Abstract
Kreftceller migrere innenfor en 3D mikromiljøet er i stand til å vedta enten en mesenchymale eller amoeboid modus for migrasjon. Amoeboid migrasjon er karakterisert ved membran blebbing som er avhengig av Rho effektorene, ROCK1 /2. Vi identifiserer LIMK2 som foretrukket substrat for ROCK1 men finner ut at LIMK2 induserte ikke membran blebbing, noe som tyder på at en LIMK2 veien ikke er involvert i amoeboid-modus migrasjon. Til støtte for denne hypotesen, roman gnage data viser en direkte interaksjon mellom ROCK1 og LIMK2 i polariserte, men ikke blebbing celler. Våre resultater peker mot en bestemt rolle for ROCK1. LIMK2 sti i mesenchymale-modus migrasjon
Citation: Shea KF, Wells CM, Garner AP, Jones GE (2008) ROCK1 og LIMK2 Interact i Spread men ikke blebbing kreftceller. PLoS ONE 3 (10): e3398. doi: 10,1371 /journal.pone.0003398
Redaktør: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Tyskland
mottatt: 08.07.2008; Godkjent: 16 september 2008; Publisert: 14 oktober 2008
Copyright: © 2008 Shea et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Medical Research Council (MRC), og tildeling av CASE student fra BBSRC /Astrazeneca plc
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Breast cancer metastase er avhengig av cellemigrering, en kompleks prosess regulert romlig så vel som temporært med Rho familien GTPases Rho, Rac og Cdc42 [1]. Disse GTPases fremkalle en respons på ekstracellulære signaler på aktin cytoskjelettet gjennom en rekke av effektor-proteiner. I en 3D mikrokreftceller kan vedta både mesenchymale og amoeboid som trekk fenotyper [2]. Amoeboid migrasjon er karakterisert ved membran blebbing [3] – [5] en spesialisert form for celle fremspring som er reversibel og kan forekomme i løpet av cellemigrering eller under initiering av cytokinese [6]. Membran blebbing har vist seg å bli indusert av Rho effektorproteinet ROCK [7] og amoeboid-lignende bevegelse er helt avhengig av samspillet mellom Rho og ROCK [2], [5].
ROCK-en og ROCK -2 er serin /treoninkinaser som har en rekke cellulære substrater, inkludert myosinlettkjedefosfatase og LIM-kinase (LIMK) [8]. ROCK-avhengig migrering av kreftceller er kjent for å bli drevet av actomyosin kontraksjoner [9], [10]. Men det er ikke kjent om ROCK avhengig kreftcelle amoeboid locomotion krever ROCK:. LIMK samhandling
Aktivert LIMK proteiner fosforylere og inaktivere F-aktinspaltende protein, cofilin og dette gir en alternativ mekanisme for Rho-ROCK signale å formidle dens virkninger på F-aktin cytoskjelettet [11]. ROCK-LIMK signale er tenkt å fremme tilbaketrekking av neurites gjennom regulering av cofilin aktivitet [12]. I tillegg har en rolle for rock og LIMK proteiner i menneskehuden blitt identifisert [13]. Inhiberingen av cofilin aktivitet av ROCK-LIMK ser ut til å være nødvendig for cellesammenpakning hvor en reduksjon av LIMK-aktivitet fører til en økning i cofilin aktivitet og en reduksjon i cellekompaktering [13].
En økning i berg nivå er påvist i flere kreft hos mennesker [14] – [16] og nivåer av LIMK-en økning i invasive og metastatisk brystkreft og prostatakreft cellelinjer [17], [18]. Derfor søkte vi for å bedre forstå bidrag av en ROCK. LIMK interaksjon til kreft celle migrasjon av tenkelig romlig interaksjon mellom ROCK og LIMK i brystkreftceller stiller både mesenchymale og amoeboid (blebbing) morfologi
Materialer og Metoder
Antistoffer og reagenser
anti-ROCK1 ble kjøpt fra Transduction Laboratories, anti-LIMK2, anti-fosfor-LIMK1 /2 (Thr508 /Thr505) fra Cell Signal Technology. HRP-konjugerte sekundære antistoffer fra DAKO og Alexa-phalloidin fra Molecular Probes. Expression plasmider som koder GFP, CFP, YFP og mRFP1 tagget LIMK1, LIMK2 og ROCK1 ble generert ved hjelp av Gateway ™ Technology (Invitrogen) og alle plasmider ble sekvensert. Den ROCK hemmer Y27632 ble kjøpt fra Calbiochem.
Cell Kultur
MDA-MB231 celler ble dyrket i DMEM (Sigma) supplert med 10% FBS (Helena biovitenskap), L-glutamin og 100 U /ml penicillin-streptomycin. Cellene ble transient transfektert ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen)
Fosforylering assay
celler ble lysert i NP40 lyseringsbuffer (1% volum /volum NP40;. 50 mM HEPES pH 7,5; 0,5% vekt /volum natrium-deoksycholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA). Prøvene ble løst ved SDS-PAGE og immunoblottet. Autoradiografer ble skannet og kvantifisert ved hjelp av Adobe-programvare. Mener og standardavvik verdiene ble beregnet fra dataene for 3 uavhengige eksperimenter
Immunfluorescens og analyse
celler sådd på dekkglass ble fiksert med 4% paraformaldehyd.: PBS og permeabilised med 0,2% Triton X-100: PBS som tidligere beskrevet [19]. Cellene ble deretter inkubert med TRITC-konjugert phalloidin i 1 time ved romtemperatur. Bilder av celler ble oppnådd ved å bruke en Zeiss LSM510 konfokal laser-skanning mikroskop (Welwyn Garden City, UK) og ble behandlet i Adobe Photoshop 7.0 ™. Student paret t-test ble brukt for å sammenligne forskjeller mellom gruppene. Statistisk signifikans ble akseptert for P≤0.05
FRET: FLIM Mikros
Celler ble microinjected med riktige plasmider 24 timer før fiksering. Cellene ble deretter fiksert som ovenfor og inkubert med frisk natriumborhydrid (1 mg /ml i PBS) for å slukke bakgrunnsfluorescens som tidligere beskrevet. FLIM ble utført på en multiphoton mikroskop som tidligere beskrevet [19]. FLIM analyse for å beregne GFP levetid og FRET effektivitet ble utført ved hjelp TRI2 programvare [19]. Antall piksler for hver FRET effektivitet verdi ble oppnådd fra TRI2 og normalisert ved å dele det opp av summen av de bildeelementer for bildet. Dette normalisert pikselantallet ble fordelt på seks celler per tilstand og deretter plottet mot FRET effektivitet for å generere FRET effektivitets histogrammer.
Resultater
ROCK1 phosphorylates LIMK1 og LIMK2 i brystkreftceller
En rekke laboratorier har antydet at ROCK kan fosforylere og aktivere LIMK1 og LIMK2 [20] – [26] og dermed har vi søkt å fastslå om dette er den samme for MDA-MB231 celler. Pre-inkubasjon med ROCK inhibitoren Y27632 reduserte nivået av LIMK2 fosforylering i celler med endogent og overuttrykkes CFP-ROCK1. I kontrast, reduserer Y27632 forholdet mellom fosfor til total LIMK1 i celler med uttrykt CFP-ROCK1 men ikke i de med endogene nivåer av ROCK protein (Fig. 1). Behandling av celler med Y27632 indusert en liten nedgang i LIMK1 og LIMK2 overekspresjon nivåer (Fig. 1A og B). Men mens LIMK2 fosforylering er alltid følsomme for ROCK aktivitet LIMK1 fosforylering er bare følsom for ROCK aktivitet når CFP-ROCK1 er overexpressed. Således våre resultater viser at overekspresjon av ROCK1 endrer graden av fosforylering av både LIMK1 og 2, men antyder at LIMK2 er det foretrukne substrat for ROCK1 i disse cellene.
A) og B) CFP-LIMK1 eller 2 og enten CFP-ROCK1 eller CFP alene ble transient transfektert inn i MDA-MB231-celler og behandlet med 10 uM Y27632 i 24 timer. De resulterende lysater ble immunblottet under anvendelse av anti-fosfo-LIMK, -LIMK1, -LIMK2 og -ROCK1 antistoffer. (NSB = ikke-spesifikk binding av anti-ROCK1 antistoff mot et protein /s ved 220 kDa). C) Forholdet mellom fosfor /total LIMK1 CFP-LIMK1 og D) Forholdet mellom fosfor /total LIMK2. (* = P 0,05).
ROCK1 men ikke LIMK2 induserer blebbing i brystkreftceller
Vi fant at mens overekspresjon av GFP alene fører til en liten, men statistisk signifikant økning i antall celler blebbing overekspresjon av GFP-ROCK1 induserer en svært signifikant økning i andelen av blebbing celler (fig. 2A og B). Selv om det ikke er vist før i MDA-MB231-celler dette har blitt rapportert i andre celletyper [9], [27] – [30]. I motsetning overekspresjon av GFP-LIMK2 induserte ikke et høyt nivå av membran blebbing, så vi heller ingen indikasjon på celle blebbing følgende overekspresjon av LIMK1 (data ikke vist). I alle tilfeller blebbing celler hadde et intakt kjerne som ikke-fragmentet (fig. 2A) som indikerer at dette ikke er membran blebbing assosiert med apoptose [31].
A) MDA-MB231-celler ble transfektert med GFP-ROCK1 eller GFP-LIMK2, fiksert og farget med Alexa Fluor 594-Phalloidin og Dapi. 150 celler fra 3 uavhengige eksperimenter ble scoret for synlig blebbing +/- s.e.m. P 0,05; *** P 0,001. B) Representative bilder fra varierende optiske skiver av en blebbing celle overekspresjon GFP-ROCK1. (Bar = 20 mikrometer).
ROCK1 og LIMK2 ikke samhandler i blebbing brystkreft celler
Våre resultater viser at det er en interaksjon mellom ROCK1 og LIMK2 men tyder på at denne interaksjonen er ikke involvert i membranen blebbing. Vi søkte å bekrefte denne hypotesen ved direkte avbildning samspillet mellom ROCK1 og LIMK2 i blebbing og ikke-blebbing celler ved hjelp FRET: FLIM mikroskopi. Denne metoden gir ikke bare skal bli detektert et samspill mellom ROCK1 og LIMK2 men også for lokalisering av en slik interaksjon skal bestemmes romlig over hele cellen. For å sammenligne samspillet mellom ROCK1 og LIMK2 i spredt og blebbing celler har vi brukt mikroinjeksjon til moderat nivå av ROCK1 uttrykk. Ved hjelp av denne fremgangsmåten mesteparten av cellene, (63%), oppviste en spredning /polarisert morfologi, med mindre antall blebbing-celler (23%). I blebbing celler oppdaget vi ingen FRET mellom GFP-ROCK-en og mRFP-LIMK-2 (Fig. 3).
MDA-MB231 celler ble microinjected med GFP-ROCK1 og mRFP-LIMK2, fast, fotografert og analysert ved hjelp av FLIM mikroskopi og TRI2 analyseprogram. A) Bilder av GFP levetid og GFP og mRFP intensiteter over et typisk blebbing celle ble vist for en celle som uttrykker både GFP-ROCK1 donor og mRFP-LIMK2 akseptor og for sammenligning, bare GFP -ROCK1 donor. B) Histogram av antallet av normaliserte pikseltellinger som detekteres ved hver GFP levetid. n = 9.
ROCK1 og LIMK2 samhandle i polariserte brystkreft celler
Etter å ha fastslått at ROCK1 og LIMK2 er ikke samspill i blebbing celler vi analysert lokalisering og samhandling av ROCK1 og LIMK2 i spredt celler. I spredt celler flertallet av LIMK2 og ROCK uttrykk er lokalisert i cytoplasma, men ekspresjon av begge proteinene kan påvises i kjernen (fig. 4). I MDA-MB231 celler med en spredning /polarisert fenotype oppdaget vi en redusert GFP levetid når ROCK1 og LIMK2 var co-uttrykk, som viser at ROCK1 og LIMK2 samhandle på spredte celler (Fig. 4). GFP levetid nedgang er sett over cellen cytoplasma i en punktformet fordeling. Til sammenligning har to polariserte celler microinjected med bare GFP-ROCK1 ikke vise noen nedgang i GFP levetid (Fig. 4). Det er ingen signifikant nedgang i GFP levetid under kontrollnivåer når celler som uttrykker ROCK1 og LIMK2 er pre-inkubert med inhibitoren ROCK Y27632 (figur 4). Interessant, i mange celler det er en mangel på noen påviselig interaksjon mellom ROCK1 og LIMK2 på celle periferien (uthevet av pilspisser i fig. 4).
MDA-MB231 celler ble microinjected med GFP-ROCK1 og mRFP- LIMK2, fast, fotografert og analysert ved hjelp av FLIM mikroskopi og TRI2 analyseprogram. A) Bilder av GFP levetid og GFP og mRFP intensiteter over en typisk langstrakt celle ble vist for en celle som uttrykker både GFP-ROCK1 donor og mRFP-LIMK2 akseptor og for sammenligning, bare GFP -ROCK1 donor. B) Histogram av antallet av normaliserte pikseltellinger som detekteres ved hver GFP levetid. C) Et histogram av det gjennomsnittlige antall av normaliserte pikseltellinger som detekteres ved hver GFP levetid i celler som uttrykker både GFP-ROCK1 donor og mRFP-LIMK2 akseptor i celler av langstrakte eller blebbing morfologier ble bygget sammen med celler som bare uttrykker GFP-ROCK1 donor. 18 celler mer enn tre uavhengige eksperimenter ble fotografert for hvert tidspunkt. D) En Histogram av antall normaliserte pixel teller ble detektert ved hvert GFP levetid for celler som uttrykker både GFP-ROCK-en donor og mRFP-LIMK-2 akseptor i MDA-MB231 celler forbehandlet med Y27632. n = 9.
Diskusjoner
Tidligere studier har ikke avdekket om en ROCK: LIMK vei bidro til induksjon av membranen blebbing. Vi gir her for første gang bevis for en direkte og konkret samhandling mellom ROCK1 og LIMK to i godt spredt mesenchymale celler som er fraværende i avrundede blebbing celler. Bruke FRET mikros vi fant ingen interaksjon mellom ROCK-en og LIMK-2 i celler som viste en membran blebbing fenotype, til tross for vår egen bevis for at LIMK2 er den foretrukne ROCK underlaget i disse cellene. Våre resultater tyder på at en ROCK1: LIMK2 interaksjonen ikke er involvert i blebbing /avrundet fenotype, og ville ikke være nødvendig for amoeboid migrasjon. Faktisk overekspresjon av LIMK2 ikke induserer membran blebbing i cellene. Nyere rapporter tyder på at mobilnettet hendelser nedstrøms av ROCK aktivering er faktisk separat koordinert om MLC og cofilin fosforylering [32].
I motsetning våre FRET studier identifisert en direkte interaksjon mellom ROCK1 og LIMK2 i konsentrert foci i cytoplasma av kreft celler med en mesenchymale morfologi. Fosforyleringen av LIMK-2 av ROCK-1 i cellesenteret vil øke nivået av fosforylert cofilin, og dermed redusere F-aktin adskillelse. Dette vil stabilisere actomyosin filamentene er til stede i cellelegemet og fremme dannelsen av den kontraktile kraft som er nødvendig for haletilbaketrekkingen og cellevandring [33]. Faktisk har det tidligere blitt vist at TGF-induserte spenning aktin fiberdannelse er mediert av et ROCK-1 /LIMK-2 /cofilin pathway [26]. Nylig, en ROCK: ble LIMK1 pathway innblandet i koordinering av cofilin aktivitet på plasmamembranen av invasive rotte brystkreft celler [34], [35]. Våre resultater peker mot en distinkt funksjon for LIMK1 og LIMK2 nedstrøms ROCK under brystkreft celle migrasjon. Vi spekulerer i at samspillet mellom ROCK1 og LIMK2 ikke spiller en betydelig rolle i membran blebbing forbundet celle migrasjon og heller ikke i reguleringen av cofilin fosforylering på celle periferien. I stedet for vekselvirkningen mellom ROCK1 og LIMK2 er begrenset til cellelegemet polarisert godt spredt cellene der er bidrar til stabilisering av actomyosin filamenter og generering av sammentrekningskraften gjennom inaktivering av cofilin.
