Abstract
Bakgrunn
Vi har observert unormal HOXB7 uttrykk i esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) tidligere. Denne studien var å evaluere den prognostiske betydningen av HOXB7 og avdekke mulig mekanisme.
Metoder
Immunohistochemistry ble brukt til å bekrefte unormal uttrykk for HOXB7 i ESCC. Den prognostiske betydningen av HOXB7 uttrykk ble analysert i to uavhengige kohorter. RNAi ble brukt til å etablere to stabile HOXB7-knockdown cellestammer. CCK8 assay, cellevekstkurve analyse, kolonidannelsesbestemmelsen, strømningssyklus analyse og tumorgenisitet i nakne mus-analysen ble anvendt for å undersøke effekten av HOXB7 på proliferasjon in vitro og in vivo.
Resultatene
immunhistokjemi bekreftet unormal uttrykk for HOXB7 i ESCC sammenlignet med paracancerous slimhinnen (18/23 vs 9/23, p = 0,039). HOXB7 ekspresjon ble positivt korrelert med T stadium, lymfeknutemetastase og TNM stadium. Median overlevelse for pasienter med høyt HOXB7 uttrykk var betydelig kortere enn med lav uttrykk (45 måneder kontra 137 måneder, p = 0,007 for kohort 1, 19 måneder kontra 34 måneder, p = 0,001 for kohort 2). Multivariat overlevelsesanalyse viste at HOXB7 uttrykk var en annen uavhengig prognostisk faktor (HR [95% CI] = 0,573 [0,341 til 0,963], p = 0,036 for kohort 1; HR [95% CI] = 0,543 [0,350 til 0,844], p = 0.024 for kohort 2). Eksperimenter in vitro og in vivo viste at etter knockdown av HOXB7, spredning raten falt, veksten ned, koloni-formasjon evne redusert, G1-fasen arrestasjonen skjedde og tumorgenisiteten redusert bemerkelsesverdig.
Konklusjoner
HOXB7 kan fremme kreft celle spredning og kan være en uavhengig prognostisk faktor for pasienter med ESCC
Citation. Li H, Shen LY, Yan WP, Dong B, Kang XZ, Dai L, et al. (2015) deregulert HOXB7 Expression Spår dårlig prognose for pasienter med Esophageal Plateepitelkarsinom og Regulerer Cancer Cell Proliferation in vitro og in vivo. PLoS ONE 10 (6): e0130551. doi: 10,1371 /journal.pone.0130551
Academic Redaktør: Nikki Pui Yue Lee, The University of Hong Kong, Hongkong
mottatt: 27 januar 2015; Godkjent: 21 mai 2015; Publisert: 15 juni 2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Foreløpig er spiserørskreft en av de vanligste kreftformen i verden, og esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) er den vanligste patologiske typen i den kinesiske befolkningen [1, 2]. Selv om kirurgi dominerte tverrfaglig behandling har betydelig avansert i de siste to tiårene med hensyn til diagnose og behandling av ESCC, og resultatet av behandlingen er blitt forbedret, er det langtidsoverlevelse fremdeles utilfredsstillende [3]. En av de effektive tiltak for å bedre total overlevelse innebærer identifisering av kliniske biomarkører med prognostisk betydning for å veilede behandling. HOX-gener er en gruppe av gener som regulerer embryonal utvikling. Familien, med 39 medlemmer, er delt inn i fire grupper, nemlig A, B, C og D, som er plassert på fire forskjellige kromosomer [4, 5]. HOX-gener koder for en familie av transkripsjonsfaktorer, og deres unormal ekspresjon er ofte forbundet med sykdommer, således stadig større oppmerksomhet i kreftforskning [6, 7]. Tidligere studier i utviklings biologi har vist at HOXB7 normalt uttrykkes i utviklingen av humane spiserør [8]. Blant de 39 Hox-genene ble undersøkt i vår forrige undersøkelse, åtte ble uttrykt bare i ondartet vev fra ESCC pasienter, men ikke i de sammenkoblede tilstøtende normalt vev, inkludert HOXB7 med 58,3% positive uttrykk hastighet [9]. Derfor hypotese vi at HOXB7 spilt en spesiell rolle i forekomst og utvikling av ESCC og kan være et nyttig molekylær markør for å forutsi prognose og selv veilede behandling. Så langt vi kjenner til, er det sjelden studier på HOXB7 uttrykk og prognose i ESCC involverer en stor utvalgsstørrelse, og ingen in vivo og in vitro studier diskutere den underliggende mekanismen. Derfor denne studien forsøkte å undersøke prognostisk betydning og funksjonell mekanisme HOXB7 i ESCC vev.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
All forskning som omfatter mennesker deltakere ble godkjent av etiske komiteer i Beijing Cancer Hospital, Kina, og utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke er innhentet fra samtlige deltakere.
Pasienter og vevsprøver
For å validere den høye uttrykk for HOXB7 i ESCC vev rapportert i våre tidligere studier [9], ble 23 ESCC pasienter rekruttert og parafin-embedded tumor og paret noncancerous vevssnitt ble hentet
for å undersøke sammenhengen av HOXB7 protein uttrykk med prognosen for pasienter med ESCC ble to uavhengige studiekohorter inkludert.
The kohort I.
Vår forskningsgruppe etablert en prospektiv database for spiserørskreft siden januar 2000 og 1249 tilfeller med esophagectomy utført av en enkelt-kirurg team (Dr. KN Chen) har blitt fortløpende samlet. I denne studien inklusjonskriteriene var som følger: pasientene som ble patologisk diagnostisert med ESCC og gjennomgikk radikal esophagectomy uten induksjonsbehandling før operasjon mellom januar 2000 og desember 2011. Totalt 177 tilfeller møtte kriteriene (tabell 1). Den syvende utgaven av TNM staging system (AJCC og UICC, 2009) ble brukt til å klassifisere pasientene.
The kohort II.
kohort II inkluderte 103 pasienter som ble patologisk diagnostisert med ESCC og gjennomgikk radikal esophagectomy av flere kirurger uten induksjonsbehandling før vår prospektive database etablert 1996-2002 (tabell 1). Dataene ble retrospektivt samlet i henhold til pasientens journal uten potensielle data. TNM staging system for UICC, 1987 ble brukt til å evaluere pasienter.
Oppfølgings metoder
De oppfølgingsdata for kohort Jeg ble samlet inn fra vår prospektive database. Etter operasjonen ble polikliniske oppfølgingsbesøk gjennomføres en gang i hver 3 måneder i de første 2 årene, en gang i hver 6 måneder 2-5 år, og en gang i hvert år etter 5 år. Den total overlevelse ble definert som tiden fra dato for operasjonen til død eller siste oppfølging. Den siste oppfølgings sjekkpunkt var august 2013. Den totale oppfølging hastighet for vår database var 96,1%: 80,2% polikliniske besøk og 15,9% telefon eller brev oppfølging. Telefon eller brev oppfølging hovedsakelig involvert de pasientene uten å besøke til poliklinikken på timeplanen. Polikliniske oppfølging involvert registrering av symptomer og flere eksamener inkludert CT, øvre gastrointestinal bildebehandling, mage- og bilateral supraclavicular ultralyd og gastroskopi, om nødvendig. Etter 2010, noen pasienter gjennomgikk positronemisjonstomografi CT (PET-CT) undersøkelser.
De oppfølgingsdata for kohorten to ble hentet fra gjennomgang av pasientens journal. Den siste oppfølgingstiden var februar 2008 og oppfølging rente var 80%.
Cellekulturer
Den menneskelige ESCC cellelinjer EC109 og KYSE150 ble hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. EC109 ble dyrket i DMEM-medium (Gibco) supplementert med 10% FBS (Gbico) ved 37 ° C i en 5% CO2-luftatmosfære. KYSE150 var dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) med 10% FBS (Gbico) ved 37 ° C i en 5% CO2 luft atmosfære.
Vektorer konstruksjon og lentiviral infeksjon
For nedregule av HOXB7, fire kort hårnål (shRNA) sekvenser (GCCGAGTTCCTTCAACATGCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/ACCTGTTCTGTAGCTTTCTGG) ble klonet inn pGLV-H1-GFP-puro. Egge sekvens (ACTACCGTTGTTATAGGTG) ble anvendt som kontroller. Lentiviral vektor konstruksjon og emballasje ble utført av GenePharma Company (Shanghai, Kina). Celler ble infisert med lentivirus 50ul filtrert supernatant (1 x 10
9 TU /ml) i hver brønn av 24-brønns plate med nærvær av 8 mikrogram /ml polybren (Millipore). Stabile transfekterte celle stammer som uttrykker shHOXB7 ble valgt med 2 ug /ml puromycin.
RNA ekstraksjon, RT-PCR og real-time PCR
Total RNA av celler ble hentet av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad , California). RNA ble revers transcripted til cDNA ved RT-PCR (Fermentas Life Science). Kvantitativ Realtime PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn Realtime PCR Maser Mix (Applied Biosystems) for å detektere mRNA uttrykk nivåer av målgener. GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat) ble anvendt som endogene kontroll. Sekvensen av primerne som brukes er som følger: for HOXB7, forover 5′-TATGGGCTCGAGCCGAGTT- 3 «, revers 5′-GGCCTCGTTTGCGGTCAGT -3′; for GAPDH, frem 5»-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 «, omvendt 5’GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3». Alle analyser ble utført i triplikat i henhold 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems) og gjentatt tre ganger i henhold til produsentens protokoll. Evaluering av relative ekspresjon ble beregnet ved å sammen CT (terskelsyklus) -metoden. 2
-ΔΔCt referert til folden av mRNA uttrykk av målet genet i forhold til GAPDH uttrykk i samme prøve.
Western blotting
Totalt celle ekstrakter ble utarbeidet i en × SDS ladningsbuffer, separert ved SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner, så immunologisk med muse-monoklonalt anti-HOXB7 antistoff (Abnova) som primært antistoff. Geit-anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugert IgG ble brukt som et sekundært antistoff. Immunoreaktivitets ble oppdaget med en forbedret kjemiluminescensreaksjon kit (GE Healthcare). Som et lastekontroll, glyceraldehyde- 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble påvist ved anvendelse av et monoklonalt antistoff fra mus (Abcam).
Immunhistokjemi
Etter rutine deparaffinization og hydrering, vevssnitt ble behandlet med 3- % hydrogenperoksyd og deretter oppvarmet i citrat-løsning (pH = 6,0) for antigen gjenfinning. Den HOXB7 antigen-antistoffreaksjon fant sted over natten ved 4 ° C etter geiteserum blokkering. Mus monoklonalt anti-HOXB7 antistoff (Abnova) ble benyttet ved 1 pg /ml (1: 1000) og geite-anti-muse-biotin-konjugert IgG ble anvendt som sekundært antistoff. De immunhistokjemiske signaler ble scoret av to uavhengige observatører. Poengene ble beregnet som antall fargede celler dividert med det totale antall kreftceller. Fem representative høy effekt felt (X400) per lysbilde ble beregnet og resultatene ble i gjennomsnitt. Utvetydig farging av kjernen i 25% av kreftceller ble ansett høy uttrykk
CCK8 analyse og cellevekstkurve
celleproliferasjon ble bestemt av Cell Counting Kit-8 farging (Dojinodo. , Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble sådd på 96-brønners plater ved initial densitet på 5 x 10
3 celler /brønn. På hvert tidspunkt ble cellene farget med 10 ul CCK8 fargestoff i 90 ul dyrkningsmedium i 2 timer ved 37 ° C. Absorbansen ble målt ved 450 nm med 650 nm som referansebølgelengde. Resultatene er bekreftet av manuelle celler. Celler ble sådd på 24-brønners plater ved initial densitet på 5 x 10
3 celler /brønn og samlet på annen tid og telt ved bruk av en hematocytometer. Alle forsøkene ble utført in triplo.
kolonidannelse assay
Cellene ble trypsinisert og sådd ut i 6-brønns plater (300-500 celler /brønn) og dyrket i 3 uker. Koloniene ble farget med Giemsa beis i 30 min etter fiksering med 4% paraformaldehyd i 15 minutter. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
cellesyklusanalyse
Cell syklus fordeling ble undersøkt ved strømningscytometri. 1×10
6 celler ble samlet inn og faste med 70% kald etanol. Etter fiksering ble det PI-fargeløsning med RNase A (BD Biosciences) ble tilsatt. Etter 30 min av inkubasjon ble farget prøvene kjøres på FACScan cytometri (BD Biosciences), og data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (Tre stjerne).
tumorigenesis i nakne mus
Dyreforsøk var godkjent av etiske komiteer i Beijing Cancer Hospital, Kina, og gjennomføres i samsvar med guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Musene ble opprettholdt under omsorg av Forsøksdyravdelingen i Beijing Cancer Hospital, Kina. Stabile shRNA transfekterte celler (1 x 10
6) i 100 ul serumfritt DMEM /RPMI 1640 ble injisert s.c. inn i den høyre flanken av 4 til 6 uker gamle Balb /C-atymisk nakne mus. Alle mus ble plassert og holdt under spesifikke patogenfrie forhold. Xenografttumorer ble samlet og musene ble avlivet ved cervikal dislokasjon innen 4 uker. Svulster ble skåret ut, målt ved et lysbilde caliper og vektet med en elektronisk analytisk balanse. Tumorvolumer ble beregnet ved hjelp av følgende formel:. Tumor volum = [(lengde) x (bredde) x (bredde)] /2. Alle forsøkene ble utført i henhold til institusjonelle standard retningslinjer fra Peking University School of Oncology for dyreforsøk
statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 19.0 statistiske programvarepakken. Alle in vitro forsøk ble utført minst tre ganger in triplo. Sammenligninger mellom grupper for statistisk signifikans ble utført med en 2-tailed uparede Student t-test. Barer og feil barer på grafer samt data i teksten representerer gjennomsnitt ± SD. Sammenligninger mellom kreft og sammenkoblede normalt vev ble testet ved hjelp av Wilcoxon signert rank test. Sammenhengene mellom HOXB7 uttrykk og clinicopathologic egenskaper ble testet ved hjelp av Chi-kvadrat test. Overlevelseskurver ble plottet av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log rank test. Den Cox-modellen med en trinnvis prosedyre ble anvendt for multivariabel analyse. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
uttrykk for HOXB7 ble oppregulert i ESCC sammenlignet med paret noncancerous vev
Vi har tidligere rapportert 8 av 39 Hox-gener, inkludert HOXB7 , unormalt uttrykt i ESCC vev, men ikke i noncancerous vev ved hjelp av revers transkripsjon-PCR [9]. For ytterligere å belyse uttrykk for HOXB7 protein i ESCC ble immunhistokjemi (IHC) flekk utført i tumorer og paret noncancerous vev fra ESCC pasienter. Det ble bemerket at HOXB7 protein ble hovedsakelig lokalisert i kjernen av de normale esophageal epitelceller i basal og suprabasal lag, mens i tumorene, HOXB7-positive celler fordelt vidt. Komparativ analyse indikerte at HOXB7 var signifikant oppregulert i 23 undersøkte tumorprøver (18/23) sammenlignet med tilstøtende noncancerous vev (9/23) (figur 1A, P = 0,039).
(A) representativt utvalg av paret normale vev (a, b) og ESCC (c, d). I den normale esophageal epiteliale, HOXB7 ekspresjon var hovedsakelig begrenset til kjernen av epitelceller som befinner seg i basal og suprabasal lag, mens i ESCC, ble HOXB7-positive celler i stor grad er observert i tumor (Sak nr. 53865). (B) Figur a og b, negativ kontroll, med primær antistoff erstattes med PBS (Sak nr. 40146). Figur c og d, lav uttrykk for HOXB7 i ESCC (Sak nr. 42873). Figur e og f, høy uttrykk for HOXB7 i ESCC (Sak nr. 36840). (C) Kaplan-Meier overlevelseskurve for 177 pasienter i kohort I. Median overlevelse var 45 måneder for høye uttrykk pasienter, som var vesentlig kortere enn de 137 månedene for lave uttrykk pasienter (p = 0,007). (D) Kaplan-Meier overlevelseskurve for 103 pasienter i kohort II. Median overlevelse var 19 måneder for høyt uttrykk pasienter, som var betydelig kortere enn 34 måneder for lav uttrykk pasienter (p = 0,001).
HOXB7 protein uttrykk var assosiert med kliniske egenskaper og total overlevelse
i kohort jeg ble høy uttrykk for HOXB7 protein observert i 124 av 177 (70,1%) tumorprøver (fig 1b). Chi-kvadrat test viste at uttrykket nivåer av HOXB7 protein signifikant korrelert med TNM stadium (P = 0,034), T scenen (P = 0,036) og lymfeknutemetastase (tabell 1, P = 0,042). Univariat analyse indikerte at pasienter som hadde lav HOXB7 uttrykk nivåer levde mye lenger (figur 1C, P = 0,007). Median overlevelsestid var 45 måneder for pasienter med høy ekspresjon, som var betydelig kortere enn de 137 måneder for pasienter med lav ekspresjon (tabell 2). Multivariat overlevelsesanalyse bekreftet at HOXB7 uttrykk og TNM stadium var to uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse hos pasienter med ESCC (tabell 3, HR [95% CI] = 0,573 [0,341 til 0,963], p = 0,036 for HOXB7 lav uttrykk).
i kohort II, ble den høye uttrykk for HOXB7 protein påvist i 61 av 103 (59,2%) tilfeller av svulst vevsprøver (fig 1b). Chi-kvadrat test viste at uttrykket nivåer av HOXB7 protein signifikant korrelert med TNM stadium (P = 0,001), T scenen (P = 0.000) og lymfeknutemetastase (tabell 1, P = 0,006). Univariat analyse ved anvendelse av log rank test viste at pasienter med lav HOXB7 ekspresjonsnivåer hadde en lengre median overlevelsestid enn det med høy HOXB7 uttrykket (34 mons mot 19 mons, P = 0,001) (figur 1D, tabell 2). Multivariat overlevelsesanalyse viste at HOXB7 uttrykket nivå og TNM stadium var to uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse hos pasienter med ESCC (tabell 3, HR [95% CI] = 0,543 [0,350 til 0,844], p = 0,024 for HOXB7 lav uttrykk) .
nedregulering av HOXB7 protein redusert celledeling in vitro
for å vurdere mulige rolle HOXB7 i spredning av menneskelige ESCC celler, vi først oppdaget uttrykk for HOXB7 i flere ESCC celle linjer. Real-time PCR og Western blotting-analyse viste at EC109 og KYSE150 viste relativt høy endogen uttrykk for HOXB7. Derfor valgte vi EC109 og KYSE150 cellelinjer for studier og slått ned HOXB7 uttrykk ved hjelp av RNA-interferens. Av de fire lentivirus med kort hårnål RNA, var den beste som er valgt for å etablert cellestamme med stabil knockdown av HOXB7 protein. I mellomtiden ble en lentivirus med krafse shRNA anvendt som en kontroll. Til slutt ble EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 etablert. Effekten av knockdown ble undersøkt ved real-time PCR og Western blotting. HOXB7 mRNA og protein ekspresjon ble effektivt redusert med 80% til 85% i EC109 og KYSE150 cellelinjer (figur 2A). CCK8 analyse viste at HOXB7 knockdown redusert spredning av EC109 og KYSE150 sammenlignet med kontrollceller (figur 2B; P 0,05). Manuell legemer på celler bekreftet reduksjon av spredning sett i CCK8 analysen. (Fig 2C; P 0,05). Kolonidannelse analysen viste at EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /shHOXB7 celler dannes mye mindre og mindre kolonier enn for kontrollceller (figur 2D; P 0,05).
(A) knockdown av endogen HOXB7 i bestemt shRNA -transduced stabil EC109 og KYSE150 celler, analysert ved real time PCR og Western blotting. (B) knockdown av HOXB7 hemmer celleveksten bestemt ved CCK8 assay. (C) knockdown av HOXB7 hemmer cellevekst som bekreftes av manuelle celler. (D) knockdown av HOXB7 hemmer cellevekst som viste ved kolonidannelsesbestemmelsen. Feilstolpene representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. *, P . 0,05
nedregulering av HOXB7 protein redusert tumorvekst in vivo
For å bekrefte effekten av HOXB7 på tumorigen aktivitet ESCC celler in vivo, vi utførte tumorgenese forsøk i nakne mus. Cellestammer med EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 celler ble injisert i nakne mus. Xenograft tumorer ble fjernet 4 uker etter injeksjon og ble målt og veiet. Som vist i figur 3A og 3B, tumorene dannet av EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /shHOXB7 cellene var betydelig mindre enn de i kontrollceller dannede tumorer. Den gjennomsnittlige vekt og volum av svulster i EC109 /shHOXB7 gruppen var 869 ± 295 mg og 870 ± 370 mm
3, sammenlignet med 1292 ± 453 mg og 1416 ± 472 mm
3 i EC109 /Scramble gruppe (P 0,05). Den gjennomsnittlige vekt og volum av svulster i KYSE150 /shHOXB7 gruppen var 415 ± 254 mg og 603 ± 362 mm
3, sammenlignet med 697 ± 253 mg og 1069 ± 377 mm
3 i KYSE150 /Scramble gruppe (P 0,05).
(A) Svulster som genereres ved injeksjon av EC109 /KYSE150 med stabile knockdown HOXB7 protein og kontrollceller. (B) vekt og volum av svulster fra HOXB7-knockdown-celler var relativt lavere enn de fra kontrollcellene. (C) Representative histogrammer analysert ved strømningscytometri viste cellesyklus profiler av ESCC cellene. I cellene med stabil knockdown HOXB7 protein, ble redusert celletallet ved S og G2-fasene, sammenlignet med kontrollceller. (D) Andel av celler i forskjellige faser av cellesyklusen. Feilstolpene representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. *, P . 0,05
HOXB7 akselerert cellecyklusprogresjonen
For å utforske mulig mekanisme HOXB7 fremme ESCC celleproliferasjon, testet vi cellesyklus distribusjon av flowcytometri. Som vist i figur 3C, knockdown av HOXB7 protein resulterte i G1 rest, med en økning i andelen G1 og en reduksjon i S og G2 proporsjon. Prosentandelen av celler i S og G2-fasene i EC109 /shHOXB7 gruppe var 30,18% ± 1,16% og 9,51% ± 0,23% henholdsvis, som var lavere enn i kontrollcellene (31,75% ± 0,55% og 14,36% ± 0,94%, Fig 3D, P 0,05). Den gjennomsnittlige andelen av celler i S og G2 faser i KYSE150 /shHOXB7 gruppen var 37,31% ± 1,09% og 28,70% ± 1,22% henholdsvis sammenlignet med 41,00% ± 1,32% og 30,92% ± 2,21% i KYSE150 /Scramble gruppe (Fig 3D, P 0,05). Disse resultatene indikerte at HOXB7 kan akselerere G1 til S-fase overgang i ESCC cellelinjer, noe som bidrar til ESCC celleproliferasjon.
diskusjon
Ideelle tumor biomarkører ha god prognostisk verdi og kan lede klinisk praksis, og derfor har jakten på en verdifull prognostisk biomarkør fått hovedfokus i onkologi forskning. Blant disse har unormal ekspresjon av embryogenesen-relaterte gener i malignitet alltid fått betydelig oppmerksomhet [10]. For eksempel er forholdet mellom carcinoembryonic antigen (CEA) og tykktarmskreft og at mellom alfa-fetoprotein (AFP), leverkreft, som har blitt brukt i kliniske omgivelser. Men inntil nå, gode tumor markører for ESCC har ikke blitt identifisert for bruk i klinisk praksis. Våre tidligere undersøkelser har avdekket unormal ekspresjon av 39 medlemmer av HOX-genene på mRNA-nivå i spiserøret ondartet vev. Blant dem, åtte ble uttrykt bare i ondartet vev fra ESCC pasientene, men ikke i den sammenkoblede tilstøtende normale vev, inkludert HOXB7 [9]. Andre studien viste også at HOXB7 ikke er uttrykt i normal spiserøret, men uttrykkes på høyere nivåer på mRNA nivå i ESCC [11]. Denne studien bekreftet disse foreløpige funn. Det ble vist at uttrykket av HOXB7 var signifikant høyere i 23 prøver av ondartet esophageal vev enn i den sammenkoblede tilstøtende normal slimhinne, som tilbyr et godt grunnlag for å vurdere HOXB7 som en potensiell molekylær markør for ESCC. Siden januar 2000 har vi vært å etablere et enkelt kirurg (Dr. Chen) potensielle kreftfaren database og fortløpende rekruttert 1,249 pasienter med spiserørskreft som gjennomgikk kirurgisk reseksjon. Oppfølgingsbesøk var planlagt for alle pasienter som er inkludert i databasen før sin død. HOXB7 uttrykk i de utpakkede 177 sakene som oppfylte kriteriene ble undersøkt, og dens forhold til prognosen ble analysert. Resultatene viste at HOXB7 ekspresjon var positivt korrelert med TNM trinnet (P = 0.034), T trinn (P = 0,036), lymfeknutemetastase (P = 0,042). Median overlevelsestid for pasienter med høy HOXB7 ekspresjon var signifikant kortere enn den til pasienter med lav HOXB7 uttrykket (45 måneder sammenlignet med 137, p = 0,007). For ytterligere å bekrefte dette resultatet, gjennomførte vi en retrospektiv studie på en annen forrige kohort av pasienter med ingen potensielle data. En lignende trend ble notert i våre resultater: HOXB7 uttrykk i denne kohorten viste også en positiv korrelasjon med TNM stadium (P = 0,001), T scenen (P = 0.000) og lymfeknutemetastase (P = 0,006). Median overlevelsestid for pasienter med høy HOXB7 ekspresjon var signifikant kortere enn den til pasienter med lav HOXB7 uttrykket (19 måneder sammenlignet med 34, p = 0,001). Videre multivariat analyse med variabler som alder, kjønn, tumor beliggenhet, TNM stadium, T scenen, N scenen, og HOXB7 uttrykk viste at HOXB7 uttrykk og TNM stadium var uavhengige prognostiske faktorer i 177 pasienter rekruttert i prospektive database (HR [95% CI] = 0,573, [0.341-0.963], p = 0,036) og 103 pasienter rekruttert i en annen kohort uten potensielle data (HR [95% CI] = 0,543, [0,350 til 0,844], p = 0,024), noe som indikerer at HOXB7 hadde prognostisk verdi for pasienter med ESCC.
for ytterligere å undersøke funksjonelle mekanisme HOXB7 i forekomst og utvikling av ESCC, undersøkte vi HOXB7 uttrykk i flere ESCC cellelinjer og nominert to cellelinjer som viser høy uttrykk for HOXB7 (EC109 og KYSE150) for in vitro og in vivo studier.
Først RNA interferens teknikk ble anvendt for å etablere stabile HOXB7-knockdown cellestammer, som så ble brukt til å utføre CCK8 assay, kolonidannende hastighet assay, og cellesyklusanalyse ved strømningscytometri for å observere virkningen av HOXB7 på celleformering i ESCC. Våre resultater viste at frekvensen av celleproliferasjon ble langsommere i HOXB7-knockdown cellestammer, kolonidannelse ble redusert, forekom G1-fase arrest i ondartede celler, og andelen av celler i G1 faser økt betydelig. For ytterligere å verifisere virkningen av HOXB7 på in vivo celleproliferasjonen, anvendte vi knockdown cellestammer for å etablere tumorgenisitet i nakne mus modell og fant at den tumorgene kapasitet knockdown cellestammer var betydelig lavere enn for kontrollceller.
faktisk, feilregulering av HOXB7 ekspresjon har blitt rapportert i en rekke tumorer, inkludert brystkreft [12-14], eggstokk-kreft [15], oral cancer [16], kolorektal kreft [17], lungecancer [18] , melanom [19-21] og bukspyttkjertelkreft [22-24]. Overekspresjon av HOXB7 ble vist å være relatert til dårlig prognose i brystkreft [14], oral cancer [16], kolorektal kreft [17], lungecancer [18] og pankreatisk adenokarsinom [22, 23]. Men den kliniske betydningen av HOXB7 i ESCC er sjelden rapportert. Det var to artikler som utforsker prognostisk betydning HOXB7 uttrykk ved mRNA og protein nivå i ESCC nylig, men utvalgsstørrelsene var svært begrenset, og de gjorde ikke bekrefte sine funn i en uavhengig kohort [25, 26]. Sammenlignet med disse studiene, vi ikke bare bekreftet påliteligheten av våre funn i to uavhengige kohorter inkludert 280 tilfeller, men også studert videre for å utforske mulige funksjon HOXB7 i ESCC. Det er blitt funnet at HOXB7 kunne fremme tumorcelle-proliferasjon i andre solide tumorer [13-19, 27]. Men inntil nå var det ingen studier som undersøker hvilken rolle HOXB7 og dens underliggende mekanismer i ESCC. Basert på ovennevnte omtalte foreløpige funn, mener vi at HOXB7 er sannsynlig å bli identifisert som en prognostisk biomarkør for ESCC pasienter, og unormal HOXB7 uttrykk kan påvirke den proliferative kapasitet på cellene.
I mellomtiden, bemerket vi en positiv sammenheng mellom høyere HOXB7 protein uttrykk og regional lymfeknutemetastase. Så vi gjennomførte Transwell migrasjon analysen og Matrigel invasjonen assay, som indikerte at HOXB7 knockdown hemmet celle migrasjon og invasjon evne EC109 og KYSE150 (S1 figur; P 0,05). Men funksjonen av HOXB7 i celle invasjon og metastasering i ESCC fortsatt trenger videre leting.
De mekanismene som ligger til grunn for rollen HOXB7 i ESCC er uklart. Utforskningen av mekanismen er komplisert av det sekvenslikhet blant Hox-gener og funksjonell redundans innregnet i HOX-genet systemet [7]. Som en transkripsjonsfaktor, medierer dens virkninger HOXB7 ved å regulere transkripsjon av mål-gener. Selv om mange gener har vist seg å være direkte eller indirekte reguleres av HOXB7 i andre kreftceller, har bare noen få av dem er identifisert som direkte mål, inkludert bFGF [13, 22, 28]. HOXB7 kan direkte aktivere ekspresjonen av basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og fremme vekst av forskjellige tumorer, slik som brystkreft og melanom [13, 19, 29]. Og bFGF var blitt implisert i forskjellige biologiske prosesser, slik som proliferasjon, differensiering, overlevelse, og migrasjon [30]. HOXB7 uttrykk kan fremme cellevekst ved å utløse både intracrine og autokrine bFGF vekststimulerende trasé i eggstokkene karsinomer [15]. Ekspresjon av bFGF kan aktivere Ras-RAF-MAPK-reaksjonsveien gjennom autokrine signalkaskader ved brystkreft [12]. Det ble vist at PI3K /AKT og MAPK trasé ble aktivert av HOXB7 i tykktarmskreft, noe som kan forklare den akselerer G1-S overgang indusert av HOXB7 [17]. I konklusjonen, disse resultatene forsterket våre funn og avklart betydningen av HOXB7 i tumorigenesis. Videre studier for å identifisere mekanismer ca HOXB7 oppstrøms aktivatorer, nedstrøms mål og funksjonelle partnere ville være verdt å bedre forstå hvilken rolle HOXB7 i ESCC
Denne studien har noen begrensninger:. Kliniske data ble hentet fra den enkelt senter, utvalgsstørrelsen var ikke stor nok, og kliniske forskningsstudier var retrospektiv faktisk. Derfor, i fremtidige studier, utvalgsstørrelsen bør økes, og pasienter fra flere senter bør inkluderes for å avklare om HOXB7 kan tjene som en spesifikk molekylær prognostisk markør i ESCC. Videre er en grundig studie på de molekylære mekanismene som ligger til grunn rolle HOXB7 i å fremme spredning av ESCC celler garantert.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. HOXB7 fremmer menneskelig ESCC celle migrasjon og invasjon. Product: (A) knockdown av HOXB7 hemmer cellemigrasjon som bestemmes av Transwell migrasjon analysen. (B) knockdown av HOXB7 hemmer cellevekst som viste ved Matrigel invasjonen assay. Feilstolpene representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. *, P 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130551.s001 plakater (TIF)
S1 fil.
