?
Abstract
Bakgrunn
Nye bevis knytter prostatakreft med høye kolesterolverdier, med kolesterol er en viktig råvare for cellevekst. Inne i cellen, er kolesterol homeostase vedlikeholdt av to hovedtranskripsjonsfaktorer: sterol regulerende element-bindende protein 2 (SREBP-2) og lever X reseptor (LXR). Vi viste tidligere at androgen reseptor, en stor aktør i prostata cellefysiologi, bytter disse transkripsjonsfaktorene for å fremme kolesterol opphopning. Gitt at prostatakreft behandling rettet mot androgen reseptoren, velge for celler med endrede androgen reseptor aktivitet, hvordan ville dette påvirke SREBP-2 og LXR aktivitet? Ved hjelp av en roman prostatakreft progresjon modell, utforsket vi hvordan dette crosstalk mellom androgen reseptor og kolesterolhomeostase endringer i løpet av prostatakreft utvikling.
metodikk /hovedfunnene
Det første vi preget vår progresjon modell, som er involvert 1) dyrking LNCaP-celler ved fysiologiske testosteronnivåer for å generere androgen-tolerant LNCaP-305-celler, og 2) dyrking LNCaP-305 med anti-androgen Casodex å generere kastrerings-resistente LNCaP-364-celler. Denne progresjon ble fulgt av oppregulert androgen reseptor ekspresjon, vanligvis sett klinisk, og en reduksjon i androgen-reseptor-aktivitet. Selv om dette påvirket hvordan SREBP-2 og LXR målgener svart på androgen behandling, cellulære kolesterolnivået og deres respons på endrede sterol status var lik i alle LNCaP underlinjer.
Konklusjon /Betydning
Totalt kolesterol homeostase er upåvirket av skiftende androgen reseptor aktivitet i prostatakreftceller. Dette opphever ikke forholdet mellom androgener og kolesterol homeostase, men snarere antyder at andre faktorer kompensere for endret androgen-reseptor-aktivitet. Gitt at kolesterol regulering opprettholdes under progresjon, støtter denne den voksende ideen om at kolesterol stoffskiftet er et egnet mål for prostatakreft
Citation. Krycer JR, Brown AJ (2013) Har du endrer androgen Receptor Status i løpet av prostatakreft Development innvirkning på kolesterol Homeostase? PLoS ONE 8 (1): e54007. doi: 10,1371 /journal.pone.0054007
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 17 september 2012; Godkjent: 05.12.2012; Publisert: 08.01.2013
Copyright: © 2013 Krycer, Brown. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AJB forskning er støttet av et stipend fra Prostate Cancer Foundation of Australia (PG2710, https://www.prostate.org.au). JRK er mottaker av Petre Foundation stipend (https://www.petrefoundation.org.au). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Siden oppdagelsen av androgener, disse hormonene har vært nært forbundet med prostata. Normale prostata-celler er avhengig av androgener for proliferasjon, differensiering, og opprettholde sekretoriske funksjoner. Dette blir formidlet av androgen reseptor (AR), transkripsjonsfaktor aktiveres av disse hormonene.
Dette konseptet av hormonet avhengighet ble etablert av nobelprisvinner Charles Huggins [1], og danner den biologiske begrunnelsen for androgen-deprivasjon terapi (ADT), en stor moderne behandlingsstrategi for metastatisk prostatakreft (PCA). ADT innebærer medisinsk kastrering for å senke blod androgen nivåer (fra -10 nM testosteron [2] – [3] for å optimalt ~0.7 nM) [4]. Dette er ofte supplert med behandling med anti-androgener (f.eks Casodex /biculatimide), som konkurrerer med eventuelle gjenværende androgener for AR, således sikte på å fullstendig inhibere AR funksjon. Til sammen er dette todelte behandling kjent som «kombinerte androgen blokade «[5]. Selv om 80-90% av pasientene ved svarer godt til ADT, PCA tilbakefall til slutt i en median periode på 18 måneder [6], utvikler seg til en «kastrering-resistent» tilstand som gjør ADT ineffektiv.
Castration- resistente PCa (CR-PCA) er svært aggressive, assosiert med høyest dødelighet fra PCa. Det er således et behov for å bedre forstå de fenotypiske forandringer som oppstår under progresjonen til CR-PCa. En slik karakteristikk nylig økende interesse er kolesterol stoffskiftet (f.eks [7]). Høyt kolesterolnivå har vært knyttet til PCa risiko i epidemiologiske studier [8] – [9], mens laboratoriestudier har identifisert at intracellulære kolesterolnivået stige når prostata celler er kreft [10]. Slike kolesterol akkumulering kan fremme PCa utvikling som en forløper for syntetisering membraner, androgener, og andre aktører i signalveier [7], [11]. Således har kolesterolsenkende medikamenter blitt vurdert for behandling PCa [7] – [9], [12]. Dette arbeidet vil bli styrket ved å studere de underliggende årsakene til kolesterol opphopning ved PCA
I cellen er kolesterolnivået i hovedsak regulert av to hovedtranskripsjonsfaktorer. Sterol regulatorisk element-bindende protein isoform 2 (SREBP-2) og lever X reseptor (LXR). SREBP-2 oppregulerer gener involvert i kolesterol syntese (f.eks
HMGCR
) og opptak (f.eks low-density lipoprotein reseptoren,
LDLR
). Dette øker kolesterolnivået, som reduserer SREBP-2 aktivitet ved tilbakemeldinger regulering. I kontrast, oksygenkolesterolderivater (oxysterols) aktivere LXR, noe som senker cellulære kolesterolnivået ved oppregulering gener involvert i kolesterol utstrømming, for eksempel ATP-bindende kassett transporter isoformer A1 (
ABCA1
) og G1 (
ABCG1
)
Disse to transkripsjonsfaktorer påvirkes av androgener: AR aktiverer SREBP-2 av oppregulering sin regulator, scap [13] – [14], og hemmer LXR av coactivator konkurranse [14].. Ved å gjøre dette, justerer AR kolesterolhomeostase i en samordnet måte, noe som gir en mekanisme for hvordan androgener fremme kolesterol akkumulering i prostataceller (for eksempel [15]). Gitt at CR-PCA oppstår fra å endre androgen (og AR) status, her utforsker vi hvordan kolesterolhomeostase endringer i løpet av progresjon til CR-PCA. For å oppnå dette, bruker vi en ny CR-PCA progresjon modell
For å studere CR-PCA
in vitro
, progresjon modeller (f.eks [16] – [17]). Vanligvis genereres av androgen-frata LNCaP-cellelinje, en androgen-avhengig, AR-positive PCa-cellelinje [18]. Disse modellene er mer informative enn androgen-uavhengig cellelinjer, så som PC-3 som ikke uttrykker AR [19], fordi de tillater en direkte sammenligning mellom sperre og androgen-uavhengige celler.
Mens tidligere LNCaP-progresjon modeller har generert et vell av informasjon om androgen-uavhengig PCa (anmeldt i [20]), det har vært to store begrensninger. Først, LNCaP-celler er rutinemessig dyrket i medium supplert med føtalt bovint serum (FBS), som inneholder androgennivåer tilsvarende en kastrert humant hannkjønn [2]. Senere har LNCaP cellelinjen er valgt ut til å vokse i en androgen-knappe miljø, i motsetning til klinisk «hormon-naive» (pre-ADT) PCa. Faktisk, fysiologiske, ikke-kastrerte testosteronnivå (~ 10 nM [2] – [3]) hemmer cellevekst LNCaP (f.eks [21]) fordi AR fungerer som en «lisensiering faktor» som hindrer celle-syklus progresjon [ ,,,0],22] – [23]. For det andre, LNCaP cellene er vanligvis androgen-ute av langsiktig kultur i media supplert med trekull-strippet FBS. Trekull-stripping fjerner ikke bare androgener fra FBS, men andre hormoner og vekstfaktorer, og kan således ikke tilstrekkelig representere klinisk ADT. Vi har generert en progresjon modell som overvinner disse begrensningene [12].
Her karakteriserer vi denne modellen, bruker den til å teste hypotesen om at endringer i AR signalering og kolesterol homeostase i CR-PCA celler er i slekt. Gitt at AR påvirkninger kolesterolnivået, undersøke om dette samspillet endres i løpet av progresjon til CR-PCA vil bidra til å fastslå potensialet av kolesterol stoffskiftet som et mål for CR-PCA.
Resultater
Karakterisering av kastrering-resistente PCa progresjon modell
LNCaP-celler ble opprinnelig dyrket i FBS supplert med en fysiologisk konsentrasjon av testosteron, genererer den 305-cellelinje (figur 1A). Disse cellene representerer androgen-avhengige PCA celler som kan vokse på serum-androgen nivåer, tåler høyere androgen konsentrasjoner enn foreldre LNCaP celler (figur 1C). Denne tilnærmingen for utvikling av androgen-tolerant celler ble tilsvarende utført tidligere [17], bortsett fra at vi erstattet syntetisk AR-agonist R1881 med testosteron. Det er sannsynlig at påvirkning av testosteron er på grunn av direkte aktivering av AR eller omdannelse til potent androgen, dihydrotestosteron, i stedet for aromatisering til østrogener fordi testosteron og dihydrotestosteron har lignende virkning på cellelevedyktighet (figur S1A).
(A) Skjematisk som beskriver utviklingen av disse LnCap sub-linjer, omfatter langvarig dyrkning i nærvær av enten testosteron (T) eller Casodex (CDX). Detaljer i teksten. (B-D) Celler ble behandlet med 10% (v /v) sera og konsentrasjonene av medikamenter indikert. I (B), omfatter dette FBS (LNCaP) eller FBS supplert med 10 nM T (305) eller 10 pM CDX (364). I (C) og (D), omfatter dette FBS eller CS-FBS, med T og CDX ved konsentrasjoner som indikert. Celleformering ble bestemt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (B-D) datapresentert som gjennomsnitt + S.E., fra tre separate forsøk per celle-linje, hver utført med kvadruplikeres brønner per tilstand. I (D), er feilfelt innenfor de symboler.
For å simulere ADT (spesielt, kombinert androgen blokade), 305 celler ble dyrket i FBS (inneholder kastrat nivåer av androgener) supplert med anti -androgen Casodex (figur 1A). Dette førte til den androgen-uavhengige 364 cellelinjen, som har liten proliferative respons til enten androgener (figur 1C) eller anti-androgener (figur 1D). Denne fenotype var stabil i minst 10 passasjer (fig S1B). Videre, som en positiv kontroll, PC-3 celler var tilsvar svarer til media-androgen status (figur S1C).
I forhold til 305 og foreldre LNCaP celler, de 364 cellene vokste saktere (Tall 1B, S1D) og uavhengig av media-androgen status (Tall 1C, D). Dette er forskjellig fra andre studier (tabell 1), sannsynligvis på grunn av dyrking i FBS snarere enn CS-FBS, og dermed sikre at bare AR aktivitet er målrettet i vår langsiktige utvalg av 364 celler. Videre uavhengigheten av 364 celler fra media-androgen status ga liten fordel i CS-FBS (figur 1B), noe som tyder på at kull-stripping ikke bare fjerner androgener, men andre vekstfremmende faktorer. Dette rettferdiggjør vår tilnærming for å generere en kastrering-resistente cellelinje ved Casodex behandling i FBS (figur 1A).
Neste, vi preget AR status for disse cellelinjene via AR protein uttrykk og AR aktivitet, sistnevnte vurdert av mRNA uttrykk for den kanoniske AR-target genet,
PSA plakater (prostataspesifikt antigen). Den autoregulation av AR nivåer (f.eks [24]) kan sees med testosteron og Casodex behandling i LNCaP celler (figur 2A,
baner
1-3). I forhold til disse foreldreceller, 305 celler hadde høyere AR protein nivåer i deres basal media (figur 2A,
kjørefelt
5 vs 1), men lignende AR aktivitet (figur 2B). Likeledes, i henhold til androgen-mangel forhold (CS-FBS), 305 celler hadde redusert serum respons til dihydrotestosteron (figur 2C), vist av både
PSA
mRNA nivåer (
toppanelet
) og
PSA
promoter aktivitet (
nedre panelet
). Sammen, gjenspeiler dette deres tilpasning til høyere serum-androgen nivåer ved redusert AR-aktivitet.
(A-B) Celler ble dyrket i medium A med 10 nM testosteron (T) eller 10 pM Casodex (CDX). (A) Protein ble høstet og underkastet SDS-PAGE og Western blotting mot androgenreseptoren (AR) og α-tubulin. (B) RNA ble høstet og
PSA
mRNA-nivåer ble bestemt ved QRT-PCR, normalisert til de LNCaP-celler. (C)
Topplate
: Cellene ble sultet i Medium B i 24 timer, før behandling med 1 nM dihydrotestosteron (DHT) og /eller 10 mm CDX i Medium B i ytterligere 24 timer. Etter behandling, ble RNA høstet og
PSA
mRNA nivåer ble bestemt ved QRT-PCR, normalisert til bilen behandlede LNCaP celler.
Bunnplate
: Etter transfeksjon ble cellene sådd ut i medium B. Den neste dag ble cellene behandlet med 1 nM DHT og /eller 10 uM CDX i Medium B i ytterligere 24 timer. Etter behandling ble cellene analysert for luciferaseaktiviteten, gjort i forhold til kjøretøyets stand innen hver cellelinje. (D) Sammendrag av resultatene oppnådd i (A-C). (A) Blottene er representative for fire separate forsøk. (B-C) Dataene presenteres som gjennomsnitt + SE, fra tre separate forsøk per celle-linje, hver utført med tredoble brønner per tilstand.
Videre 364 celler har enda høyere AR nivåer (Figur 2A ), som er blitt observert i andre
in vitro
-studier (tabell 1) og mange kliniske CR-PCA prøver (f.eks, ~ 30% av kliniske CR-PCA prøvene AR genamplifikasjon som har vist seg å øke AR uttrykk [25] – [27]). Selv om basal AR-aktivitet var lavere (figur 2B), Casodex handlet agonistically (figur 2C) som sett i andre studier (tabell 1). Kollektivt, reflekterer vår modell en betydelig undergruppe av CR-PCA og viser en endring i AR aktivitet i løpet av progresjon til kastrering-motstand (figur 2D).
Har kolesterol homeostase endring i denne modellen?
Gitt at AR fremmer SREBP-2 aktivering og hemmer LXR [13] – [14] (figur 3A), hvordan er disse interaksjonene som er berørt av kastrering-motstand? For å utforske dette, vi undersøkte responsen SREBP-2 og LXR målgener (figur 3A) til androgene manipulasjon.
(A) Skjematisk skisserte virkningene av androgen reseptor (AR) på sentrale transkripsjonsfaktorer i kolesterol homeostase. Detaljer i teksten. (B-C) Cellene ble sultet i Medium B i 24 timer før behandling med 1 nM dihydrotestosteron (DHT) og /eller 10 uM CDX i Medium B i ytterligere 24 timer. Etter behandling, ble RNA høstet og (B)
LDLR Hotell og
HMGCR
, og (C)
ABCG1 Hotell og
ABCA1
, mRNA nivåer ble bestemt ved QRT-PCR, normalisert til kjøretøyets tilstand i hver cellelinje. (B-C) data presentert som gjennomsnitt ± SE, fra tre separate forsøk per celle-linje, hver utført med tredoble brønner per tilstand.
Som vi har vist tidligere [14], økt dihydrotestosteron behandling SREBP-to target genekspresjon (figur 3B) og redusert LXR mål genuttrykk (Figur 3C) i LNCaP celler, og disse effektene ble reversert av Casodex. De 305 cellene viste en lignende trend, men avstumpet (Figurene 3B, C), på linje med redusert AR-aktivitet sammenlignet med LNCaP-celler (Figur 2). På samme måte i 364 celler, SREBP-2 og LXR aktivitet var ikke svarer til dihydrotestosteron behandling og Casodex handlet agonistically å redusere LXR mål genuttrykk (Tall 3B, C). Dermed har hele progresjon modellen androgen status varierende effekt på SREBP-2 og LXR.
Derfor bør disse to store kolesterol regulatorer bli påvirket av den endrede AR aktivitet under progresjon. Faktisk finner vi et lignende mønster til
PSA
uttrykk. For det første var det liten forskjell i mål-genekspresjon mellom LNCaP og 305-celler (figur 4). For det andre, som
PSA
, SREBP-2 mål genuttrykk er redusert i 364 celler (Figur 4A). Gitt AR motvirker LXR (figur 3C),
ABCG1
uttrykk er høyere i 364 celler som forventet, men
ABCA1
uttrykk er redusert (figur 4B).
Celler ble dyrket i deres basal media: Medium A (LNCaP), supplert med 10 nM testosteron (305) eller 10 mm Casodex (364). RNA ble høstet og (A)
LDLR Hotell og
HMGCR
, og (B)
ABCG1 Hotell og
ABCA1
, mRNA nivåer ble bestemt ved qRT- PCR, normalisert til de LNCaP-celler. (A-B) data presentert som gjennomsnitt + SE, fra tre separate forsøk per celle-linje, hver utført med tredoble brønner per tilstand.
Til tross for disse endringene, steady state kolesterolnivået var lik mellom LNCaP, 305, og 364 celler (figur 5A). Av dette ~95% var fritt kolesterol (som tidligere er funnet i LNCaP-celler [14]) i alle cellelinjer (data ikke vist). Særlig gitt at det er en to-ganger økning i kolesterolnivået når prostata epitelceller utvikle seg PCa [10], tyder dette på at basal kolesterol homeostase er opprettholdt til tross for endrede AR status under progresjon til kastrering-motstand.
( A) Celler ble dyrket i sin basale medier: Medium A (LNCaP), supplert med 10 nM testosteron (305) eller 10 pM Casodex (364). Kolesterolnivået ble bestemt som beskrevet i Materialer og metoder. (B) Cellene ble behandlet i sin basale medier, hvoretter LDL-opptaket ble bestemt. (C) Cellene ble sådd ut i deres basale medier, så sultet over natten i medium C. Den neste dagen ble cellene behandlet i 6 timer med eller uten 10 mM 25-Hydroxycholesterol (25-HC) i medium C, hvoretter LDL-opptaket var fast bestemt. (A-C) Dataene presenteres som gjennomsnitt + SE, fra tre separate forsøk per celle-linje, hver utført med tredoble brønner per tilstand.
Men dette snapshot ikke belyse om castration- resistente celler reagerer forskjellig på å endre sterol status. For eksempel ved å finne basal LDL opptaket var lik mellom cellelinjer (figur 5B), vi undersøkte responsen på oxysterol, 25-hydroxcholesterol, noe som reduserer SREBP-2 aktivitet og dermed LDLR aktivitet [28]. Alle cellelinjer reagert på samme måte som 25-Hydroxycholesterol behandling (figur 5C). For å undersøke deres sterol respons videre, vi returnerte til transkripsjonsregulering, ved hjelp av 25-Hydroxycholesterol samtidig hemme SREBP-2 og aktiverer LXR. Selv om vi brukte luciferase assays tidligere for dette formål [12], analyserte vi target-genekspresjon her for å gjøre oss i: 1) for å undersøke LXR og SREBP-2 aktivitet samtidig i de samme cellepopulasjoner, og 2) å ha kortere behandlingstider (mRNA nivåer vanligvis reagere raskere enn promoter-drevet luciferase nivåer), slik at vi kan undersøke en akutt reaksjon på steroler. Som et bevis på prinsippet bekreftet dette assay som PC-3-celler har høyere SREBP-2-aktivitet enn LNCaP-celler (figur S2A), som vist tidligere [28]. I kontrast, SREBP-2 reagerte på samme måte som 25-Hydroxycholesterol i LNCaP, 305, og 364 celler (Figur 6,
topplater
)
Celler ble sådd i deres basal media. Medium A (LNCaP), supplert med 10 nM testosteron (305) eller 10 pM Casodex (364). Cellene ble sultet over natten i medium C, og deretter behandlet i 6 timer med 25-Hydroxycholesterol (25-HC) i medium C, ved de konsentrasjoner som indikert. Etter behandling, ble RNA høstet og
LDLR
,
HMGCR
, og
ABCG1
nivåer ble bestemt ved QRT-PCR, normalisert til kjøretøyets tilstand innenfor hver celle-linje. Data presentert som gjennomsnitt ± SE, fra tre separate forsøk per celle-linje, hver utført med tredoble brønner per tilstand.
I tillegg har denne oxysterol hadde samme effekt på LXR-målet genet (
ABCG1
) uttrykk i både LNCaP og 364 celler (Figur 6,
nedre panelet
). Dette svaret var svakere i 305 celler, men gjenopprettet når cellene ble sådd i FBS uten testosteron tilskudd (figur S2B). Tangentialt, har vi funnet en lignende effekt i LNCaP-celler (data ikke vist), noe som antyder at disse cellene kan akkumulere androgener forutgående behandling i usupplert media; Dette gjenværende androgen igjen kan stimulere AR og hemme LXR-drevet
ABCG1
uttrykk (Figur 3C). Likevel antyder denne modellen som avstumpet AR aktivitet i kastreringsresistent celler ikke innvirkning på deres evne til å svare på mobil sterol status.
Diskusjoner
I denne studien har vi karakterisere en
in vitro
PCa-modell som består av tre komponenter (figur 1): (1) LNCaP-celler, som er tilpasset til lave serumnivåer-androgen, (2) 305-celler, innrettet til høye serumnivåer-androgen, og (3 ) 364-celler tilpasset til vekst uavhengig av serum-androgen status. Disse tilpasninger ble ledsaget av endringer i AR-aktivitet (figur 2). Selv om krysstale mellom AR og kolesterol regulering avtar fra LNCaP til 305 til 364 celler (figur 3), fant vi at den samlede kolesterol homeostase forblir upåvirket (Tall 4,5,6).
I vår PCa modell hadde androgen-tolerant 305 celler redusert AR respons i forhold til LNCaP celler (figur 2), men var like følsomme for androgen-deprivasjon (figur 1). Dermed har vi simulert kombinert androgen blokade av Casodex behandling i androgen fattige FBS. De resulterende 364 celler har høyere AR uttrykk, som er en konsekvent forandring med progresjon til CR-PCa
in vivo product: [29] og observert i kliniske prøver [25], [30]. Økt AR ekspresjon kan føre til at anti-androgener til å fungere som agonister (for eksempel [16], [29], [31]), som observert her (Figur 2) – dette er avhengig av AF-1-domene av AR, som tyder forandret støkiometri med transkripsjons coregulators [31]. Økt AR uttrykk og Casodex agonism er et felles tema felles med tidligere studier (tabell 1) – interessant, var CS-FBS brukt i disse studiene (tabell 1, figur 2), mens dette Casodex agonism gikk tapt i FBS (data ikke vist) , noe som tyder på at serum bakgrunn kan påvirke coregulator støkiometri. Likevel, ved å utnytte den lave androgen innholdet i FBS og unngå langvarig kultur i CS-FBS, har vi fått tre LNCaP sub-linjer som varierer i deres AR aktivitet.
Gitt crosstalk mellom AR, SREBP- 2 og LXR (figur 3), disse cellene gir mulighet til å undersøke effekten av ulike AR tilstander ved PCA på kolesterol homeostase (figurene 4-5). Fra LXR aksen, observerte vi en avvikende respons mellom LXR genet mål: med redusert AR aktivitet i 364 celler (figur 2), basal
ABCG1
uttrykk Sprak steg, mens
ABCA1
uttrykk var redusert (figur 4). Dette ble observert før i kastreringsresistent celler valgt fra langsiktig dyrking i CS-FBS [32], noe som tyder på at AR kan også påvirke ABCA1 gjennom et mellomliggende som motsetter LXR. Det samme mellom kan også påvirke SR-BI, en annen LXR målet genet (for eksempel [33]) som formidler HDL opptak og utstrømming [34], siden
SR-BI
mRNA uttrykk ble også redusert i 364 celler ( Figur S3). Videre viste preliminære eksperimenter ingen forskjell i serumavhengige kolesterol utstrømning mellom våre LnCap sub-linjer (data ikke vist), men fremtidige studier bør vurdere bestemte kolesterol bærere for å dissekere utveksling av kolesterol med det ekstracellulære miljø, for å bestemme konsekvensene av denne avvikende regulering mellom SR-BI, ABCA1, og ABCG1.
i motsetning til en annen gruppe kultivert LNCaP transplantater i kastrerte mus, funn som
ABCA1 Hotell og
SR-BI
uttrykk ble økt i de kastreringsresistent svulster [35], men
ABCG1
uttrykk ble ikke undersøkt. Ved hjelp av denne samme modell,
SREBP-2
mRNA og aktivert SREBP-2 protein var høyere følgende progresjon til CR-PCA [36], sammen med økt kolesterol syntese [35]. Dette samsvarer med uttrykket profil studier på pasienter, finne økt uttrykk av SREBP-2 [37] og sterol biosyntetiske [38] gener. En annen studie fant redusert uttrykk [39], i tråd med nedgangen i SREBP-2 målgener observert her i 364 celler, som igjen korrelerer med redusert AR aktivitet. Til tross for disse endringene, steady state kolesterolnivået var lik mellom androgen-avhengige PCA og CR-PCA celler, både i denne studien (figur 5A) og i
in vivo
xenograft modell [35]. Så langt vi kjenner til, er det ingen informasjon om kolesterolnivået av CR-PCA metastaser.
Men disse observasjonene ikke hensyn til den dynamiske naturen av kolesterol homeostase. Derfor undersøkte vi effekten av AR status på respons fra cellene til å endre sterol status – så langt vi er klar over, er dette den første studien som for eksempel kolesterol homeostase mellom foreldre og kastreringsresistent LNCaP celler. Mens SREBP-2 er normalt feedback-regulert av steroler, tyder bevis for at CR-PCA celler er sterol-resistente, basert på høyere moden SREBP-2
in vivo product: [36] og høyere SREBP-2 aktivitet i AR -negative PC-3-celler sammenlignet med LNCaP-celler ([28], fig S2A). Men vi fant ut at SREBP-2 og LXR i LNCaP, 305, og 364 celler reagerte på samme måte som steroler (figur 6), med lignende resultater på funksjonelt nivå med LDL opptak (figur 5). Å være skeptisk innebærer dette progresjon modellen langsiktig kultur som kan gi andre enn AR status endringer. Således kunne man hevde at disse funnene kan bli støttet av flere direkte genetiske manipuleringer (for eksempel AR overekspresjon og knockdown), men øker AR uttrykk trenger ikke nødvendigvis å øke AR-aktivitet (som vist i 364-celler), forbigående transfeksjoner vil påvirke levedyktigheten (tilsvar å manipulere AR-aktivitet i figur 1), og stabile transfeksjoner ville medføre langvarig kultur og således har de samme begrensningene.
Likevel funnene her innebære at det er kompenserende mekanismer for å motvirke endringer i kolesterolhomeostase [ ,,,0],40], på grunn av tap av basal AR-aktivitet. For eksempel er androgen ablasjon ledsaget av en økning i aktiv Akt [41], et signalerings kinase som vi har funnet å forbedre SREBP-2-aktivering [42]. Videre, mens den nåværende
in vitro
studien muliggjør en reduksjonistisk tilnærming og manipulasjoner som endrer cellulære sterol status, betyr det ikke høyde for endringer som skjer
in vivo
. For eksempel, er prostatavevet normalt hypoksisk, og dette forsterkes av androgen ablasjon [43] – gitt forholdet mellom sterol Homeostase og oksygennivå [44], bør fremtidige eksperimenter utforske denne ved PCA
Totalt vår. arbeidet opphever ikke forholdet mellom androgener og kolesterol homeostase i PCA-celler (figur 3), men antyder at andre faktorer kan kompensere for endringer i basal AR-aktivitet mellom forskjellige pca celler. Disse må belyses i fremtidige eksperimenter. Hvis kolesterol regulering er uendret i løpet av progresjon til CR-PCA, har dette to implikasjoner: For det første, at cellene trenger for å opprettholde tilstrekkelig kolesterolinnholdet til å opprettholde vekst (regulatorer medier dette fortsatt trenger å bli funnet), og andre, at CR-PCA ville være like utsatt som naive PCa til narkotika som manipulerer kolesterol stoffskiftet. Vi har tidligere funnet ut at LNCaP og 364 celler er begge følsomme for legemidler som hemmer SREBP-2 aktivitet [12], som støtter den voksende ideen om at kolesterol stoffskiftet er et egnet mål for CR-PCA [7].
Materialer og metoder
Material
FBS ble hentet fra Bovogen (Vic, AU) og penicillin /streptomycin fra Life Technologies (Vic, AU). Alle andre mediekomponenter ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (NSW, AU). Som beskrevet tidligere, ble FBS laget hormonmangelfull ved å generere trekull-strippet FBS (CS-FBS) [14], eller kolesterol-mangelfull ved å generere lipoprotein-manglende FBS (FBLPDS) [28]. DII-merket LDL (DII-LDL) ble fremstilt som tidligere beskrevet [28]. Casodex (bikalutamid), Hoechst-33258, Compactin (mevastatin), mevalonat, og 25-Hydroxycholesterol ble oppnådd fra Sigma-Aldrich. Testosteron og dihydrotestosteron var gaver fra Dr David Handelsman (ANZAC Research Institute, NSW, AU).
Cell kultur
PCA cellelinjer, LNCaP [18] og PC-3 [19] , var en gave fra Dr Pamela Russell (Australian Prostate Cancer Research Centre, Qld, AU), og ble opprettholdt i medium A (RPMI 1640, supplert med 10% (v /v) FBS, 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin). Genereringen av LNCaP-305 ( «305») og LNCaP-364 ( «364») celler ble tidligere beskrevet [12]. Tallene «305» og «364» indikerer forsøket indeksnummeret. 305 og 364-celler ble opprettholdt og podet i deres valg media, å være Medium A supplementert med 10 nM testosteron eller 10 pM Casodex respektivt. Før plating celler, plater og retter ble behandlet med polyetylenimin (Sigma-Aldrich) for å øke cellulær adhesjon som tidligere beskrevet [12]. Som spesifisert i eksperimenter ble PCA-celler behandlet i medium B (RPMI 1640, supplementert med 10% (v /v) CS-FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) for å fjerne innvirkningen av eksogene androgener. Alternativt ble cellene behandlet i medium C (RPMI, supplert med 10% (v /v) FBLPDS, 5 uM Compactin, 50 uM mevalonat, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) for å senke cellulær kolesterol status for etterfølgende sterol behandling [12]
Hoechst assay for celle-proliferasjon
celler ble sådd og behandlet som i celleviabilitet analyser tidligere beskrevet av vår gruppe [12] -. i korthet ble cellene sådd ut på 10.000 celler per brønn i 96-brønners plater i fenol-rød-fri RPMI, supplert med 0,1% (v /v) bovint serumalbumin. Den neste dag ble cellene behandlet ved tilsetning av et likt volum fenol-rød-fri RPMI inneholdende serum og medisiner til hver brønn, for å oppnå sluttkonsentrasjoner som er angitt i figurene. Etter behandling, ble det WST-1-analysen unngås her fordi vi har funnet at høyere konsentrasjoner androgen stimulert WST-1 reduksjon samtidig redusere cellenes levedyktighet (figur SA), for således dissosiering den antatte sammenheng mellom metabolsk aktivitet og levedyktighet i WST-1-assay. Således cellevekst i stedet ble kvantifisert ved anvendelse av en Hoechst flekk-analyse [45], med noen modifikasjoner: Mediet ble aspirert og platen ble frosset ved -80 ° C. Plater ble raskt tint ved romtemperatur, og 100 pl vann tilsatt per brønn før frysing på nytt ved -80 ° C. Platene ble tint, fulgt av tilsetning av 100 ul Hoechst-33258-oppløsning, inneholdende 10 ug /ml Hoechst 33258-i TNE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 2 M NaCl, 1 mM EDTA). Den fluorescens ble målt til
F
Ex = 360 nm og
F
Em = 440 nm, ved hjelp av Fluostar Galaxy fluorometer (BMG Labtech, Vic, AU).
Western blotting
etter behandling, ble celleprotein analysert ved Western blotting som beskrevet tidligere [14] – kort sagt, ble cellene lysert ved hjelp av SDS ((1% [w /v] SDS, 10 mM
