Abstract
Mange cellelinjer avledet fra tumorer, så vel som transformerte cellelinjer er langt mer følsomme overfor V-ATPase-inhibitorer enn normale motstykker. De molekylære mekanismer som ligger til grunn for disse forskjeller i følsomhet er ikke kjent. Bruk av globale genuttrykk data, viser vi at de mest sensitive reaksjoner på HeLa-celler til lave doser av V-ATPase-inhibitorer omfatter gener som gir respons på nedad intracellulære jern eller avtagende kolesterol, og at følsomheten til jernopptak er en viktig determinant for V-ATPase følsomhet i flere kreftcellelinjer. En av de mest sensitive cellelinjer, melanom avledet SK-Mel-5, over-uttrykker jernet sekretoriske transportøren ferroportin og har redusert ekspresjon av proteiner involvert i jernopptak, noe som tyder på at det aktivt undertrykker cytoplasmisk jern. SK-Mel-5 celler har økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser og kan være søker å begrense ytterligere produksjon av ROS av jern
Citation. Straud S, Zubovych jeg, De Brabander JK, Roth MG (2010) Hemming av Iron Opptak er ansvarlig for Differential Følsomhet for V-ATPase hemmere i flere kreftcellelinjer. PLoS ONE 5 (7): e11629. doi: 10,1371 /journal.pone.0011629
Redaktør: Anthony Robert Hvit, Universitetet i Melbourne, Australia
mottatt: 31 desember 2009; Godkjent: 19 juni 2010; Publisert: 16.07.2010
Copyright: © 2010 Straud et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd CA095471 og CA09349 fra National Cancer Institute (NCI), 5P30 AR41940 fra National Institutes of Health (NIH) og gir i-1422 fra Robert A. Welch Foundation. Forskningen ble utført i et anlegg bygget med støtte fra Forskningsmuligheter forbedringsprogrammet Grants C06-RR15437 fra National Center for Forskning Resources (NCRR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Inhibitorer av den vacuolar-typen (H +) – ATPase (V-ATPase) er blitt undersøkt som potensielle terapeutiske midler mot kreft [1], [2] som de viser imponerende differensial cytotoksisitet for 60 cellelinjer av NCI SAMMENLIGN panel. I tillegg er cellelinjer som er transformert med onkogenene er mer følsomme overfor V-ATPase-inhibitorer enn er sperre, ikke-transformerte cellelinjer [3], [4]. Mange kreftcellelinjer oppregulerer ekspresjonen av V-ATPase-underenheter sammenlignet med normalt vev [1] og V-ATPaser antas å spille en rolle i metastase [5], [6] og chemoresistance [2], [7]. Men de grunnleggende mekanismene som bestemmer hvilke kreftceller er mest følsomme for V-ATPase-hemmere er foreløpig ukjent. Dette er viktig kunnskap, som begrenser den V-ATPase i seg selv kan hemme synaptisk transmisjon [8]. Således kan proteiner som er involvert i cellulære prosesser som er mest differensielt sensitive for hemning av V-ATPase kan bli bedre terapeutiske mål enn den V-ATPase seg selv.
V-ATPase er et stort proteinkompleks som kan transportere protoner over membraner mot en pH-gradient, og således generere det sure miljø som finnes i endocytiske organeller, Golgi-apparatet og den Trans-Golgi Nettverk [9]. Det er sammensatt av et stort, cytosoliske heksa ATPase, V
1, som er sammenføyd av flere bindinger til en integral membran kompleks, V
0. Hydrolyse av ATP ved subenheter av V
1 blir omdannet til mekanisk rotasjon i V
0 som beveger protoner fra cytosoliske til lumenal siden av membranen, hvor V
0 ligger. Aktiviteten av den V-ATPase blir styrt av flere mekanismer, slik at når demontert, V
1 ikke hydrolyserer ATP og V
0 roterer ikke og transport protoner [9]. En rekke inhibitorer av V-ATPase er kjent som har forskjellige bindingsseter [10].
I både den sekretoriske og de endocytiske trasé pH-gradienter er kritisk for mange funksjoner. Lumen av det endoplasmatiske retikulum er nøytral, og at av Golgi-komplekset er surt, og denne differansen blir brukt for å regulere binding av rømt ER anstand i det sure Golgi ved KDEL-reseptoren, som resirkulerer for å frigjøre dem i den nøytrale ER [11] . pH-verdien synker på tvers av Golgi-komplekset, slik at prohormone konvertaser aktiveres ved den sure utgangsenden av trans-Golgi-nettverk og i sekretoriske vesikler, men ikke tidligere i reaksjonsveien [12]. På en lignende måte, er mange lysosomale proenzymer er inaktive ved pH av den sekretoriske vei og aktiveres etter å ha nådd lysosomet, hvor pH-verdien er vanligvis under 5,0 [13]. I endocytoseveien blir visse ligander, slik som low density lipoproteiner (LDL), binder reseptorene ved nøytral pH-verdi på celleoverflaten og frigjøres når reseptorene kommer sure endosomer [14]. På denne måte LDL blir effektivt tatt opp av cellen og leverer sin last av kolesterol til lysosomer mens reseptoren resirkulerer til celleoverflaten for å binde ligand. Effektivt opptak av jern i celler krever også i endosomer lav pH. Transferrin, bæreren for ekstracellulær jern, har høy affinitet for jern og for dens celleoverflatereseptor på typisk ekstracellulært pH over 7,0. Transferrinreseptoren kontinuerlig internalisert og resirkulerer til plasmamembranen, som bærer transferrin til sure endosomer hvor det frigjør jern. Jern-fri apotransferrin har høy affinitet for reseptoren ved lav pH og lav affinitet ved nøytral pH. Dermed resirkulerer apotransferrin med sin reseptor tilbake til plasmamembranen hvor det er gitt ut og gjenvinner høy affinitet for ekstracellulære jern [15]. Lav pH blir også brukt for å fastslå identiteten til endocytiske organeller. Visse cytosoliske proteiner som er nødvendig for å regulere membran trafikk binder seg til det cytoplasmatiske ansiktet til endosomet membraner bare når den interne pH i organellen er sure [16]. Surgjøring av lysosomer er også nødvendig for fremgangsmåten ifølge autophagy [17]. Selv om det normalt uttrykt ved lave nivåer på plasmamembranen, bortsett fra i visse syre-utsondrende celler, er V-ATPase-over-uttrykt ved plasmamembranen av enkelte kreftceller, og kan spille en rolle som regulerer cytosolisk pH [5], [6], [18 ]. Noen eller alle av disse essensielle funksjonene kan være mer utsatt for hemming av den V-ATPase spesielt kreftcellebakgrunn.
For å undersøke grunnlaget for forskjellig sensitivitet av kreftceller til inhibitorer av den V-ATPase, vi har gjort bruk av den observasjon at cellene ofte reagerer på stress ved opp-regulering av kritiske komponenter i veier som er avfølt til å være sviktende, som for eksempel responsen til svikt i proteinfolding i det endoplasmatiske retikulum [19]. Vår hypotese er at en mild inhibering av den V-ATPase vil avdekke de mest sensitive biologiske funksjoner til dette enzym, som blir angitt med gener som først øker transkripsjon i respons til inhibering. Teste denne hypotesen har vi observert at veier av jern regulering er mest følsomme for delvis hemming av V-ATPase i HeLa-celler, og at noen kreftcellelinjer er mest følsomme for V-ATPase-hemmere kan gjøres mye mer motstandsdyktig ved å legge eksogene jern kulturmediet. Dette antyder at deler av jern metabolisme eller transport kan være kandidater som terapeutiske mål i visse kreftformer, og disse kreftformene kan identifiseres gjennom deres følsomhet overfor V-ATPase-inhibitorer eller endret ekspresjon av jern transportproteiner.
Resultater
for å finne ut hvilke metabolske banene ble understreket av lave doser av V-ATPase-hemmere, må vi først bestemt responsen dosen til to forskjellige hemmere av V-ATPase på flere cellelinjer. Vi ønsket å finne en konsentrasjon av hver inhibitor som ville vise en effekt på vekst, noe som indikerer at celler reagerer på stimulus, men som ikke var så giftig at reaksjonen skulle bli forhindret eller vanskeliggjort av at celler dør i løpet av eksperimentet. Cellelinjene vi testet, hadde IC50s til bafilomycin A som varierte fra 10 nM til mer enn 10 um, og vi valgte moderat sensitiv cellelinje HeLa (IC50 = 150 nM) for våre eksperimenter fordi dens forholdsvis grunne doserespons gjort for mer ensartet veksthem eksperimenter, noe som tyder på at genekspresjon eksperimentene vil også være mer reproduserbar. Vi valgte også å sammenligne to hemmere av V-ATPase som virker gjennom forskjellige mekanismer [20], bafilomycin A (Baf) og phenylsalicylihalamide (LX1077), for å kontrollere for mulige off-target effekter av hver forbindelse. Konsentrasjoner av hver forbindelse som hemmet cellevekst ca. 25% etter 48 timer (figur 1) ble valgt for genekspresjonen eksperimenter. HeLa-celler ble dyrket over natten og deretter prøver ble behandlet med 15 nM Baf til 6, 12 eller 24 timer, eller 200 nM LX1077 etter 12 og 24 timer, og RNA ble høstet og behandlet for analyse av microarray. Som kontroller ble prøver av HeLa-celler behandlet i det samme intervallet med 0,1% DMSO (sluttkonsentrasjonen av fortynningsmidlet for Baf eller LX1077 i eksperimentelle prøver), ble kjørt parallelt med hver eksperimentell tilstand. Hver eksperimentelle tilstand ble gjentatt i et uavhengig forsøk utført på en annen dag.
HeLa-celler ble dyrket i medium inneholdende bafa eller LX1077 ved konsentrasjonene vist i 48 timer og celletall ble beregnet. Dataene er normalisert til kontrollene behandlet med 0,1% DMSO. Dataene er gjennomsnitt av triplikate prøver og feil barer er SEM.
To store trasé for opptaket av næringsstoffer i cellene avhengig av surhetsgraden i endosomer leveres av V-ATPase. Inhibering av den V-ATPase vil interferere med levering av jern inn i cellen ved å hindre frigjøring av jern fra transferrin og også forhindrer opptak av kolesterol ved å hemme frigjøring av LDL fra dets reseptor. Derfor behandlet vi HeLa-celler for 6 eller 12 timer med deferoksamin (DFO) til chelat jern og separat med medium som mangler LDL for å etterligne inhibere opptak av eksogent kolesterol via LDL-reseptoren. Kontrollene ble matchet prøvene dyrket i normal dyrkingsmedium. Disse prøver ble behandlet for mikromatriser nøyaktig som prøvene som er behandlet med V-ATPase-inhibitorer. På denne måten kan vi identifisere alle gener reagerer med økt transkripsjon da jern ble mangelfull eller LDL opptaket ble blokkert. Data ble behandlet ved UT Southwestern DNA mikroarray kjernefasilitet ved hjelp GCOS programvare med MAS5 normalisering og eksperimentelle prøver ble sammenlignet med DMSO behandlede prøver, eller, for DFO eller lave LDL-forhold, prøver dyrket i normalt medium løp på samme tid for å beregne størrelsen av endringen.
Gener som ble vurdert til å vise signifikant økt ekspresjon hvis begge prøver på en gang punkt med enten Baf eller LX1077 hadde en endring P-verdi på mindre enn 0,002, og gjennomsnittet av de to prøvene øket mer enn 2-fold. I de fleste tilfeller Baf indusert transkripsjon mer enn LX1077, selv om gener som svarer til Baf også reagert på LX1077. Genene at økt transkripsjon tidligste er vist i tabellene S1, S2 og tabell 1. Tabell S1 presenterer 47 gener som økte ekspresjon når HeLa-celler ble behandlet med V-ATPase-inhibitorer eller med lavt kolesterol medium og representerer respons på inhibering av V-ATPase det er grunn til å blokkere levering av eksogene kolesterol. Responsen av de fleste av disse genene er raskere i nærvær av de V-ATPase-inhibitorer enn det er å medium som mangler LDL, kanskje fordi medium som mangler LDL ikke blokkerer levering av kolesterol fra LDL-partikler som enten er bundet til sin reseptor på celleoverflate eller som allerede er frigjort i endocytoseveien ved tidspunktet medium som mangler LDL ble tilsatt. Flertallet av genene er vist i tabell S1 funksjon i lipid biosyntetiske reaksjonsveier og 23 er kjente mål for SREBP1 eller 2 [21]. Med unntak av EGLN1 og STARD4, ingen av de gener som øker transkripsjon tidlig i respons til lav LDL reagerer på den jernbindende DFO. EGLN1 koder for en jern-avhengig prolylhydroxylase som undertrykker HIF-1α aktivitet i henhold til normoksisk betingelser [22], og er ikke kjent for å være følsomme overfor aktiviteten av kolesterol-biosyntese-veien. Men i gjær og pattedyr er det krysstale mellom kolesterol biosyntese og veier for tilpasning til hypoksi [23], [24]. STARD4 koder for et cytosolisk kolesteroloverføringsprotein som er et mål SREBP [21] og også blir oppregulert etter ER stress [25] og kan bare indirekte oppregulert ved den jernbindende. Interessant, økt transkripsjon av INSIG1, som koder en negativ regulator av de SREBP transkripsjonsfaktorer som styrer kolesterolbiosyntesen, er en av de raskere svar på V-ATPase-inhibitorer. Dette er muligens en negativ feedback mekanisme for å begrense transkripsjons respons når lipid metabolske veier har økt produksjonen av endogent kolesterol [26].
Tabell S2 viser 64 gener som økte transkripsjon raskest når jern ble kelatert og også svare på hemming av den V-ATPase. Disse er gener i veier som antagelig gir respons på inhibering av jern frigivelse av transferrin i endosomer når den V-ATPase hemmes. Minst 29 av disse genene er kjent mål for HIF-1α og svare på hypoksi. Som man ville forvente, disse genene fungere i mange veier. Aldolase C er en HIF-1α target [27] og er sterkt oppregulert ved V-ATPase-hemmere. Selv om vi ikke oppdage en tidlig økning av aldolase C i celler behandlet med lave LDL-medium, er aldolase C også et kjent mål for SREBPs [21]. Aldolase C binder seg til den V-ATPase [28] og i gjær er ansvarlig for glukoseregulering av V-ATPase-aktivitet [29], [30]. Siden aldolase C svarer til hypoksi hos lunge epitelceller og til V-ATPase-inhibitorer i HeLa-celler, mens den mer rikelig glykolytiske enzym aldolase A ikke gjør det, er det mulig at en vesentlig funksjon av aldolase C som reaksjon på mangel på jern eller hypoksi er for å regulere den V-ATPase som en del av mekanismen for å sikre jern homeostase. HIF-1α er undertrykt først og fremst ved å være hydroksylerte på prolin av jernavhengige prolyhydroxylases, som retter seg mot det for degradering [31]. Ved immunoblot fant vi at inkubering av HeLa-celler i 15 nM Baf i 1 time stabilisert HIF-1α (data ikke vist), noe som tyder på at reaksjonsveier er regulert av HIF-1α er blant de mest følsomme for hemming av den V-ATPase. Således V-ATPase-inhibitorer gir en mest effektive middel for å danne inngrep HIF-1 a trasé eksperimentelt.
Tabell 1 viser 7 gener som økt transkripsjon som svar på V-ATPase-inhibitorer, men ikke i HeLa-celler behandlet med lave LDL medium eller med den jernbindende. Disse er kandidater for veier som registrerer mangel på V-ATPase-aktivitet uavhengig av virkningen på transferrin eller LDL. Annet enn CLCN6, er disse genene ikke er sterkt oppregulert og flere av dem er involvert i cellesyklusen og vekstkontroll og kan være en tidlig del av veksthemming som vil forekomme etter lengre inkubasjon i inhibitorene. CLCN6 er et klorid kanal som finnes i nerveceller og epitelceller [32], [33], og lokaliserer til slutten av endosomer [33]. Kloridkanalene i endosomer fungere i samspill med V-ATPase og dermed CLCN6 oppregulering kan være en reaksjon på tap av sen endosomet funksjon. SREBF2 (SREBP2) er en viktig regulator av kolesterol biosyntese, og det er først og fremst regulert post-transkripsjon av membran trafikk og proteolyse [34]. Den beskjedne transkripsjonelle Økningen sannsynligvis balansert med økningen i ekspresjon av inhibitoren av SREBP aktivering, INSIG1.
Tabell 2 viser resultatene av å ta en mindre restriktiv analyse av gener som forandrer seg i HeLa-celler behandlet med 15 nM BAF i 6 timer. Alle gener som viste en statistisk signifikant endring (endring P-verdi 0,00025) uavhengig av retningen på endringen ble analysert med oppfinnsomhet Pathways for å finne ut hvilke kanoniske baner i Ingenuity Database ble beriket i gener som ble endret i respons til Baf. Pathways som svarte betydelig til Baf inneholdt svært få gener som redusert uttrykk, noe som bekrefter vår antagelse om at tidlig svar vil bli økt genekspresjon. Langt de fleste betydelig påvirket trasé var steroid biosyntese, etterfulgt av glykolyse, og involverte gener for det meste også identifisert av vår mer restriktiv analyse.
Etter lengre intervaller behandling med V-ATPase-hemmere, 52 gener som hadde økt i respons til 12 timer i kultur lav LDL medium viste også øket ekspresjon i celler behandlet i 24 timer med V-ATPase-inhibitorer (tabell S3). Åtte av kolesterol responsive gener som ble oppregulert tidligere ikke lenger viste en økning og 15 nye kolesterol responsive gener viste økt transkripsjon, med seks av disse som koder for proteiner som er involvert i lipid biosyntetiske veier. 104 «jern responsive» gener (tabell S4) ble økt i celler behandlet med V-ATPase-hemmere i 24 timer, inkludert en rekke gener som koder for glykolytiske enzymer eller repressors av mitokondrienes funksjon, transkripsjonsfaktorer og proteiner som regulerer cellevekst. STXBP1, som koder for den MUNC-18 regulator av membranfusjon, viste moderat økning i respons til enten reduserende kolesterol eller jern og en sterkere økning i celler behandlet med V-ATPase-inhibitorer. Dette er en av de meget få gener som koder for proteiner som regulerer membran trafikk som stiger som respons på inhibering av V-ATPase (HIP1R, SV2A og OPTN var de andre). Seksti to gener økt uttrykk minst to ganger i respons til å hemme V-ATPase i 24 timer, men ikke svare på kolesterol mangel medium eller DFO (tabell S5). Dette sett av gener ble analysert ved hjelp av oppfinnsomhet Pathways programvare for å identifisere metabolske veier i hvilke gener som var signifikant oppregulert (figur 2). Den klart mest betydningsfulle responsen var i gener involvert i lipid- og steroid biosyntese.
De genene i tabell S4 ble analysert med oppfinnsomhet Pathways for å tildele dem kanoniske veier. Prosentandelen av gener i veien representert i dette datasettet, og betydningen av endringen vises.
Som man kan forvente, hvis både øker og minker i genuttrykk anses, etter 24 timer i Baf er det en komplisert reaksjon som involverer en rekke baner som kontrollerer veksten og som svar på stress (tabell S6). Den viktigste av disse er den NRF2-mediert oksidativt stress reaksjon, noe som tyder på at inhibering av V-ATPase øker reaktive oksygenarter. Som viktige komponenter i mitokondrie respirasjon veien krever jern, og hemming av oksidativ fosforylering kan produsere ROS, kan endringer i NRF2 medierte trasé være en sekundær konsekvens av å hemme jern import fra transferrin.
Vår opprinnelige hensikt i å forfølge disse studiene var å undersøke årsakene til differensial svar på V-ATPase hemmere sett i kreftceller. Fordi de større umiddelbare responser på hemming av den V-ATPase var av mangel på jern eller kolesterol, undersøkte vi om disse var ansvarlig for hypersensitivitet av enkelte kreftceller til V-ATPase-inhibitorer (figur 3). Vi målte dose-respons av livmorhalskreft avledet HeLa, melanomcellelinjer utvunnet fra SK-MEL-5 og SK-Mel-28, ikke-småcellet lungekreft linje H1299, brystcancer MCF-7 og Morris hepatoma (MH) celler til BAF i nærvær eller fravær av 150 uM jernsitrat. BAF hadde svært like IC50 konsentrasjoner for HeLa, MCF7 og H1299. Både MH og SK-Mel-5-celler var 10 ganger mer sensitive enn HeLa og SK-Mel-28 ble sterkt ufølsomme (figur 3). For Hela, SK-Mel-5 og SK-Mel-28 vi testet også effekten av tilsetning av kolesterol leveres inn i celler med metyl-β-syklodekstrin, som legger kolesterol direkte til plasmamembranen [26]. Tilsetning av jern til mediet gjort HeLa-celler som 20 ganger mer resistent overfor vekstinhibering forårsaket av 20 til 200 nM bafilomycin, men forutsatt liten beskyttelse for de cytotoksiske effekter som ble observert ved høyere konsentrasjoner (figur 3). Kolesterol var beskyttende for HeLa-celler, men ikke for BAF-sensitive SK-Mel-5-celler eller Baf motstandsdyktig SK-Mel-28 (figur 4). Dette indikerer at de cytostatiske virkninger av V-ATPase-inhibitorer i HeLa-celler er i stor grad på grunn av hemming av jern og kolesterolopptak, men de cytotoksiske effektene skyldes et alternativ, og som ennå ukjent, funksjon. Supplering H1299, MCF7 eller den mer følsomme SK-Mel-5 melanom-cellelinje med jern som er beskyttet av dem ved lavere konsentrasjoner av Baf lik HeLa-celler (figur 3). Faktisk, MCF7 eller SK-Mel-5-celler behandlet med jern og bafilomycin hadde en doserespons bemerkelsesverdig lik HeLa-celler behandlet med bafilomycin alene, noe som antyder at disse cellelinjene var spesielt følsomme for hemming av jernopptaket. Verken jern eller kolesterol hadde noen beskyttende virkning på den svært resistent cellelinje SK-Mel-28 eller ganske følsomme MH cellelinje.
Dose-respons på seks cancercellelinjer til Baf i nærvær eller fravær av 150 uM jernsitrat ble bestemt som beskrevet i forklaringen til figur 1.
doseresponskurvene på HeLa, SK-MEL-5 og SK-Mel-28-celler til Baf i nærvær eller fravær av eksogent kolesterol levert til celler med metyl-β-cyklodekstrin ble bestemt som beskrevet i forklaringen til figur 1.
for å undersøke mekanismen for cytotoksisiteten indusert av Baf i SK-Mel-5 og HeLa-celler , behandlet vi celler av hver linje med 0-1000 nM Baf i 24 timer og deretter undersøkt spaltingen av PARP eller caspase 3 som tegn for induksjon av apoptose (figur 5). I begge cellelinjene Baf apoptose etter 24 timer; imidlertid, den nødvendige konsentrasjon var over 20 ganger lavere for SK-Mel-5 enn HeLa-celler, var svært like de forskjellene i dødelige doser for de to cellelinjer. Cytotoksisiteten som følge av inhibering av den V-ATPase i overfølsom cellelinjen SK-Mel-5 er gjennom induksjon av apoptose.
HeLa og SK-Mel-5-celler ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av Baf for 24 timer og deretter forberedt for immunblotting med antistoffer mot spaltet PARP eller spaltes caspase 3. de spaltede proteiner vises ved mye lavere konsentrasjoner av Baf i SK-MEL-5-celler sammenlignet med HeLa, med konsentrasjonen forskjellen mellom utseendet av spaltede protein som ligner på forskjeller i dødelige doser for de to cellelinjene. De immunoblotter vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
Både SK-Mel-5 celler og MCF7 celler var mer følsomme for Baf enn HeLa-celler og denne forskjellen i følsomhet ble avskaffet ved å supplere den kulturmedium med jern (figur 3). Dermed har vi undersøkt ekspresjon av proteiner involvert i jernopptak, lagring eller utstrømning i disse cellelinjer og HeLa-celler (figur 6). SK-Mel-5-celler uttrykte mindre transferrin reseptor enn noen av de andre to cellelinjer og meget lave nivåer av DMT1, transportøren ansvarlig fra å bevege seg på tvers av jern endosomet membranen til cytoplasma. Bemerkelsesverdig, SK-Mel-5-celler uttrykte høye nivåer av jern sekretoriske transportøren, ferroportin, som transporterer jern over plasmamembranen og ut av cellen. Ferroportin ble ikke påvist i noen av de to andre cellelinjer. SK-Mel-5-celler uttrykte mindre ferritin enn HeLa-celler, i overensstemmelse med lave nivåer med cytoplasmisk jern. Tatt sammen, dette mønsteret uttrykks antydet at SK-Mel-5 celler ble aktivt opprettholde relativt lave cytoplasmatiske jern nivå. I motsetning til dette, MCF7 celler hadde nivåer av transferrin-reseptoren som ligner på HeLa-celler, økt ekspresjon av DMT1 og meget lave nivåer av jern lagring protein, ferritin. Dette er et mønster av uttrykk i samsvar med en celle som har lave cytoplasmatiske jernnivåer og har oppregulert jern transportmekanismer som svar. Dermed SK-MEL-5 celler og MCF7 celler, selv om begge overfølsomme for Baf grunn av hemming av jern opptak, skilte seg i de molekylære mekanismene bak dette sikkerhetsproblemet.
Uttrykket av transferrin reseptor 1, ferritin og ferroportin i HeLa og SK-Mel-5-celler i nærvær eller fravær av DFO ble målt ved immunblotting. I forhold til HeLa-celler, SK-Mel-5 har redusert ekspresjon av transferrin reseptoren og ferritin og en stor økning i ekspresjon av jernet dyseutstrømningen proteinet ferroportin. TfR, transferrin reseptor. DMT1, toverdig metal transporter 1. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritin H tung kjede. De immunoblotter vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
Forskjellene i uttrykket av transferrin reseptor og ferroportin i SK-Mel-5 celler var ikke på grunn av en manglende evne til å regulere disse proteinene som svar på jern. Når SK-Mel-5-celler eller HeLa-celler ble behandlet med DFO for å chelatere jern, begge oppregulert ekspresjon av transferrin-reseptoren (figur 7). Som svar på DFO, transferrin reseptor-ekspresjon i SK-Mel-5-celler var svært lik den som er i HeLa, noe som indikerer at mekanismer for å uttrykke reseptoren i respons til jern var intakt i SK-Mel-5-celler. DFO behandling redusert uttrykk for ferroportin og ferritin i SK-Mel-5 celler, som man ville forvente for en celle streve for å opprettholde cellulære jern nivåer. Dermed mekanismer for å regulere disse proteinene av jern var også intakt i SK-Mel-5 celler. Når SK-Mel-5-celler ble behandlet med Baf, de økte også ekspresjon av transferrin-reseptoren og redusert ferritin. Imidlertid ferroportin ekspresjon ble betydelig økt. Siden chelatere jern redusert ferroportin uttrykk i SK-Mel-5 celler, dette svaret var på grunn av noen annen effekt av å hemme V-ATPase.
Behandling av HeLa eller SK-Mel-5 celler med 100 mikrometer DFO for 24 timer resulterte i økt ekspresjon av transferrin reseptoren i begge cellelinjer, og en reduksjon i ferroportin og ferritin i SK-Mel-5-celler. BAF behandling hadde en lignende virkning, med det unntak at ferroportin ekspresjon i SK-Mel-5-celler ble økt med BAF. HeLa-celler uttrykte ikke ferroportin og SK-Mel-5 celler hadde svært lav uttrykk for DMT1. TfR, transferrin reseptor. DMT1, toverdig metal transporter 1. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritin H tung kjede. De immunoblotter vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
En mulig årsak til en celle til aktivt å trykke cytoplasmatiske jern nivåer ville være å beskytte mot generasjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS) av jern. For å undersøke om SK-Mel-5-celler kan produsere mer ROS, merket vi SK-MEL-5 og HeLa-celler med fargestoffer som øker fluorescensen i nærvær av ROS. Celler ble fotografert med identiske kamerainnstillinger og fluorescensstyrkene celler ble målt ved hjelp av Image J programvare. SK-Mel-5 celler produseres betydelig mer ROS enn HeLa-celler, målt med både fargestoffer (figur 8).
A. Celler ble merket med H2O2 følsom sonde DCF, eller den superoksid følsom sonde DHE, som beskrevet i metodene. Celler ble fotografert med identiske kamerainnstillinger. B. Fluorescent celler ble skissert i Image J og fluorescens innenfor individuelle celler ble målt og tegnes med GraphPad Prism.
Siden SK-MEL-5 celler syntes å ha lave nivåer av intracellulære jern og var overfølsom til Baf, noe som ville ytterligere redusere jernopptak, undersøkte vi følsomheten av SK-Mel-5-celler til den jernbindende DFO (figur 9). Som forventet, SK-Mel-5 celler var overfølsom til DFO forhold til HeLa-celler. Faktisk, DFO var bare cytostatisk for HeLa-celler, mens det var cytotoksisk for SK-Mel-5. Tilsetning av eksogent jern til cellekulturmediet av SK-Mel-5 eller HeLa-celler hadde ingen virkning på cellevekst (data ikke vist).
Celler ble behandlet med konsentrasjonene av DFO vist, som beskrevet i Metoder og etter 72 timer celler ble talt opp. To brønner for hver konsentrasjon ble talt, og gjennomsnittlig antall to uavhengige eksperimenter ble fremstilt grafisk +/- SEM, n = 2.
Tre observasjoner foreslått at ferroportin uttrykk kan være forårsaket av ROS i SK- Mel-5 celler. SK-Mel-5 celler hadde både økt ROS produksjon og økt ferroportin uttrykk. En av de store reaksjonsveier indusert av Baf behandling av HeLa-celler i 24 timer ble antioksidanten respons mediert av NRF2, noe som tyder på at Baf behandling kan øke ROS. BAF indusert snarere enn trykt ferroportin uttrykk i SK-Mel-5 celler, mens senking jern nivåer med DFO redusert ferroportin uttrykk. Hvis ferroportin ekspresjon ble indusert ved ROS, deretter behandling av SK-MEL-5-celler med anti-oksidant N-acetylcystein (NAC) ville forventes å avta ferroportin uttrykk. Når SK-Mel-5-celler ble behandlet i 48 timer med økende konsentrasjoner av NAC, ble ferroportin uttrykk redusert (figur 10). Til sammen våre data tyder på at SK-MEL-5 celler er sårbare for hemming av jernopptaket fordi de opprettholder lavt jern reserver, kanskje for å beskytte seg mot å generere giftige nivåer av ROS.
SK-Mel-5 celler ble behandlet med NAC som beskrevet i Metoder og deretter bearbeidet for immunblotting med antistoffer mot proteinene som er vist. TfR, transferrin reseptor. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritin H tung kjede. De immunoblotter vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Selv om en rekke cellelinjer avledet fra svulster eller cellelinjer forvandlet av onkogener er svært følsomme for V-ATPase-hemmere, problemene med toksisitet hos dyr, spesielt nevrotoksisitet, har hindret utvikling av disse inhibitorer som anti-kreftmidler. Den åpenbare problemet er at den V-ATPase er et viktig enzym som er ansvarlig for mange grunnleggende cellulære prosesser, og inhibering av den vil ha mange virkninger i mange celletyper. Dette igjen tyder på at den overfølsomhet av kreftceller til V-ATPase-inhibitorer bør være på grunn av en sårbarhet i ett eller flere av de mange prosesser som krever den V-ATPase, og at identifisere disse sikkerhetsproblemene kan avsløre terapeutiske mål som kan utnyttes med færre toksiske effekter på normalt vev. Våre data viser at inhibering av jernopptaket V-ATPase-inhibitorer er en viktig determinant av forskjellig sensitivitet av cancercellelinjene til disse inhibitorene, noe som antyder at mekanismene som styrer intracellulære jern nivåer kan være nyttige terapeutiske mål for visse tumorer.
