og kjernekraft Kaiso (NE, +, p = 0,000 eller ++, p 0,001), men redusert cytoplasmiske Kaiso (CYTO, +, p = 0,000 eller ++, p = 0,002) sammenlignet med celler med bare overuttrykt p120ctn-3A, noe som tyder på at den kjernefysiske eksport av Kaiso er sannsynlig å være p120ctn-3-avhengig. (B) p120ctn-1A overekspresjon ikke endre bindingen av Kaiso til KBS på cyclin D1 arrangøren, mens p120ctn-3A overekspresjon betydelig redusert binding av Kaiso til KBS på cyclin D1 promoter.
noen interessante resultater ble observert i senere chip analyser. Overekspresjon av p120ctn-3A betydelig redusert binding av Kaiso til KBS, mens overekspresjon av p120ctn-1A ikke endret binding (Figur 9B).
I sammendraget, de ovennevnte funn tyder på at p120ctn-3A sannsynlig opp- regulere cyclin D1 ved å tilrettelegge atom eksport av kaiso, og dermed avskaffe den negative effekten av Kaiso på cyclin D1 genuttrykk.
Diskusjoner
Vi viste at uttømming av p120ctn i A549 og SPC celler, som viser ingen membranøs p120ctn lokalisering, resulterte i økte celler i G1 fase og redusert celler i S-fasen, så vel som redusert celleproliferasjon, noe som tyder på p120ctn kan påvirke cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon. Siden redusert ekspresjon av cyclin D1 og cyclin E ble observert i p120ctn utarmet celler, ble det antatt at p120ctn kunne regulere cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon ved å forandre ekspresjon av cyclin D1 og cyclin E, de grunnleggende modulatorer av G0 /G1-S sjekkpunkt [13]. Nicolas T. et al. rapportert at p120ctn isoform 3 kan påvirke cellesyklus og celleproliferasjon ved å stabilisere cyclin E [4]. I kontrast til våre data tyder på en annen mekanisme av det faktum at øket ekspresjon av cyclin E tilsvarte oppregulering av cyclin D1 i cellene tømt for p120ctn men replete av enten p120ctn-1A eller 3A. I tillegg, når vi slås ned cyklin D1 ved siRNA i cellene utarmet av p120ctn, ekspresjonen av cyclin E ble ikke økt, men noe langsommere, selv om p120ctn isoformen 1 eller 3 ble tilsynelatende gjenopprettet ved ko-transfeksjon av enten isoformen DNA-plasmid. Et lignende fenomen ble observert når cyklin D1 ble blokkert av monoklonalt antistoff ruge (100 ng /ml, 48 t) i p120ctn rekonstituerte celler, noe som tyder på en sentral rolle av cyclin D1 i regulering cyclin E ekspresjon av enten p120ctn isoformen en eller isoform 3. Videre når oversettelse av cyclin D1 mRNA i A549 ble avbrutt av siRNA, både transkripsjon og proteinnivåer av cyclin E var tilsvar nedregulert, noe som tyder p120ctn kanskje ikke bare stabil cyclin E protein som tidligere rapportert, men også fremme transkripsjon av cyclin E, antagelig via en forbedret uttrykk for cyclin D1.
dataene i denne studien viste både p120ctn isoform 1 og 3 kan opp-regulerer cyclin D1 uttrykk, selv om det ikke har blitt helt klarlagt hvordan de ulike p120ctn isoformer, spesielt isoform 3 , oppnå denne funksjonen. Vår undersøkelse viste at p120ctn isoform en kunne oppregulerer ekspresjonen av β-catenin, spesielt å øke den aktive formen av β-catenin, mens isoformen 3 kan interagere med Kaiso. Selv p120ctn isoform 1 ble overuttrykt i A549 celler transfektert med p120ctn-1A, forble p120ctn-1 /Kaiso kompleks uoppdaget, noe som tyder på et lavt nivå av p120ctn isoform 1 i A549 er ikke årsaken til dette undetectable proteinkompleks. Dermed blir det stilt spørsmål om hvorfor isoform en ikke kunne samhandle med Kaiso og hvorfor isoform tre kunne ikke opp-regulerer β-catenin. Vi antok at den funksjonelle forskjellen kan være på grunn av de strukturelle variasjoner av disse to isoformer ved N-terminus. Den menneskelige CTNND1 genet består av 21 eksoner og koder potensielt opptil 48 protein isoformer grunn av flere alternative inter- og intra exonic spleise hendelser [14]. Humane isoformer, betegnet 1 til 4, skiller seg fra hverandre i startkodonet anvendes. Flere domener er blitt identifisert i p120ctn, inkludert kveilet spiral domene som bare finnes i isoform 1. Faktisk p120ctn isoformen en er lengre enn p120ctn isoform 3 av 101 aminosyrerester i den N-terminale ende [14] – [15]. For å svare på de to spørsmålene ovenfor, bygget vi to mutanter av p120ctn isoform en med avkortede peptidsekvenser på N-terminalen (M1, M2).
Våre data tyder på at det første sletting av N-terminale 56 til 101 (N-56-101) aminosyrerestene i p120ctn isoform 3 kan muligens forklare mangelen på regulerende virkning på β-catenin, mens p120ctn isoform 1, som har en intakt N-terminale domene, viste en positiv regulerende effekt (figur 6); for det andre, eksistensen av N-1-55 aminosyrerester, som danner en sammenrullet kveil domene, i p120ctn isoformen en dominant kan hindre den fra å binde seg til Kaiso (figur S9), selv om N-56-101 aminosyrerester kan spille en mindre rolle i deres interaksjon.
i denne studien, viste vi en økt aktiv form for β-catenin uten endring på karakterutskriften nivå i cellene med overekspresjon av p120ctn isoform 1A. Det funn er i overensstemmelse med det som tidligere er beskrevet i litteraturen. Det har blitt rapportert at in vivo-betingelser, p120ctn isoformen en direkte eller indirekte interagerer med noen av de sentrale proteiner kjent for å regulere β-catenin stabilitet, for eksempel Axin og GSK-3, i tillegg, deler den med p-catenin de samme reguleringsmekanismer av metabolsk stabilitet [16]. Overekspresjon av p120ctn isoform 1 kan oppta flere bindingssteder på destruksjons-komplekser som inneholder Axin og GSK-3β og, som et resultat, forårsaker redusert nedbrytning av β-catenin ved å erstatte det fra destruksjons-komplekser. Bindingsstedene for p120ctn med GSK-3β og CK1α er lokalisert i den N-terminale domenet av p120ctn, og dermed den p120ctn isoformen ett protein, som har det fullstendige N-terminale domene, ville bli utsatt for regulering av destruction- komplekse [16]. Funnene i denne studien tyder på at jo mer spesifikt domene, nettopp de N-56-101 aminosyreresiduer, kan være involvert i nedbrytningen av p120ctn isoform 1. I tillegg p120ctn-en M1 konstruert i denne studien er strukturelt lik p120ctn isoform 2 og også viste oppregulering av β-catenin (figur 6), noe som tyder på at p120ctn isoform 2 kan også kombinere med GSK-3β og CK1α og reguleres av ødeleggelse-komplekset.
den kveilet spiral domene
