Abstract
Aberrant uttrykk for cadherins og catenins spiller sentrale roller i eggstokkreft utvikling og progresjon. Plakoglobin (PG, γ-catenin) er en paralog av β-catenin med dual lim og signaleringsfunksjoner. Mens β-catenin har kjent onkogene funksjon, PG generelt fungerer som en tumor /metastase lyddemper. Vi har nylig viste at PG samhandlet med p53 og at veksten /metastase hemmende funksjon kan være mediert av dette samspillet. Svært lite er kjent om rollen til PG i eggstokkreft. Her har vi undersøkt
in vitro
tumor /metastase suppressor effekter av PG i eggstokkreft cellelinjer med mutert p53 uttrykk og ulike cadherin profiler. Vi viste at N-cadherin uttrykke og E-cadherin og PG mangel ES-2-celler ble svært trekkfugl og invasiv, mens OV-90 celler som uttrykker E-cadherin, PG og svært lite /ingen N-cadherin ikke var. Eksogene uttrykk for PG eller E-cadherin eller N-cadherin knockdown i ES-2 celler (ES-2-E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad) betydelig redusert sin migrasjon og invasjon. Også PG ekspresjon eller N-cadherin knockdown signifikant redusert ES-2-celler vekst. Videre PG samhandlet med både cadherins og med villtype og mutant p53 i normale eggstokkreft og ES-2-PG cellelinjer, henholdsvis
Citation. Alaee M, Danesh G, Pasdar M (2016) Plakoglobin Reduserer
in vitro
vekst, migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler som uttrykker N-cadherin og Mutant p53. PLoS ONE 11 (5): e0154323. doi: 10,1371 /journal.pone.0154323
Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, KINA
mottatt: 9 desember 2015; Godkjent: 12 april 2016; Publisert: 04.05.2016
Copyright: © 2016 Alaee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Breast Cancer Foundation, Prairies /NWT (MP, drift); Alberta Cancer Foundation (MA, utdannet fellesskap); Kvinner Barnas Health Research Institute (GD, Sommer student)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser
Innledning
Eggstokkreft (OVCA), den femte mest utbredte. kreft hos kvinner er den største årsaken til alle kvinnelige reproduktive kreftdødsfall på verdensbasis, med en samlet fem års overlevelse på ~ 45% [1]. Den viktigste formen for OVCA er ovarialcancer (EOC), som står for ~ 80% av alle eggstokkene svulster [2]. EOCs er klassifisert i type I og type II [3]. Type I svulster er genetisk stabil, langsom vekst, og har relativt god klinisk utfall. Men de fleste av OVCA er type II. Over 90% av disse svulstene havn p53 mutasjoner, er genetisk ustabile, svært aggressiv og har dårlig klinisk utfall [4-6].
TP53
mutasjoner antas å være et tidlig hendelse under utviklingen av type II svulster og bidra til både metastatisk progresjon og chemoresistance [7-12]. p53 er en transkripsjonsfaktor og tumor suppressor som spiller viktige roller i regulering av cellevekst, overlevelse, senescence, apoptose og metabolisme [13]. Som svar på stress, aktiverer p53 DNA skade respons, cellesyklus arrest og celledød [14,15]. Ulike posttranslational modifikasjoner og protein-protein interaksjoner regulere p53 stabilitet og funksjoner [16]. Vi har identifisert plakoglobin (PG, γ-catenin) som en roman samspill partner av både villtype (WT) og mutant p53 (mp53) [17,18].
Plakoglobin er medlem av Armadillo familien proteiner og en paralog av β-catenin [19,20]. I motsetning, β-catenin, som bare forbinder med adherens veikryss og besitter kjente onkogene funksjoner, er PG en svulst /metastase suppressor protein og deltar i dannelsen av både adherens veikryss og desmosomes [19,21]. PG kan gi vekst /metastase-hemmende effekter via interaksjon med cadherins og induksjon av kontakt inhibisjon av vekst [19]. I tillegg kan den kommunisere med en rekke intracellulære partnere, inkludert transkripsjonsfaktorer [17-19,22-27]. Vi har vist at PG samhandler med p53 og dens tumor /metastase suppressor funksjon kan, i hvert fall delvis, være mediert av dette samspillet [17,18].
En rekke studier har antydet at tapet av cadherin- catenin kompleks og aktivering av β-catenin onkogene funksjon spiller sentrale roller i den lokale invasjonen av ovarietumorceller og påfølgende metastase [28-31]. Videre er tap av heterozygositet av PG-genet (JUP) er rapportert i sporadiske OVCAs [32]. Men svært lite er kjent om rollen til PG i OVCAs. I denne studien, vurdert vi de potensielle tumor /metastase suppressor funksjoner av PG i OVCAs, ved hjelp av de vanlige ovarie cellelinje IOSE-364 og OVCA cellelinjer OV-90 (PG og E-cadherin positiv, mp53 uttrykker), ES-2 ( PG og E-cadherin negative, N-cadherin positive og mp53 uttrykke), ES-2-PG (ES-2 transfektanter som uttrykker PG), ES-2-E-cad (ES-2 transfektanter uttrykker E-cadherin) og ES- 2-SHN-cad (ES-2 celler hvor N-cadherin har blitt slått ned). Vi undersøkte PG nivåer, lokalisering og samhandling med E- og N-cadherin og p53 og vurderes veksten, trekkende og invasive egenskapene til ulike cellelinjer. Resultatene viste at PG samhandlet med både cadherins og p53. Eksogene uttrykk for E-cadherin eller PG eller knockdown av N-cadherin betydelig redusert migrasjon og invasjon av ES-2 celler. Videre PG uttrykk og N-cadherin knockdown, men ikke E-cadherin uttrykk betydelig redusert ES-2 celler vekst.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kulturforhold
IOSE -364 (heretter IOSE) ble dyrket i en 1: 1 M199 og M105 MCDB media pluss 5% FBS og 1% PSK (penicillin, streptomycin, kanamycin). OV90 celler ble holdt i de samme M199 og MCDB M105 media pluss 15% FBS og 1% PSK. ES-2-celler ble dyrket i McCoys 5a media gjennomført med 10% FBS og 1% PSK. ES-2-E-CAD og ES-2-PG-celler ble dyrket i ES-2-medier inneholdende 400 ug /ml (utvalg) eller 200 ug /ml (vedlikehold) G418. ES-2-shNcad transfektere maur ble dyrket i ES-2-medier med 1 ug /ml (utvalg) eller 0,5 mikrogram /ml (vedlikehold) puromycin.
Transfeksjon
plasmider som koder E-cadherin og PG er blitt beskrevet [33, 34]. Kulturer av ES-2 celler i 60 mm eller 100 mm skåler ble transfektert på 50-75% konfluens med 10-25μg av DNA ved hjelp av kalsiumfosfat. Tyve timer etter transfeksjon ble cellene skylt med PBS og tillatt å komme seg i 24 timer i fullstendig vekstmedium. For å velge stabile transfektanter, 72 timer etter transfeksjon ble media inneholdende 400 ug /ml G418 (ES-2- PG og ES-2- E-CAD-transfektanter) ble tilsatt til cellene og resistente kolonier selektert for 3-4 uker. Resistente kloner ble opprettholdt i 200 mikrogram /ml G418 og skjermet for PG og E-cadherin uttrykk ved immunfluorescens og immunoblottingforsøk analyser.
N-cadherin knockdown
Menneske N-cadherin lentiviral shRNA plasmid [35 ] ble brukt til å transfektere Phoenix-AMPHO celler ved anvendelse av kalsiumfosfat. Lentiviral partikler som samles ved 48 og 72 timer etter transfeksjon ble kombinert og filtrert ved anvendelse av et 0,45 um lav-proteinbinding filter. Lentiviral partikler ble anvendt til å transdusere ES-2-celler i nærvær av 8 ug /ml polyberene (Santa Cruz, Canada). Puromycin-resistente stabile cellelinjer som uttrykker den N-cadherin shRNAs (ES-2-Shn-CAD) ble isolert, og de N-cadherin nivåer bestemt ved immunblot og immunofluorescens.
immunoblotanalyse
Konfluent 100 mm kulturplater ble renset med kald PBS og solubalized i SDS-prøvebuffer (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% (vekt /volum) SDS, 50 mM ditiotreitol, 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4). Like mengder av de totale cellulære proteiner ble separert ved SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner (Biorad, Canada). Membranene ble inkubert i spesifikke primære antistoffer over natten ved 4 °
C etterfulgt av de passende sekundære antistoffer ved værelsestemperatur (tabell 1). Membraner ble skannet med en Odyssey CLX infrarød imaging system.
immunfluorescens
Sammenflytende cellekulturer ble etablert på dekkglass og skylles med kaldt PBS som inneholder 1 mM hver av NaF, Na
3VO
4 og CaCl
2. Celler ble fiksert med 3,7% formaldehyd i 20 minutter og ekstrahert med CSK-buffer (50 mM NaCl, 300 mM sukrose, 10 mM PIPES pH 6,8, 3 mM MgCl
2, 0.5% Triton X-100, 1,2 mM PMSF, og ett mg /ml DNase og RNase; [17]) i 10 minutter. Dekkglass ble blokkert med 4,0% geiteserum og 50 mM NH
4Cl
4 i PBS inneholdende 0,2% BSA i 1 time. Objektglassene ble så inkubert i de spesifikke primære antistoffer i 1 time etterfulgt av sekundære antistoffer i 30 minutter ved konsentrasjoner angitt i tabell 1. Kjerner ble motfarget med DAPI (1: 2000). Dekk ble montert i elvanol inneholder 0,2% (w /v) paraphenylene diamin (PPD) og vises ved hjelp av et 63x objektiv med en Zeiss konfokalmikroskop.
Immunpresipitasjon
Kulturer ble dyrket til konfluens i 100 mm retter og skylles med kaldt PBS som inneholder 1 mM NaF, Na
3VO
4 og CaCl
2. Celler ble ekstrahert i 1 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0.7μg /ml pepstatin, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM NaF, og proteasehemmer cocktail) i 20 minutter på en rocker ved 4 ° C. Cellene ble skrapet og sentrifugert ved 48000xg i 10 minutter. Supernatanter ble behandlet for immunoprecipitation med p53 og PG antistoffer (tabell 1) og 40 ul protein G agarose (Thermo Fisher Scientific, Canada) perler over natten på en rocker-rotator ved 4 ° C. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 14000xg i 2 min, ble kulene fjernet og supernatantene behandlet for en andre immunoprecipation i 3 timer. Perlene fra de to immunoutfellinger ble kombinert og vasket tre ganger med lyseringsbuffer. Immunkompleksene ble oppløst i 60 ul SDS prøvebuffer, separert ved SDS-PAGE og behandlet for immunoblot som beskrevet ovenfor.
vekst, migrering og invasjon assay
For in vitro-vekstanalyse, 3×10
4 celler fra ES-2, ES-2-E-CAD, ES-2-PG og ES-2-Shn-CAD-celler ble sådd ut i en 24-brønns plate. Ved 1, 3, 5 og 7 dager etter plettering, ble kulturene trypsinert og celler ble tellet. Hver gang punkt representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
For cellemigreringsanalyser, 2 x 10
5-celler ble resuspendert i 0,5 ml serumfritt medium og sådd ut i det øvre kammer av Transwell innsatser (3 um pore, 6,5 mm diameter, BD Biosciences, CA, USA). Normale medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer, og kulturene ble inkubert i 16 timer ved 37 ° C. Innskudd ble så overført til nye retter og skyllet med PBS for å fjerne un-festede celler. Inserts ble fiksert med 3,7% formaldehyd (i PBS) i 2 minutter, permeabiliserte med 100% metanol i 20 minutter og farget med Giemsa beis i 15 minutter ved romtemperatur. Etter farging ble membraner sett under et invertert mikroskop ved hjelp av et 20x objektiv linse og fotografert.
For Matrigel invasjons assays, ble cellene sultet i serumfritt medium i 24 timer før analysen. For hver cellelinje, 5 × 10
4 celler i 0,2 ml serumfritt medium ble belagt i topprommet på Matrigel-belagte invasjons kamre (8 mikrometer pore PETE membran; BD Biosciences). Fibroblast kondisjonert medium (0,8 ml) ble tilsatt til de nederste kamre, og platene ble inkubert over natten ved 37 ° C. Etter 16 timer ble membranene utvunnet og bearbeidet som beskrevet for migrering analysen. Montert membraner ble sett under et 20x objektiv av en invertert mikroskop og fotograferte.
De migrerte /invaderte celler ble talt i 5 tilfeldige felt for hver membran ved hjelp ImageJ Cell Counter program. Tallene for hver cellelinje ble midlet og normalisert til de av den normale cellelinje eller paren utransfekterte celler og histogrammer konstruert. Histogrammer representerer gjennomsnittet av minst 3 uavhengige analysene for hver cellelinje.
Statistisk analyse
Verdier er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble vurdert av Student t-tester.
P
-verdi. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Protein uttrykk for epitel og mesenchymale markører og p53 i ulike OVCA cellelinjer
Protein uttrykk for E-cadherin, N-cadherin, plakoglobin, cytokeratins, vimentin og p53 i IOSE, ES-2 og OV-90 celler ble oppdaget ved hjelp av immunoblot analyse (figur 1). IOSE celler hadde svært lite, om noen, E-cadherin og uttrykkes N-cadherin og PG. Disse cellene også uttrykt cytokeratins, vimentin og p53. Disse observasjonene var i samsvar med tidligere funn som viser at normale OSE celler vises både epitelceller og mesenchymale markører [36]. I kontrast, OV-90 celler som uttrykker mp53 [37] hadde ingen påviselig N-cadherin, lave nivåer av vimentin og høye nivåer av epiteliale markører inkludert E-cadherin, PG og cytokeratins. ES-2-celler som også uttrykker mp53 [38, 39], viste en mer mesenchymale fenotype, manglet E-cadherin og PG og uttrykkes N-cadherin, vimentin og meget lave nivåer av cytokeratins.
Totale cellelysater fra IOSE-364, ble ES-2 og OV-90 celler behandlet for immunoblot analyse ved hjelp av N-cadherin, E-cadherin, plakoglobin, vimentin, cytokeratins og p53 antistoffer. Like belastninger ble bekreftet ved å behandle de samme lysatene med Actin antistoffer.
Nivåer og lokalisering av E-cadherin, N-cadherin og plakoglobin i normale og carcinoma eggstokkcellelinjer
subcellulære fordeling og potensialet samlokalisering av E- /N-cadherin med PG ble undersøkt ved å dobbelt immunfluorescens farging (fig 2). I IOSE celler, i samsvar med immunoavtrykket resultater, E-cadherin nivåer var upåviselig mens N-cadherin og PG ble uttrykt ved høye nivåer, og ble co-utleveres i membranen (figur 2, IOSE). I OV-90-celler, høye nivåer av E-cadherin og PG var tilstede og ble colocalized på membranen. Vi har oppdaget også knapt distribuert små flekker av N-cadherin positive celler i OV-90 kulturer. I disse lappene, ble N-cadherin colocalized med PG (figur 2, OV-90). I ES-2-celler, var det ingen påvisbar E-cadherin eller PG, mens de uttrykte høye nivåer av N-cadherin, som ble fordelt i cytoplasma (fig 2, ES-2). Konsistente med fravær av PG og lim veikryss, ES-2 celler viste signifikant mindre celle-til-celle kontakt og deres morfologi var tydelig annerledes enn IOSE og OV-90 celler.
IOSE-364, ES-2 og OV-90 celler ble dyrket på Dekk og behandlet for dobbel immunfluorescens farging. E-cadherin (E-cad, rød) eller N-cadherin (N-cad, rød) og plakoglobin (PG, grønn) antistoffer ble brukt ved konsentrasjoner som er angitt i tabell 1. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Bar, 25 mikrometer.
Fraværet av E-cadherin og PG uttrykk og tilstedeværelse av N-cadherin bidra til trekkende og invasive egenskapene til ES-2 celler
Tidligere vi har vist at ekspresjonen av PG i PG-manglende carcinoma celler som mangler E-cadherin og uttrykke N-cadherin reduserer deres
in vitro
vekst, migrering og invasjon [33, 34]. For å undersøke om PG hadde lignende effekter i OVCA celler, må vi først undersøkte migrasjons- og invasjonsegenskapene til IOSE, OV-90 og ES-2 celler. Så, vi eksogent uttrykt E-cadherin eller PG eller slått ned N-cadherin i disse cellene og vurderes endringer i deres vekst, migrasjon og invasjon. Som vist i figur 3A, OV-90-celler viste signifikant lavere migrering og invasjon i forhold til IOSE celler (8,4% og 0,4% henholdsvis). I motsetning ES-2-celler var betydelig mer trekkfugl og invasive sammenligne IOSE celler (138% og 196,4%, henholdsvis).
(A) Migration (Venstre) og invasjon (Høyre) fra IOSE-364, OV -90, ES-2 celler. Kulturer ble behandlet for in vitro migrasjon og invasjon analyser som beskrevet i materialer og metoder. Antallet migrerte /invaderte celler ble normalisert til de av IOSE-364-celler. (B) Uttrykk for E-cadherin, N-cadherin og plakoglobin i ES-2 transfektanter uttrykker E-cadherin (ES-2-E-cad) eller plakoglobin (ES-2-PG) eller N-cadherin shRNAs (ES-2 -shN-cad). Stabile transfektanter ble behandlet for immunblotting ved hjelp av E-cadherin, plakoglobin og N-cadherin antistoffer. For å bekrefte like ladninger, ble de samme cellelysatene behandlet med aktin antistoffer. (C) subcellular distribusjon og colocalization av E-cadherin, N-cadherin og plakoglobin i ES-2- E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad transfektanter. Stabile transfektanter ble etablert på dekkglass og behandlet for dobbel immunfluorescens med E-cadherin (E-cad, rød) eller N-cadherin (N-cad, rød) og plakoglobin (PG, grønne) antistoffer. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Bar, 25 mikrometer.
Eksogene uttrykk for E-cadherin og PG og stabil knockdown av N-cadherin i ES-2 transfektanter ble bekreftet ved hjelp av immunoblot (Fig 3B) og immunfluorescens analyser (Fig 3C). I ES-2-E-CAD-celler (figur 3B og 3C, ES-2-ECAD), ble E-cadherin uttrykt og hovedsakelig lokalisert på membranen, selv om det ble også påvist i cytoplasmaet av transfektanter. Interessant, PG-ekspresjon i ES-2-PG-celler (figur 3B og 3C, ES2-PG) førte til oppregulering av endogent E-cadherin. I disse cellene uttrykte eksogent PG colocalized med både N-cadherin og E-cadherin (Fig 3B og 3C, ES2-PG). N-cadherin knockdown reduserte nivåer av endogent N-cadherin ( 90%). Farging av disse kulturer med N-cadherin antistoffer påvises tilfeldige celler som var knapt farget (figur 3B og 3C, ES2-SHN-CAD).
Vurdering av migrering og invasjon av ES-2-transfektantene viste en signifikant reduksjon i både migrering og invasjon av ES-2-ECAD og ES-2-PG-celler i forhold til foreldre ES-2-celler (figur 4A, 4B og 4D). E-cadherin ekspresjon i ES-2-celler redusert migrering og invasjon av disse cellene med 39% og 42%, respektivt. PG uttrykk i ES-2 celler redusert migrasjon og invasjon av 58% og 44%, henholdsvis. Effekten av N-cadherin knockdown på migreringen var lik den i PG uttrykk, dvs. en reduksjon på 65%, mens den invasjonen av ES-2-Shn-cad cellene var betydelig mindre enn for ES-2-E-cad og ES -2-PG celler (68% reduksjon) (figur 4A, 4B og 4D).
IOSE-364, OV-90, ES-2 og ES-2 transfektanter (ES-2-E-cad, ES-2-PG, ES-2-Shn-CAD) ble behandlet for migrasjon (A) og (B) invasjons assays som beskrevet i Materialer og Metoder. Antallet migrerte /invaderte celler ble normalisert til de av IOSE-364-celler. (C) Repliker kulturer av ES-2 celler og ES-2 transfektanter (E-cad, PG og SHN-cad) ble sådd ut i én celle (3×10
4) tetthet. Kulturer ble tellet på dag 1, 3, 5 og 7. Hver gang punkt er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. (D) Oppsummering av endringer i vekst, migrasjon og invasjon av ES-2 transfektanter. Transfektanter verdier ble normalisert til ES-2-celler.
p
verdier, * 0,05, ** 0,001.
Vi har også sammenlignet vekst av ES-2 celler med de av ES-2-E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad transfektanter (fig 4C og 4D). På dag 7 ES-2-E-cad celler viste lik vekstraten til ES-2 celler mens ES-2-PG og ES-2-SHN-cad celler viste betydelig lavere vekst enn ES-2 celler (21% og 25 % reduksjon, respektivt, (figur 4C og 4D). Men mens ES-2-Shn-cad celler viste redusert vekst i løpet av 7 dager, ES-2-PG kulturer viste redusert celleantall etter dag 5, sannsynligvis på grunn av induksjon kontakt hemming på kultur konfluens (fig 4C).
samlet utgjør disse resultatene antydet at uttrykket av E-cadherin eller PG eller knockdown av N-cadherin effektivt redusert migrasjon og invasjon av ES-2 celler. Men bare PG uttrykk eller N-cadherin knockdown betydelig redusert veksten av disse cellene.
Samspill plakoglobin og p53 i normale og eggstokkkreft cellelinjer
Vi har vist at PG samhandlet med både WT og mp53 i forskjellige carcinom cellelinjer og de begge er knyttet til promotorer for en rekke av p53 målgener [17, 18, 40]. PG interaksjon med mp53 uttrykk carcinoma celler førte til redusert vekst, migrering og invasjon av disse cellene. For å oppnå dette, undersøkte vi hvorvidt PG assosiert med p53 i OVCA celler. Totalt celleekstrakt fra IOSE, ES-2 og ES-2-PG-celler ble behandlet for gjensidig coimmunoprecipitation (ko-IP) og immunblotting med PG og p53-antistoff (tabell 1). I IOSE celler PG antistoffer samutfelt p53 og PG (fig 5). Den gjensidige co-IP ved hjelp av p53 antistoffer samutfelt PG, ytterligere validering samspillet mellom PG og p53 i disse cellene. I ES-2 celler som uttrykker eksogent PG og endogene mp53, PG antistoffer samutfelt p53 og PG. I gjensidig co-IP av ES-2-PG celler, p53 antistoffer brakt ned både PG og p53 (fig 5). I motsetning til dette, i ES-2-celler uten noen PG uttrykk, p53-antistoffer utfelt p53 bare (figur 5). Kontroll immunoutfellinger med p53 og PG preimmunt antistoffer ikke oppdage enten protein i de totale cellelysatene (Fig 5B).
Like mengder total celleekstrakter (TCE) fra IOSE-364, ES-2 og ES-2 -PG-celler ble behandlet for gjensidig og sekvensiell immunutfelling (IP) og immunoblotting (IB) ved anvendelse av p53 og plakoglobin antistoff (A) eller preimmunt antistoff (B) som beskrevet i Materialer og Metoder. De samme Lysatene ble behandlet med aktin antistoffer for å bekrefte like belastninger. PG, plakoglobin; Pi, pre-immune.
Diskusjoner
I denne studien, for første gang, undersøkte vi
in vitro
tumor /metastase suppressor effekter av PG i EOC cellelinjer med mp53 uttrykk og forskjellige cadherin profiler. Vi viste at ES-2-celler som uttrykker N-cadherin og er mangelfull i E-cadherin og PG var svært trekkfugl og invasiv. I kontrast, OV-90 celler som uttrykker både E-cadherin og PG og svært lite N-cadherin var ikke trekkfugl eller invasiv. Den eksogene ekspresjon av PG eller E-cadherin eller knockdown av N-cadherin i ES-2-cellene betydelig redusert deres migrering og invasjon. Våre data viste at PG colocalized med både E-cadherin og N-cadherin i vedheft komplekser. I samsvar med disse observasjonene, vi har oppdaget betydelig reduksjon i ES-2-PG og ES-2-SHN-cad vekst i forhold til ES-2 og ES-2-E-cad celler. Videre PG samhandlet med WT p53 i IOSE celler og mp53 i ES-2-PG transfektanter.
cadherin bytter fra E- og N-cadherin er et kritisk punkt i epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) -mediert maligniteter [41, 42]. EMT fører til celle-celle krysset demontering, tap av celle polaritet og gevinst på trekkende og invasive egenskaper [30, 43, 44]. Mens E-cadherin er en epitelial markør og en kjent tumor suppressor, er N-cadherin en mesenchymale markør og dens ekspresjon er assosiert med et mer trekkende og invasive fenotype [44, 45]. Normale eggstokkene overflaten epithelial (OSE) celler uttrykker en kombinasjon av epitel og mesenchymale markører. Disse cellene har ikke E-cadherin men uttrykke N-cadherin, catenins, vimentin og cytokeratins [36, 46-50]. Etter avtale med disse rapportene, IOSE cellene uttrykte N-cadherin og vimentin samt catenins inkludert PG, og cytokeratins. Den nøyaktige rollen til E- /N-cadherin bryter i initiering og progresjon av ovariekarsinomer er ikke helt klart, siden begge cadherins kan uttrykkes i eggstokk tumorer av forskjellig opprinnelse, og på forskjellige stadier [51, 52]. Men mens noen studier tyder på at E-cadherin er oppregulert i OVCA effusjon [52, 53], det store flertallet foreslår at tap eller reduserte nivåer av E-cadherin bidra til overgangen fra godartet til Borderline eggstokkreft lesjoner, til dårlig differensiert ovarietumorer, og til den lokale invasjon og metastasering [28, 47, 54-58]. I samsvar med tumor suppressor aktiviteter E-cadherin, nedregulering /mangel på E-cadherin uttrykk på grunn av de høye nivåene av sine transkripsjons repressors sneglen, Twist og ZEB-2 har blitt knyttet til trekkende og invasive egenskapene til ES-2 og andre OVCA celler [59-71]. I tillegg undertrykker E-cadherin og metastasevekst via inhibering av reseptor-tyrosin-kinase signalering og PI3K /akt trasé [72, 73]. I overensstemmelse med disse studiene viste vi at ES-2-E-cad celler hadde signifikant lavere migrering og invasjon (39% og 42%) sammenlignet med ES-2-celler.
Selv om N-cadherin er uttrykt i normal OSE, er dens uttrykk vanligvis forbundet med økt migrasjon og invasjon av OVCA [74-76]. N-cadherin nivåer har vist seg å være forhøyet i cellelinjer som uttrykker sneglen og ZEB-1, så vel som, i pasienter med høyere FIGO tumor karakter og metastase [51, 64, 77]. Eksogent ekspresjon av MUC4 i SKOV3-celler førte til nedregulering av E-cadherin, oppregulering av N-cadherin og økt motilitet. N-cadherin knockdown i disse cellene redusert MUC4 indusert motilitet, samtidig med redusert aktivitet i ERK1 /2, AKT og MMP9 [78]. Støtte disse studiene, en selektiv anti-N-cadherin antistoff (Exherin, ADH-1) ble nylig vist å være effektiv i å stabilisere progresjon av sykdommen i to OVCA pasienter i en liten fase I kliniske studier, som vurderte pasienter med ulike faste tumorer [79 ]. Her viste vi at i forhold til ES-2 celler, migrasjon og invasjon av ES-2-SHN-cad transfektanter ble redusert med 65% og 68%, henholdsvis. Videre slå ned N-cadherin var mye mer effektive i å redusere migrasjon og invasjon enn å uttrykke E-cadherin i ES-2 celler. Tilsvarende, mens E-cadherin ekspresjon hadde meget liten effekt (5%) i avtagende vekst, PG ekspresjon eller N-cadherin knockdown betydelig redusert ES-2-celler vekst (20%, 25%, henholdsvis).
I motsetning cadherins, svært lite er kjent om rollen til PG i OVCA. PG har vist seg å ha vekst /metastase-inhiberende funksjon, både
in vitro
og
in vivo product: [19]. Denne funksjonen av PG kan formidles ved å stabilisere /avsette N-cadherin og induksjon av kontakt hemming av vekst og /eller i samspill med ulike cellulære proteiner inkludert transkripsjonsfaktorer [17-19, 27,34,40,80-82]. Her er den eksogene ekspresjon av PG betydelig redusert migrering og invasjon av ES-2-celler (58% og 44% henholdsvis). Effekten av PG på å inhibere migreringen var signifikant høyere enn den av E-cadherin. Siden PG ekspresjon er nødvendig for dannelsen av både adherens kryss og desmosomer [19,33], kan dette tyde på at PG redusert migrering via krets med N-cadherin og dannelse av veikryss, så vel som interaksjonen med transkripsjonsfaktorer og regulering av genekspresjon. Interaksjon av PG med flere transkripsjonsfaktorer som TCF /LSF, CBP, SOX4 og p53 er blitt rapportert tidligere [17, 22-26, 81]. Vi har vist at PG samhandlet med mp53 i flere carcinoma cellelinjer, og de begge assosiert med arrangører av en rekke p53 målgener inkludert tumor suppressors
SFN plakater (14-3-3s) og
NME1
og onkogene genomet arrangøren
SATB1
. Videre disse foreningene var sammenfallende med redusert vekst, migrasjon og invasjon [17,18]. PG også regulert ekspresjon av HAI-1 og nedsatt migrasjon i en p53 avhengig måte i NSCLC-celler [27]. Her viste vi at PG samhandlet med WT p53 i IOSE celler og med mp53 i ES-2-PG celler. p53 regulerer uttrykket av EMT markører som Twist, Snail og Slug [82-86]. Vi oppdaget lave nivåer av E-cadherin i ES-2-PG celler ved PG uttrykk. Hvorvidt dette E-cadherin uttrykk skyldes nedregulering av E-cadherin transkripsjons repressors via PG-p53 interaksjon eller stabilisering av E-cadherin protein via sin interaksjon med PG garanterer videre studier.
Oppsummert er dette første demonstrasjon av rollen til PG i OVCA celler. Våre data viser at ekspresjon av eksogene PG eller knockdown av N-cadherin var mer effektiv enn ekspresjon av E-cadherin i inhibering av veksten, trekkende og invasive egenskaper av ES-2-celler. Disse resultatene tyder på at PG ekspresjon sekvestrert tumor /metastase fremmende aktiviteter av N-cadherin. Induksjon av E-cadherin ekspresjon i ES-2-celler som uttrykker eksogent PG, som interaksjon med endogent mp53, øker muligheten for at PG også kan være involvert i regulering av p53 målgener som er involvert i migrering og invasjon. Samlet tyder resultatene på at PG kan fungere som en svulst /metastase suppressor i OVCA, som har vist seg for andre kreftformer. Jo større implikasjon av våre studier er potensialet for PG som en terapeutisk mål for de fleste av OVCAs med mp53 og N-cadherin uttrykk.
Takk
Vi takker den kanadiske eggstokkvev Bank på BC Cancer Agency for å gi IOSE-364 celler. Vårt arbeid er støttet av den kanadiske Breast Cancer Foundation Prairies /NWT kapittel (MP) og ved Alberta Cancer Foundation Graduate Scholarship (MA). GD ble støttet av en sommer student fra kvinner og barns helse Research Institute (WCHRI).
