Abstract
Mål
For å bestemme uttrykk mønstre av NF-kB regulatorer og målgener i klarcellet nyrecellekarsinom (ccRCC), deres sammenheng med von Hippel Lindau (VHL) mutasjonsstatus, og deres tilknytning til overlevelse utfall.
Metoder
Metaanalyser analyser~~POS=HEADCOMP ble utført på offentlig ccRCC genekspresjon datasett ved RankProd, en ikke-parametrisk statistisk metode. Degs med falske funnrate på 0,05 av denne metoden ble ansett som betydelig, og krysses med en kuratert liste over NF-kB regulatorer og mål for å bestemme arten og omfanget av NF-kB deregulering i ccRCC.
Resultater
Et sterkt -disproportionate fraksjon (~ 40%;
p
0,001) av NF-kB regulatorer og målgener ble funnet å være oppregulert i ccRCC, en indikasjon på forhøyet NF-kB aktivitet i denne kreftformen. En undergruppe av disse genene, som består av en sentral NF-kB regulator (
IKBKB
) og etablerte meklere av NF-kB celle-overlevelse og pro-inflammatoriske responser (
MMP9
,
PSMB9
, og
SOD2
), korrelert med høyere relativ risiko, dårligere prognose, og redusert total pasient overlevelse. Overraskende, nivåer av flere interferon regulerende faktorer (IRFs) og interferon målgener ble også forhøyet i ccRCC, noe som indikerer at en «interferon signatur» kan representere et nytt trekk ved denne sykdommen. Tap av VHL genekspresjon korrelert sterkt med utseendet på NF-κB- og interferon genet signaturer i både familiære og sporadiske tilfeller av ccRCC. Som NF-kB styrer uttrykket av nøkkel interferon signale noder, tyder våre resultater en årsakssammenheng mellom VHL tap, forhøyet NF-kB aktivitet, og utseendet på en interferon signatur under ccRCC tumorigenesis.
Konklusjoner
Disse funnene identifisere NF-kB og interferon signaturer som kliniske funksjoner i ccRCC, gi sterk begrunnelse for inkorporering av NF-kB-hemmere og /eller og utnyttelse av interferon signalering i behandling av ccRCC, og levere nye NF-kB mål for potensiell terapeutisk intervensjon i dette øyeblikket, uhelbredelig kreft
Citation. Peri S, Devarajan K, Yang DH, Knudson AG, Balachandran S (2013) Meta-Analysis Identifiserer NF-kB som et terapeutisk mål i nyre kreft . PLoS ONE 8 (10): e76746. doi: 10,1371 /journal.pone.0076746
Redaktør: Edward W. Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, USA
mottatt: 22 juli 2013; Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 07.10.2013
Copyright: © 2013 Peri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en American Cancer Society stipendiat Grant (RSG-09-195-01-MPC) til SB. Ekstra midler ble levert av Fox Chase Cancer Center via institusjonell støtte av nyrekreft Keystone Program, og ved NIH tilskudd N01 CN-95037 og P30 CA 06927. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
nyrecellekarsinomer (RCC) utgjør ca 3% av alle voksne kreft, og forårsake ~ 116.000 årlig globalt dødsfall [1]. Flere histologiske sub-typer av RCC er blitt beskrevet, inkludert chromophobe, papillær og klare celle, av hvilke den klare cellevariant (ccRCC) står for ~ 85% av alle tilfeller RCC [2,3]. Tidlig stadium ccRCC er vanligvis kureres med kirurgi, og pasienter diagnostisert med lokaliserte nyre masser av 4 cm. har utmerket prognose [4]. ccRCC er imidlertid en stor grad asymptomatisk sykdom, og omtrent en tredjedel av alle pasienter stede med lokalt fremskreden eller metastatisk kreft på diagnosetidspunktet. I motsetning til lokaliserte tidlig stadium ccRCC, er avansert ccRCC en dødelig, cellegift-motstandsdyktig kreft [1,5].
Avansert ccRCC er primært behandlet av små-molekyl farmakologiske tilnærminger. Frontline alternativer inkluderer tyrosinkinasehemmere sunitinib og sorafenib, og mTOR-hemmere temsirolimus og everolimus. Disse midler er imidlertid bare gi kortvarig fordel ved å forsinke progresjon av sykdommen, og er ikke kurativ [6-8]. Videre slike midler krever kontinuerlig administrasjon, utsette pasienter til betydelige bivirkninger [7,9]. Behandling av metastatisk RCC er derfor fortsatt en terapeutisk utfordring behov for nye muligheter.
En genetisk kjennetegn på ccRCC er inaktivering av von Hippel Lindau (VHL) tumor suppressor genet [10].
VHL
genet er inaktivert av enten mutasjon eller hypermethylation i opptil 90% av sporadiske ccRCC tilfeller [10-12]. I sin beste erklærte rolle, pVHL, produktet av
VHL
genet, fungerer som en del av en nedbrytende E3 ubiquitin ligase kompleks som tett styrer proteinnivåer Hypoksi induserbar faktor (HIF), en transkripsjonsfaktor og herre regulator av cellulær respons overfor hypoksi [11,13]. Når pVHL er fraværende, HIF akkumulerer selv under normoksisk forhold, og feilaktig transaktiverer uttrykk for sine mål gener. Som mange HIF målene er potente tumorigent, mis-uttrykk for HIF målgener anses de primære orchestrators av
VHL
-deficient ccRCC tumorprogresjon, og målretting trasé nedstrøms av HIF (f.eks VEGF signalering) representerer en primær farmakologisk tilnærming til behandling av RCC [11].
i tillegg til å regulere HIF, pVHL har blitt vist i flere cellekulturstudier for å også å kontrollere aktiviteten av transkripsjonsfaktor NF-kB [14]. Når pVHL uttrykk er tapt (eller ablated av RNAi), er NF-kB aktivitet forhøyet; omvendt, re-introduksjon av pVHL inn
VHL
-null RCC celler senker NF-kB aktivitet [15-17]. Disse observasjonene har viktige kliniske konsekvenser. Først, som NF-kB (som HIF) er en sentral regulator av inflammatoriske og celle-overlevelse svar, er det svært sannsynlig at forhøyet NF-kB signale følgende pVHL tap vil bidra til trinnene i Genesis, progresjon, overlevelse, og /eller spredning av ccRCC. For det andre, hvis NF-kB er faktisk forhøyet i ccRCC svulster – og ikke bare i RCC cellelinjer – da rettet mot NF-kB gir en spennende ny behandlingsalternativ for avansert ccRCC. I denne forbindelse er det innledende studier vist at små-molekyl inhibisjon av NF-kB sensitizes ellers bestandige ccRCC celler til (1) den tumorici-dal aktivitet av EGFR-inhibitorer, (2) apoptose av det anti-tumor cytokin TRAIL, og (3) oncolysis av encefalomyokarditisvirus [14,18-21]. Av disse grunner, få innsikt i arten og omfanget av NF-kB de-regulering i ccRCC svulster blir en viktig målsetting.
Vi startet denne studien å bestemme gjennom storskala bioinformatiske nærmer utbredelsen av NF-kB transcriptomic deregulering i pasient avledet ccRCC prøver. Fra disse analyser har vi funnet at NF-kB synes å være konstitutivt aktiv i en høy prosentandel av ccRCC tilfeller, og at et uforholdsmessig stort antall av NF-kB regulatorer og mål (den ccRCC «NF-kB signatur «) skjerm gående forhøyet ekspresjon i ccRCC, sammenliknet med normalt nyrevev. Videre undersøkelser avslørte også tilstedeværelsen av en robust «interferon (IFN) signatur «i ccRCC. Vi viser at forekomsten av både NF-kB og IFN signaturer er godt korrelert med VHL mutasjonsstatus, og identifisere en viktig undergruppe av NF-kB regulatorer og mål som forhøyet uttrykk korrelerer med høyere relativ risiko, dårligere prognose, og redusert total overlevelse i ccRCC. Sammen er disse resultatene indikerer at forhøyet NF-kB og IFN-signalering kan representere de vanligste funksjonene i pVHL-negative ccRCC, og gi rasjonale for målretting NF-kB i denne sykdommen.
Materialer og metoder
etikk uttalelse
bruk av menneskelige vevsprøver fra pasienter på Fox Chase Cancer Center ble godkjent av Fox Chase Institutional Review Board. Skriftlig informert samtykke, godkjent av etisk komité, ble innhentet for bruk av disse prøvene.
Immunohistochemistry
En nyrevevet microarray (TMA), som inneholder dupliserte skiver fra 20 ccRCC svulster og 8 normal nyrer, ble konstruert fra arkivformalinfiksert, parafininnstøpte Fox Chase Cancer Senter pasientprøver. TMA vevssnitt ble kuttet med en tykkelse på 5 mikron, deparaffinized av xylen og rehydrert i avtagende konsentrasjon av etanol. Antigen gjenfinning ble oppnådd ved koking av seksjonene på 10 mM citrat-buffer i 20 minutter. Etter blokkering av endogen peroksydase med 3% hydrogenperoksidase i metanol ble snittene inkubert med Bakgrunn Sniper (Biocare Medical) ved romtemperatur i 30 minutter. Snittene ble deretter inkubert med primære antistoffer, NF-kB (Cell Signaling) ved fortynning på 1: 500, og STAT1 (BD Biosciences) ved en fortynning på 1: 100, ved 4 ° C over natten. Etter vasking i PBS ble snittene inkubert med merkede Polymer-HRP-anti-kanin og anti-mus (DAKO) sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time, utsatt for diaminobenzidintetrahydroklorid løsning, og motfarget med hematoxylin. Etter dehydratisering i økende konsentrasjoner av etanol og tømme i xylen, ble seksjoner montert i Permount. Bilder ble tatt på et Nikon Eclipse E600 mikroskop med NIS Elements D3.0 programvare.
Meta-analyse
For metaanalyser, vi satt sammen en liste over publiserte RCC studier fra Gene uttrykk Omnibus ( GEO) eller ArrayExpress (tabell S1), som data var (i) generert ved hjelp av Affymetrix plattform U133A, U133B, og U133Plus2; (Ii) nøyaktig merket når deponert i databaser; og (iii) inneholdt normale vev kontroller. For studier som anvender U133A og U133B chips, vi bare betraktet de som profilerte eksempler på
begge
chips; denne maksimerte antallet gener som er tilgjengelige for etterfølgende meta-analyse. Rådata ble normalisert ved hjelp av Robust Multi-matrise Average (RMA) [22]. I tilfeller der prøvene ble profilert på to forskjellige plattformer (f.eks Affymetrix U133A og U133B), setter sonde med høyere bety uttrykk verdiene ble valgt hvis flere probe sett kartlagt til samme genet. Datasettene ble deretter fusjonert basert på genet symbol med MergeMaid pakken (https://astor.som.jhmi.edu/MergeMaid) tilgjengelig gjennom Bioconductor [23]. Meta-analyser ble utført ved hjelp av RankProd metoden [24], en ikke-parametrisk statistisk metode, som utlilzes rekkene av forskjellig uttrykt gener (degs) blant de ulike studier for å generere en liste over degs mellom to forhold (for eksempel ccRCC vs normal). Betydningen av differensial gen-uttrykk er da beregnet basert på prosentandelen av falske positive spådommer (dvs. den falske funnrate, eller FDR). For denne studien, valgte vi våre lister over degs basert på en FDR på 0,05 (5%) beregnet basert på 10000 permutasjoner. Hvis du vil angi NF-kB og IFN signaturer, kuratert NF-kB og IFN-genene ble krysses med oppregulert degs. For å undersøke NF-kB og IFN signaturer i prøver med mono- eller biallelic inaktivering av
VHL
, ble degs beregnet ved hjelp LIMMA [25] og RMA-normaliserte data. Vår metodikk er oppsummert i flytskjemaet vist i figur S1
Survival analyse
genekspresjon og overlevelsesdata tilgjengelig for 55 ccRCC pasienter i TCGA database (https:. //tcga-data.nci .nih.gov /TCGA /) ble brukt for å overleve analyser ved hjelp av univariat Cox (PH) og akselerert Failure Tid (AFT) modeller [26]. En godhet-of-fit (GOF) test av Cox PH modellen ble utført [27]. Mens Cox PH modellen implisitt forutsetter at fare- og overlevelseskurver som tilsvarer to forskjellige verdier av en kovariat ikke krysse, gjør at AFT modell kryssing av kurver [28,29] og står for ikke-forholdsmessigheten av farer (eller risiko for død ) i de to gruppene. Alle testene var tosidig og brukte en type I feil på 0,05 for å bestemme statistisk signifikans. I tillegg til
p
-verdier for hver modell-fit, beregninger av relativ risiko (RR) fra Cox PH og koeffisient (β) fra akter modeller, henholdsvis, ble brukt til å bestemme omfanget av foreningen mellom genuttrykk og total overlevelse. En RR anslag i overkant av ett eller en negativ estimat av β indikere dårlig prognose med økende ekspresjon. For å visualisere foreningen av genuttrykk nivåer med total overlevelse, ble enkelte genuttrykk profiler dikotomisert ved median delt inn i «høy» eller «lav» uttrykk grupper, og Kaplan-Meier overlevelseskurver ble plottet for hver gruppe. Beregninger ble gjort ved hjelp av pakkene
overlevelse
og
lss
i R statistisk språk og miljø (https://www.r-project.org).
Resultater
Meta-analyse identifiserer NF-kB deregulering i ccRCC
Mens undersøke en offentlig tilgjengelig DNA microarray datasett av ccRCC og sammenkoblede normale prøver [30,31], vi la merke til at flere etablerte NF-kB target gen mRNA ble over uttrykt i ccRCC prøvene, sammenlignet med sine normale kontroller. Gitt de terapeutiske konsekvenser av disse observasjonene, søkte vi å finne ut om NF-kB er konstitutivt aktiv i ccRCC. Vi undersøkte derfor pasient avledet ccRCC prøver for kjernefysiske lokalisering av den klassiske NF-kB sub-enhet RELA /p65. Vi har fokusert på rela /p65, som tidligere studier har vist at rela-inneholdende dimere komplekser er den dominerende form for NF-kB i ccRCC cellelinjer, og at disse kompleksene re-lokalisere fra cytoplasma til kjernen når aktiv [32-34 ]. Av 20 distinkte ccRCC prøvestykker som ble undersøkt, 16 (80%) som vises robust nukleær farging av forhold i 50% av cellene, en indikasjon på konstitutiv NF-kB aktivitet i disse celler. En ytterligere to tilfeller viste svak nukleær farging i 20% av cellene, og to andre manifestert ingen påvisbar Rela signal i kjernen. I motsetning til dette ingen (0/8) av de normale nyre seksjoner undersøkt viste påvisbar atom rela farging. Et typisk eksempel på intens atom Rela farging i ccRCC – men ikke normalt nyrevev – er vist i figur 1a; merke til at vanlige celler i proksimale tubulære epitel, hvorfra ccRCC er tenkt å oppstå, vise bevis for
cytoplasma
RELA (Figur 1a, piler). Disse resultater antyder at konstitutivt aktiv-atom NF-kB kan være en vanlig funksjon i ccRCC, muligens som en konsekvens av NF-kB-aktivering i den rørformede epitelet i løpet av RCC tumorgenese.
(a) Immuno-histokjemisk farging som viser fremstående atom rela signal i ccRCC prøvene, men ikke i normalt nyrevev. Pilen viser cytoplasmisk farging Rela i celler av de proksimale rørformede epitel. Scale bar = 100 mikrometer. (B) oppregulert gener (X-aksen) fra meta-analyse av de fire ccRCC datasett ble plottet mot falske funnrate (FDR, Y-aksen). Oppregulert gener med FDR 0,05, som er vist i rødt, ble brukt for å definere NF-kB og IFN signaturer. (C) Heatmaps som viser ekspresjon av NF-kB signatur gener i hver av de fire angitte studier. N = normal, T = tumor. Heat bar = uttrykk nivåer (log
2 skala).
For å undersøke omfanget av NF-kB target-genet deregulering i ccRCC, vi først definert en liste av gener som uttrykk er kjent for å regulere og /eller være regulert av NF-kB. Resonnement som avvikende NF-kB aktivitet vil bli reflektert i den endrede uttrykket av disse genene, kombinert vi en offentlig tilgjengelig liste over kommenterte NF-kB målgener [(HUhttp: //bioinfolifl.fr/NF-KBUH, i stor grad basert på [ ,,,0],35]] med våre egne datasett [36,37] for å kuratere en total av 137 gener (Tabell S2) som er kjent for å regulere NF-kB, som arrangører inneholde antatte /validert NF-kB bindingsseter, og /eller som uttrykk har blitt vist til å stole på NF-kB aktivitet i ulike sammenhenger.
Vi neste undersøkt ved meta-analyse ekspresjons profilen i 137 NF-kB målgener i hel-genom transcriptomic data fra 61 ccRCC og 34 normale prøver over fire uavhengige studier som vi refererer til her ved navnene på sine første forfattere:.. Cifola, Gumz, Lenburg og Yusenko [31,38-40] Kriterier for utvelgelse av disse studiene er oppsummert i figur S1 for denne meta-analysen, vi brukte RankProd, en ikke-parametrisk statistisk metode stand til ikke bare å integrere data fra en rekke plattformer, men også til å håndtere eksperimentell variabilitet mellom datasettene [24]. På ~ 18.000 totale gener kontrollert, 3560 ble funnet å være jevnt oppregulert i ccRCC (figur 1b), mens 2,797 genene var konsekvent nedregulert, ved en falsk-funnrate (FDR) av ≤ 0,05. Av disse 58 gener (~ 42% av alle kuratert NF-kB mål) var oppregulert i ccRCC prøvene, sammenlignet med normale kontroller. Forholdet mellom NF-kB gener oppregulert i ccRCC (58/137) er svært viktig, (
p
-verdi 0,001, ensidige andel
Z
-test), når sammenlignet med prosentandelen av alle genene oppregulert i ccRCC (3560/17997; ~ 20%). I motsetning til tre ganger færre NF-kB målgener (18 gener, som representerer 13% av NF-kB mål) ble nedregulert i ccRCC; dette ble ikke funnet å være signifikant (p-verdi = 0,74). Resultatene fra denne analyse tyder på at ccRCC prøvene viser selektiv, uniformt forhøyet ekspresjon av en undergruppe av NF-kB målgener. Vi utpeke disse genene den ccRCC «NF-kB gen signatur». Figur 1c viser uttrykket profiler av NF-kB gen signatur i hver av de fire studiene
ccRCC NF-kB gen signatur var sorterbar inn i fire forskjellige kategorier:. Pro-inflammatorisk, celle-overlevelse, NF- kB regulatorer, og, overraskende, interferon regulatorer (Tabell S3). Flertallet av oppregulert NF-kB Målene ble pro-inflammatoriske (43/58). Av de resterende gener, sju var involvert i celleoverlevelse, og fem ble mate fremover eller feed-back regulatorer av NF-kB respons selv. Uventet, tre NF-kB mål (
IRF1, IRF2
, og
IRF7
) konsekvent oppregulert på tvers av alle ccRCC prøver kodet interferon regulatoriske forhold (IRFs), en familie av transkripsjonsfaktorer vanligvis forbindes med interferon-mediert medfødt-immunresponsen mot mikrobielle infeksjoner [41]. Individuelle uttrykk profiler av to representative gener fra hver kategori er vist i figur 2. Disse resultater identifiserer innenfor den ccRCC NF-kB signatur flere veletablerte mediatorer av NF-kB pro-inflammatorisk og celle-overlevelse reaksjoner, så vel som en uventede undergruppe av IFN regulatorer.
(a) Cell-overlevelse gener
BCL2 Hotell og
SOD2
, (b) proinflammatoriske gener
CCL5 Hotell og
ICAM1
, (c) NF-kB regulatorer
NFKB1 Hotell og
TNFAIP3 Hotell og (d) interferon regulatoriske forhold
IRF1 Hotell og
IRF7
. Data ble normalisert ved hjelp av RMA. Fold-endringer for Tumor (T) versus Normal (N) sammenligning ble oppnådd ved LIMMA. Y-aksen viser RMA-normalisert ekspresjonsnivået (på log
2 akse) av hvert mRNA. Blå boksene representerer genuttrykk nivåer i normalt vev, og rødt viser uttrykk i ccRCC. Den hvite linjen innenfor hver boks er medianen, og avstanden mellom boksen og kinnskjegg tyder interkvartilt områder. Hver av de fire grafene per genet representerer uttrykk profiler i arrays generert av (fra venstre til høyre) de Cifola, Gumz, Lenburg, og Yusenko studier.
En interferon signatur i ccRCC
Fascinert av den observasjon at IRF-kodende gener ble oppregulert i ccRCC, hypotese vi at i tillegg til forhøyet NF-kB aktivitet, ccRCC celler sannsynligvis skjerm øket tonisk type i (α /β) IFN signalering. Tre publiserte observasjoner ligger til grunn for denne hypotesen. Først kan genene som koder for IRFs 1,2, og 7, i tillegg til å være NF-kB mål, er også godt beskrevne IFN-stimulerte gener (ISGs) [42,43]. For det andre, de fleste cellene opprettholde lave nivåer av autokrin type I (α /β) IFN-signalering, tilsynelatende i forberedelse for akutte virusinfeksjoner [44-46]. For det tredje har vi tidligere rapportert at konstituerende NF-kB signalering er nødvendig for vedlikehold av autokrint IFN signale [36,44]. Sammen utgjør disse observasjonene tillate oss å foreslå en modell der forhøyet NF-kB signaliserte «ramper opp» tonic type I IFN signalering, som deretter øker uttrykk for ISGs (for eksempel
IRFs
) i ccRCC.
for å teste denne modellen, undersøkte vi RCC prøver for hyperaktive tonic type i IFN signaliserer. Som direkte måling av tonic type I IFN nivåer i infisert vev er utfordrende og upålitelig [36], vi i stedet undersøkte en nedstrøms konsekvens av aktiv IFN: kjernefysiske lokalisering av nøkkel IFN-responsive transkripsjonsfaktor STAT1. Som NF-kB seg selv, er STAT1 normalt cytoplasma når inaktiv, men raskt translocates til kjernen for å drive ISG uttrykk på IFN stimulering [47]. Hvis IFN-signalering blir konstitutivt forhøyet i RCC, vil STAT1 forventes å lokalisere til kjernen i RCC – men ikke normal – vev. Vi fant at 16/20 RCC prøver, men ingen av de normale nyreprøver (0/8) – vises sterke kjerne STAT1 farging (figur 3a). Bemerkelsesverdig, og etter avtale med en årsakssammenheng mellom forhøyet NF-kB signalisering og økt tonic IFN aktivitet, fullt 100% av kjernefysiske Rela-positive ccRCC prøvene var også positive for atom STAT1.
(a) Immuno-histokjemisk farging som viser robust atom STAT1 signal i ccRCC prøvene, men ikke i normalt nyrevev. (B) Heatmap viser uttrykk for IFN signatur gener etter IFN stimulering av murine embryo fibroblaster. Heat bar = fold-endring (log
2 skala). Ekspresjonsnivåene av ubehandlede celler ble vilkårlig satt til 1 (beige). (C) Heatmaps som viser ekspresjon av IFN-signatur gener i hver av de fire angitte studier. N = normal, T = tumor. Heat bar = uttrykk nivåer (log
2 skala).
Vi identifiserte fra vårt tidligere arbeid [36] totalt ~ 400 gener som er indusert minst to ganger av type I IFN (figur 3b), hvor det ekspresjonsdata var også til stede i de fire ccRCC studiene. Når vi undersøkte uttrykk for disse ISGs i ccRCC datasett, ble totalt 164 ISGs funnet å være oppregulert i ccRCC (~ 40% av alle testede ISGs, p-verdi 0,001 ved ensidige andel Z-test) , mens bare 51 ISGs ble nedregulert [~ 13%, p-verdi = 0,94]. Disse resultater indikerer at, i likhet med NF-kB, konstitutivt-forhøyet type I IFN-signalering skjer i ccRCC. Den 164-genet «IFN-genet signatur» er angitt i tabell S4, og dets ekspresjon profil i hver av de fire individuelle studier er vist i figur 3c.
neste brukte oppfinnsomhet Pathways analyse for å konstruere et nettverk som ville identifisere inter-molekylære forhold mellom NF-kB og IFN genet signaturer. Denne analysen viste en robust forbindelse mellom NF-kB og IFN signaturer via IFN-β (kodet for av
IFNB1
) og IRF-noder (figur 4). Ventet, pro-inflammatorisk og celle-overlevelse klynger ble observert i løpet av NF-kB arm av nettverket, mens mange veletablerte medfødt-immun-mediatorer var representert i IFN-signaturen armen (figur 4). Samlet utgjør disse resultatene støtte en årsakssammenheng mellom NF-kB og IFN signaturer mediert av autokrint IFN /IRF signale
Nettverket ble bygget av Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare (Ingenuity® Systems, HUhttp. //Www. ingenuity.comUH) ved hjelp av alle genene i NF-kB og IFN signaturer. Nøkkel klynger i NF-kB (brun) og IFN (blå) Armene er identifisert, og regulatoriske molekyler kontrollerende gen-nettverksnoder er vist som store sirkler.
VHL mutasjonsstatus korrelerer med uttrykk av NF- kB og IFN signaturer
Resultatene fra cellekulturstudier tyder på en årsakssammenheng mellom fravær av funksjonell pVHL protein og forhøyet NF-kB aktivitet i ccRCC [15-17]. Gitt disse observasjonene, vi spurte om mutasjonsstatus av
VHL
korrelert med utseendet av NF-kB og IFN signaturer i ccRCC. For denne analysen, har vi sammenlignet med deres respektive normale kontroller (1) epitele cellekulturer av pre-neoplastiske lesjoner nyre fra seks familiære tilfeller av VHL pasienter som hadde en funksjonell kopi av
VHL product: [48], (2) ccRCC vev fra 32 familiære tilfeller av biallelically-inaktivert
VHL product: [49], og (3) ccRCC vev fra 20 sporadiske tilfeller av biallelically-inaktivert
VHL product: [49]. Vi fant at verken NF-kB eller IFN signaturer var til stede hos pasienter med en funksjonell kopi av
VHL
. I motsetning ccRCC prøvene husing biallelic tap av VHL (enten familiær eller sporadisk i opprinnelse) viste sterk ekspresjon av både NF-kB og IFN-signaturer (figur 5). Disse dataene gir sterk støtte til ideen om at VHL inaktivering er sannsynlig årsaks knyttet til utseendet forhøyet NF-kB og IFN aktivitet i ccRCC.
Heatmaps viser brette endringer i uttrykk nivåer av NF-kB signatur gener ( a) eller IFN signatur gener (b) mellom VHL +/- prøver fra tilfeller av familiær VHL sykdom sammenlignet med
VHL
+ /+ normal renal epitel (kolonne 1); VHL – /- tilfeller av familiær ccRCC sammenlignet med normal nyre- vev (kolonne 2); eller VHL – /- tilfeller av sporadisk ccRCC sammenlignet med normal nyre- vev (kolonne 3). Heat bar = fold-endring (log
2 skala).
Forhøyet uttrykk for undergruppe av NF-kB mål korrelerer med dårlig utfall i ccRCC pasienter
For å finne ut om økt NF-kB aktivitet var assosiert med dårlig overlevelse utfall i ccRCC, undersøkte vi sammenhengen mellom uttrykket av gener i vår NF-kB signatur og total overlevelse for 55 ccRCC pasienter med genekspresjon og overlevelsesdata var tilgjengelig i Kreft Genome Atlas (TCGA) . Fra denne analysen, fant vi at økt uttrykk av fire NF-kB regulatorer og målgener (
IKBKB
,
MMP9, PSMB9
, og
SOD2
) var signifikant assosiert med høyere relativ risiko (RR), dårligere prognose, og redusert total pasient overlevelse av Cox PH-modellen (
p
-verdi 0,05, RR 1) eller av AFT modell (
p
-verdi 0,05 eller β-koeffisienten 0; se metoder). Disse fire gener utgjør en viktig regulator av NF-kB signale selv (
IKBKB
) og etablerte meklere av NF-kB celle-overlevelse og pro-inflammatoriske responser (
MMP9, PSMB9
, og
SOD2
), heve spennende mulighet som selektivt rettet mot medlemmer av denne undergruppen vil ha klinisk nytte i ccRCC. Figur 6 viser de Kaplan-Meier-kurver for disse genene og tabell S5 oppsummerer resultatene av disse analysene.
Kaplan-Meier-overlevelseskurver for gener i NF-kB signatur som har økt ekspresjonsnivå signifikant korrelert med dårligere total overlevelse resultatet vises. Individuelle genuttrykk profiler ble dikotomisert ved median delt inn i «høy» (rød) eller «lav» (blå) uttrykk grupper. Gene navn er angitt over hver graf. Vennligst se tabell S5 for
p
-verdier.
Av notatet, økt uttrykk av en femte gen (
NFKB1
, som koder for NF-kB sub-enhet P105 /P50) ble også signifikant assosiert med dårligere total overlevelse ved AFT modell (
p
verdi = 0,041). Men en positiv verdi β koeffisient (33,6) og mangel på betydning av Cox PH-modellen (p-verdi = 0,41, RR = 0,5) utelukket oss fra å avklare sin tilknytning til ccRCC progresjon, og av denne grunn har vi fokusert på
IKBKB
,
MMP9, PSMB9
, og
SOD2
.
Diskusjoner
I denne studien har vi fastslått at NF-kB er konstitutivt aktive i de fleste ccRCC prøvene testet, og har vist ved meta-analyse som nøkkel NF-kB regulatorer og mål er jevnt oppregulert over fire uavhengige studier. Vi rapporterer også oppdagelsen av en IFN signatur i ccRCC, og gi overbevisende bevis for at tap av VHL funksjonen er nødvendig for både NF-kB og IFN signaturer. Til slutt, identifiserer vi en undergruppe av potensielt druggable NF-kB regulatorer og mål som forhøyet uttrykk korrelerer med dårlig prognose og overlevelse. Av notatet, utilgjengelighet av pasientdata utelukket oss fra å undersøke om NF-kB og /eller IFN signaturer korrelerte med ccRCC scene /klasse.
Selv om NF-kB-mediert overlevelse signale sannsynlig utviklet seg til å beskytte cellene mot mitokondrie flux iboende til normale fysiologiske responser (eventuelt under cytokin-drevet anti-mikrobielle responser), flere observasjoner gjør det sannsynlig at NF-kB celle-overlevelse respons har blitt ranet av kreftceller til å fremme sin egen levedyktighet. For eksempel, grunnleggerne av NF-kB familie – er en
bona fide
onkogen, og gener som koder for NF-kB underenheter og signalkomponenter skjerm – avian retrovirale genet
v-Rel
aktiverende mutasjoner i flere svulster [anmeldt i [50-52]]. NF-kB celle-overlevelse mål koder for antioksidantenzymer som buffer mitokondrier i perioder med øket bioenergetisk etterspørsel, så vel som andre proteiner (slik som Bcl-2-familiemedlemmer Bcl-X
L og Bfl-1) som aktivt hindrer mitokondriene fra celledød under genotoksiske og metabolsk streker iboende i prosessen med tumorgenese [51,52].
Tap av pVHL har vist seg å resultere i økt NF-kB aktivitet, noe som indikerer at aktivering av NF-kB mai representerer en felles nedstrøms konsekvens av
VHL
-deficiency [15-17,33]. De Kaelin og Rettig laboratorier har gitt mekanistisk innsikt i hvordan pVHL mangel fører til økt NF-kB aktivitet ved å belyse to forskjellige veier for pVHL avhengig NF-kB regulering. Kaelin og kolleger identifisert NF-kB aktivator CARD9 som pVHL-samspill protein, og viste at pVHL fremmet hemmende fosforylering av CARD9 av kinase CK2. Ablating pVHL uttrykk økt CARD9 drevet NF-kB aktivitet, mens avskaffe CARD9 uttrykk normalisert NF-kB aktivitet i pVHL-mangel innstillinger RCC [17]. Parallelt An og Rettig bestemt at tap av pVHL, gjennom en HIF → EGFR autokrint loop, gir økt NF-kB aktivitet i ccRCC [16]. Begge mekanismene koble pVHL mangel til forhøyet NF-kB aktivitet og gi biokjemiske forklaringer på vår observasjon at økt NF-kB korrelerer godt med VHL mutasjonsstatus.
Et uventet resultat fra denne studien var oppdagelsen av at en IFN signatur karakteriserer ccRCC. Den enkleste Forklaringen på denne signatur er at det er en direkte følge av forhøyet NF-kB aktivitet. Vi foretrekker denne forklaringen av de grunner at (1) gener som koder for nøkkel noder av IFN-systemet, inkludert IFN-β og IRF-7, inneholder funksjonelle NF-kB områder i deres promotere [53,54] og enkel aktivering av NF-kB kB kan kjøre disse arrangørene [43,54]; (2) et 1: 1-korrelasjon ble funnet mellom ccRCC prøver som inneholdt atom NF-kB og de som vises aktivert STAT1, og (3) den IFN signaturen kollapser i celler som mangler NF-kB-subenhet Rela (figur 7a).
