Abstract
Bruk av små antimikrobielle peptider eller bakteriociner, som nisin, til å behandle kreft er en ny tilnærming som har store løftet. Nisin eksemplifiserer denne nye tilnærmingen fordi det har blitt brukt trygt hos mennesker i mange år som mat konserveringsmiddel, og senere laboratoriestudier støtter sin anti-tumor potensial i hode- og halskreft. Tidligere viste vi at nisin (2,5%, lavt innhold) har antitumor potensial i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC)
in vitro Hotell og
in vivo
. De nåværende studier utforsket en naturlig forekommende variant av nisin (nisin ZP 95%, høyt innhold) for sine antitumor effekter
in vitro Hotell og
in vivo
. Nisin ZP indusert størst grad av apoptose i HNSCC celler sammenlignet med lavt innhold nisin. HNSCC-celler behandlet med økende konsentrasjoner av nisin ZP oppviste økende nivåer av apoptose og reduserer nivåene av celleproliferasjon, klonogene kapasitet, og sfære formasjonen. Nisin ZP apoptose gjennom en calpain-avhengige reaksjonsveien på HNSCC-celler, men ikke i humane orale keratinocytter. Nisin ZP også indusert apoptose doseavhengig i humane navlevene endotelceller (HUVEC) med samtidige nedgang i vaskulær spire formasjon
in vitro Hotell og redusert intratumoral microvessel tetthet
in vivo
. Nisin ZP redusert tumorigenesis
in vivo Hotell og langtidsbehandling med nisin ZP forlenget overlevelse. I tillegg Nisin behandlede mus viste normal histologi organ uten tegn til inflammasjon, fibrose og nekrose. Oppsummert Nisin ZP utstillinger større antitumor effekt enn lavt innhold nisin, og dermed har potensial til å tjene som en roman terapeutisk for HNSCC
Citation. Kamarajan P, Hayami T, Matte B, Liu Y, Danciu T , Ramamoorthy A, et al. (2015) Nisin ZP, en bakteriosin og mat konserveringsmiddel, hemmer Head and Neck Cancer tumorigenesis og forlenger overlevelse. PLoS ONE 10 (7): e0131008. doi: 10,1371 /journal.pone.0131008
Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, UNITED STATES
mottatt: 10 februar 2015; Godkjent: 26 mai 2015; Publisert: 01.07.2015
Copyright: © 2015 Kamarajan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelig i papir og dens saksdokumenter fil
Finansiering:. Denne studien ble støttet av University of Michigan mCubed Funding # U036798 til YK, FPW, og AR. BM ble støttet av den brasilianske kapper og CNPq sponset, Science Uten Grenser Program. YL ble støttet av Scholars Program fra Peking University School og Sykehuset Tannbehandling
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Head and hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette største dødsårsaken i verden. Pasienter diagnostisert med HNSCC behandles med kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Gitt sin anatomiske beliggenhet, er HNSCC kirurgisk reseksjon ofte ødeleggende, og ofte er fullstendig fjerning av svulsten massen ikke et levedyktig alternativ, ofte gjengi disse pasientene med uhelbredelig sykdom etter behandling med kjemoradioterapi [1]. Det er begrenset kjemoterapeutiske alternativer for pasienter når deres sykdom er ikke lenger mottakelig for å kurere, og de lave 5-års overlevelse for pasienter med metastatisk HNSCC har ikke bedret seg i flere tiår [2,3]. Disse fakta understreke at det haster med å bedre behandlingstilbud for disse pasientene.
Noen rapporter har antydet at antimikrobielle peptider eller bakteriosinene har cytotoksiske virkninger mot kreftceller [4-8]. Gitt dette interessant premiss, vi utforsket de cytotoksiske og antitumor egenskaper av antimikrobielle peptid, nisin, og fant ut at den blokkerer HNSCC tumorigenesis [9]. Nisin er et 34-aminosyre polycyklisk antibakterielle peptid som fremstilles ved fermentering av den gram-positive bakterie
Lactococcus lactis
. Mange antibakterielle midler er effektive mot lignende bakteriearter; har imidlertid nisin bredspektret virkning, som det også hemmer gram-negative bakterier [10]. Nisin er ikke giftig for dyr og er trygt for konsum [11]. Nisin ble godkjent for bruk på mennesker som mat konserveringsmiddel av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 1969 og av Food and Drug Administration (FDA) i 1988, og det har fått en generelt ansett-as-safe (GRAS) betegnelse av FDA [12]. Det er anslått at 0,94 til 2,24 mg nisin er konsumert per person per dag i USA [12]. Mens bakteriociner, som nisin, har vært brukt i flere tiår for å hindre bakterievekst i næringsmidler, har de bare nylig blitt testet for forebyggelse av vekst og induksjon av apoptose av kreftceller. Apoptose eller programmert celledød er en naturlig prosess som eliminerer uønskede eller eldre celler. Imidlertid kreftceller er resistente mot apoptose. Dermed er det stor innsats for å forstå mekanismene som regulerer apoptose i disse cellene, slik at nye midler kan utvikles til å indusere apoptose av kreftceller. Nisin kan tjene i denne stillingen og utvikling av nisin som et cancer terapeutisk lett kan gjennomføres følgende doseringsforholdet.
Nylig har rapportert at nisin, kan tjene som et nytt terapeutisk potensiale for behandling av HNSCC [9]. Nisin medierer disse effektene ved å fremkalle fortrinnsrett apoptose, cellesyklus arrest, og redusere celleproliferasjon i HNSCC celler, sammenlignet med primær keratinocytter. Nisin reduserer også HNSCC tumorgenese in vivo. Mekanistisk utøver nisin disse effektene på HNSCC, delvis gjennom kation transport regulator homolog 1 (CHAC1), en proapoptotiske kation transport regulator og gjennom en samtidig CHAC1-uavhengig innstrømning av ekstracellulært kalsium [9,13]. Disse funnene støtter bruk av nisin som et potensielt roman terapeutisk for HNSCC, og siden nisin er trygt for menneskelig forbruk som mat konserveringsmiddel, sin oversettelse til en klinisk setting kan gjøres lettere.
Nisin fungerer ved å endre integriteten av den cellulære membranen og danner kortvarige porene, og dermed endre membranpotensialet [14]. Nisin blir nedsenket i cellemembranen gjennom de kationiske partier av aminosyrene som strekker seg til en side av molekylet. Disse kationiske partier interagere med de negativt ladet fosfolipid hoder, mens den hydrofobe del av nisin samvirker med membranen kjerne [15]. Nisin engasjement med membranen, derfor formidler fosfolipid omorganisering og tillater en strøm av ioner [14,16]. Siden HNSCC-celler og primære keratinocyter forskjellig i deres lipid membran sammensetning og funksjon og respons på kalsium flukser, nisin evne til å endre den transmembrane potensial og membran preparat av celler kan føre til differensial effekter på disse celler [17-22]. Ja, våre data støtter denne forutsetningen som ligger til grunn for nisin-mediert differensial apoptotisk celledød og redusert spredning av HNSCC celler sammenlignet med primære keratinocytter [9].
Gitt nisin rolle som en trygg bakteriosin for konservering av mat, og vissheten om at andre bakteriociner har proapoptotiske egenskaper mot kreftceller, våre funn om effekten av nisin på HNSCC tumorigenesis bidra til å gi et grunnlag for nisin som en potensiell ny terapeutisk for HNSCC. Dermed vårt fokus i denne studien var å utvide denne baseline kunnskap. Tidligere ble det benyttet en 2,5% nisin (lavt innhold) formulering. I denne studien, vårt mål var å teste effekten av en 95% nisin (høyt innhold) på HNSCC celle apoptose og proliferasjon in vitro og på tumorigenesis in vivo. Spesielt har vi fokusert på sin translasjonsforskning potensial ved å undersøke en svært ren, mat klasse form av nisin for sin in vivo og langsiktige effekter. For å oppnå dette, testet vi to naturlig forekommende, høye Nisin innholdsvarianter, nisin ZP og nisin AP. Vurderer nisin sikkerhet for konsum, og gitt sin in vitro og in vivo effekt i HNSCC, kunne nisin bli utviklet som en roman kreft terapeutisk for HNSCC.
Materialer og metoder
Institutional Review Board Godkjenning
Denne studien er godkjent av og ble gjennomført i samsvar med regelverket som er satt for av Institutional Review board og komiteen om bruk og stell av dyr ved University of Michigan.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
Fire menneske HNSCC cellelinjer ble brukt for disse studiene. HNSCC cellelinje autentisering og opprinnelse ble gitt av deres kilder og publisert mye. De menneskelige HNSCC cellelinjer, UM-SCC-17B (supraglottis /soft tissue-hals) og UM-SCC-14A (munngulvet) ble gitt av Dr. Thomas Carey (Professor, University of Michigan, MI) [23]. Den muntlige SCC cellelinje HSC-3 (tungen) ble gitt av Dr. Randall Kramer (Professor, University of California, San Francisco, California) [24]. Den muntlige SCC cellelinje, OSCC-3 (tungen) ble gitt av Dr. Mark Lingen (Professor, University of Chicago). HNSCC-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin og streptomycin 1%. Normal-human navlevene endotelceller (HUVECs), og tilhørende cellekulturmedier og kosttilskudd (EGM-2 Bullet Kits) ble hentet fra Lonza (Allendale, NJ). Humant rekombinant VEGF165 ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og Matrigel Matrix ble oppnådd fra BD Biosciences (San Jose, CA). HUVECs ble dyrket i EGM-2 basale medier ved 37 ° C i 5% CO
2.
Nisin
Nisin A og nisin Z er to naturlig forekommende varianter av nisin som er produsert ved fermentering av
Lactococcus lactis
og de skiller seg ved en enkel aminosyrerest i posisjon 27; histidin i nisin A og asparagin i nisin Z [25]. Høye innhold former av disse to variantene, nisin ZP og nisin AP (95% innhold /ultrarent, vekt% /vekt, vannholdig potens ≥38,000 IE /mg) ble kjøpt fra Handary (Brussel, Belgia) og lavt innhold nisin A (2,5% innholdet i balanse natriumklorid og denaturerte melkefaststoffer; potens ≥1,000,000 pr IU /g) ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (N5764). Nisin ZP og AP og lavt innhold nisin ble rekonstituert i vann og brukes for alle forsøk.
Cell Proliferation og kolonidannelse Analyser
For å bestemme effekten av nisin på celleproliferasjon, den CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Kit ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, New York). For kolonidannelse assays, ble 2000-celler utsådd på en 6-brønns plate. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av nisin ZP i 48 timer. Etter behandling, ble friskt medium tilsatt hver 2 dager i en periode på 10 dager. Kolonier ble deretter farget med 0,5% krystallfiolett og kolonier som inneholdt 50 celler ble talt opp. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Orasphere analysen
Sphere analyser ble brukt for å vurdere forankringsuavhengig vekst, en eiendom antas å bidra til metastatisk potensial. HNSCC oraspheres (UM-SCC-17B) ble fremstilt som tidligere rapportert [26-29]. I korte trekk, celler som overlever forankrings tilbaketrekking skjema flercellede aggregater eller oraspheres. Oraspheres ble utviklet ved å opprettholde celler under opphengningsforhold på poly (2-hydroksyetylmetakrylat) (poly-HEMA) belagte plater (7,5 mg /ml i 95% etanol, Sigma-Aldrich) i 36 timer. En orasphere er definert som en samling av celler som er minst 50 pm i diameter. Det totale arealet som opptas av oraspheres i hver brønn ble kvantifisert for hver behandling tilstand ved hjelp av NIS-Elements BR4.13.04 bildebehandlingsprogrammer. Forsøk ble utført in triplo. Nisin ble tilsatt til hver brønn på tidspunktet for celle platekledning.
apoptose Analyser
For å fastslå effekten av tre ulike former for nisin på HNSCC celle apoptose tre ulike analysene ble utført. Apoptose ble vurdert i Nisin behandlet celler ved hjelp av en direkte fargemetode, en flowcytometri-baserte analysen, og en western blotting metode for å evaluere kjente apoptotiske signalnettverk proteiner
apoptose. Farging og Mikros
Ethidium bromid og akridinorange (EB /AO) farging ble anvendt for å måle apoptose som tidligere beskrevet [30]. For disse analysene ble celler sådd ut i 96-brønners plater ved 2 x 10
4 celler /cm
2, og etter 24 timer, behandlet med forskjellige konsentrasjoner av nisin (0, 100, 200, 400 og 800 ug /mL) i 24 timer. Cellene ble deretter farget med en EB /AO flekk. EB ble hentet fra Bio-Rad (Berkeley, California) og AO ble hentet fra Acros Organics (Geel, Belgia). EB /AO fargereagens besto av 100 ug /ml etidiumbromid og 100 ug /ml av akridinoransje i PBS. EB /AO fargestoff ble tilsatt til hver brønn, fjernes, og deretter bilder av fargede celler ble tatt med et mikroskop utstyrt med et digitalt bildebehandlingssystem (Eclipse 50i Nikon, Melville, New York). Celler ble talt, og basert på deres farge, ble klassifisert som enten vital, apoptotiske eller nekrotiske. AO syrer alle cellene og gjør kjerner opptrer grønn. EB er bare tatt opp av cellene når cytoplasmamembranen integritet er tapt, og det flekker kjerner slik at de vises rødt. Dermed tidlig apoptotiske celler vises grønn med lyse grønne prikker i kjernen på grunn av kromatin kondens og atom fragmentering. Late apoptotiske celler være oransje (kombinasjon av grønne og røde farger) med mer betydelig kromatin kondens og atom fragmentering. Nekrotiske celler være oransje men deres kjernemorfologi ligner den av levedyktige celler, og dermed er det et fravær av kromatin kondens. Prosentandelen av celler i hver kategori ble bestemt ved å telle minst 100 celler. Forsøk ble utført in triplo
Apoptosis:. Strømningscytometri
Prosentdelen av apoptotiske celler indusert av nisin behandling ble bestemt ved flow-cytometri. I korthet ble cellene løsnet ved inkubasjon med enzymfritt dissosiasjon buffer (Invitrogen), pelletert ved sentrifugering, og farget med Annexin V (BD Pharmingen) for analyse ved flowcytometri (FACSDiVa Cell sorter, Becton Dickinson).
apoptose: Western blotting
for å evaluere effekten av nisin ZP på uttrykk for pro-apoptotiske proteiner i HNSCC celler, utførte vi Western blot analyser av UM-SCC-17B celler som ble behandlet med nisin ZP i 18 timer . En calpain-inhibitor ble også undersøkt i denne sammenheng for sin evne til å reversere den apoptotiske effekt som induseres av nisin ZP; nemlig å blokkere PARP cleavage. Den calpain-inhibitor ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (A6185, St. Louis, MO), rekonstituert i vann, og anvendt ved en konsentrasjon på 500 nM. Etter forskjellige behandlinger, ble cellene samlet opp, vasket en gang med fosfat-bufret saltvann og lysert i 30 minutter mens på is i radioimmunoprecipitatation assay (RIPA) buffer (R0278, Sigma-Aldrich) som inneholdt en 1% protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma- Aldrich). Lysater ble justert for proteinkonsentrasjon ved BCA proteinanalysesett (Bio-Rad, Berkeley, CA). Protein lysater ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til Immobilon-P-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts). Western blot analyser ble utført ved hjelp av en anti-poly (ADP-ribose) polymerase-en (PARP, SC-7150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) primært antistoff, en caspase-3 primære antistoff (SC-7148, Santa Cruz Biotechnology), en kalpain primært antistoff (MAB3083, Millipore) etterfulgt av et pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-antistoff (SC-2004, Santa Cruz Biotechnology) eller anti-muse-antistoff (A9044, Sigma-Aldrich). Blottene ble deretter utviklet med ECL-plus deteksjonssystem (Pierce). For å evaluere prøvene for lik protein lasting, ble membraner strippet og reprobed med en anti-β-actin antistoff (SC-1615, Santa Cruz Biotechnology).
In Vitro Angiogenese Assay
For å finne ut virkningen av nisin ZP på angiogenese, vi utførte in vitro-analyser spire [31]. For spire analyser, ble HUVECs trypsinert og suspendert i endotelial cellevekstmedium (EGM-2) inneholdende 50 ng /ml rekombinant vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og forskjellige konsentrasjoner av nisin ZP (0, 100, 400 og 800 mikrogram /ml ). Celler ble sådd ut ved 1 x 10
4 celler /cm
2 i Matrigel belagte 96-brønners plater og inkubert over natten. Bilder av spirer ble tatt ved hjelp av EVOS XL Kjerne Imaging System (Life Technologies, Grand Island, NY), så total spire lengde ble målt ved hjelp av Image J (National Institutes of Health). Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Immunohistokjemiske Analyser
For å evaluere Nisin effekter på angiogenese in vivo, ble immunhistokjemiske analyser brukes til å vurdere CD31 uttrykk, en endotelceller adhesjonsmolekyl, i musetumor vevssnitt. I korthet, etter antigen gjenfinning av mikrobølge forbehandling (citrat-buffer, 10 mM, pH 6,0), ble inkubert med lysbilder en CD31 primært antistoff (DIA-310, Dianova, Hamburg, Tyskland) over natten ved 4 ° C. Etter diaminobenzidine kromogen (DAB) reaksjon, ble lysbilder kontra med rutine hematoksylin. Immunhistokjemisk farging for CD31 ble gradert og scoret av en patolog i en blindet måte.
Oral kreft musemodell
For å undersøke in vivo antitumor effekter av nisin ZP, en oral cancer gulv-of- munn musemodell ble anvendt. UM-SCC-17B-celler ble injisert submucosally ned i gulvet i munnen hos mus som tidligere beskrevet [9, 28, 29, 32]. Alle protokoller for in vivo studier ble godkjent av komiteen for bruk og stell av dyr ved University of Michigan. Nærmere bestemt, cellene ble dyrket til 70% konfluens, ble suspendert i DMEM, blandet med et likt volum av vekstfaktor-redusert Matrigel basalmembran matrise (BD Biosciences, San Jose, CA) ved en sluttkonsentrasjon på 1,25 x 10
4 /0,05 ml. Seks uker gamle atymiske nakne mus (NCR-nu /nu belastning, NCI, Frederick, MD) ble bedøvet ved intraperitoneal injeksjon med 100 mg /kg ketamin og 10 mg /kg xylazin. Et totalt volum på 0,05 ml av SCC-celle /Matrigel suspensjonen ble injisert submucosally inn i gulvet i munnen. Tre uker etter tumorcelle injeksjoner og ved bekreftelse på at svulster ble etablert, ble dyrene likt fordelt i seks grupper: en kontrollgruppe som fikk vann (tilsvarende volum /kontroll) ved oral sonde i 3 uker og fem forskjellige behandlingsgrupper som ble gitt nisin behandling av oral sonde i 3 uker. Etter tumorcelle injeksjoner, ble musene overvåket på alternative dager. Behandlingsgruppene besto av mus som mottok nisin ZP ved to forskjellige konsentrasjoner (400 og 800 mg /kg per dag), og mus som mottok nisin AP ved to forskjellige konsentrasjoner (400 og 800 mg /kg per dag). Det var også en annen gruppe av mus som ble gitt nisin ZP (800 mg /kg per dag) over en lengre periode (måneder). Etter fullføring av nisin administrering ble musene avlivet ved CO
2 overdose og cervikal dislokasjon, da tumorene ble høstet, vasket i fosfat-bufret saltvann (PBS), fotografert, og fiksert over natten i 10% bufret formalin. En digital caliper ble brukt til å bestemme tumorvolumet ved hjelp av formelen
en
x
en
x
b Twitter /2, der
en
er mindre dimensjon. Generelt ble musene avlivet hvis mus oppviste fysiologiske symptomer på stress fra manglende evne til å spise eller drikke, vekttap, eller når tumorvolum når en rekke 300-500mm
3, og således ble musene avlivet vanligvis ved omtrent 3 uker etter den kortsiktige protokollen. Musene ble avlivet av en CO
2 overdose.
Statistical Analysis
Generelt verdier ble uttrykt som betyr ± SD. Mellom grupper forskjeller ble analysert ved variansanalyse (ANOVA) og Tukey-Kramer HSD-test. For in vivo studier, ble uavhengige t-tester med ulik varians brukt.
Resultater
Nisin ZP og nisin AP indusere betydelig HNSCC celle apoptose doseavhengig og utover at lavt innhold nisin
behandling med både nisin ZP (95%) og nisin AP (95%) induserte signifikant økning i apoptose i HNSCC-celler (UM-SCC-17B og HSC-3) sammenlignet med behandling med lavt innhold nisin (2,5% ) (fig 1A og 1B). Apoptose ble målt ved hjelp av etidiumbromid og akridinorange (EB /AO) farging og mikroskopi. Virkningene av nisin ZP og AP på apoptose var doseavhengig og økt som konsentrasjonene av nisin ZP og AP øket 200-400 pg /ml. Selv om forskjellene i apoptose mellom nisin ZP og nisin AP ikke var signifikante, nisin ZP utstilt bedre oppløselighet, og dermed de fleste forsøkene ble utført med nisin ZP.
A og B
, grafer som viser endringer i andelen av apoptotiske HNSCC-celler (HSC-3 og UM-SCC-17B) som ble behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende 2,5% nisin, 95% nisin AP, eller 95% nisin ZP i 24 timer. Cellene ble deretter farget ved anvendelse av en etidiumbromid og akridinorange (EB /AO) flekk og telles. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05.
C
, mikroskopiske bilder som viser morphologhy av HNSCC-celler behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende nisin ZP (100 til 800 ug /ml) i 24 timer og deretter farget med EB /AO (Skala barer, 100 pm).
DF
, grafer som viser endringer i prosentandel av vitale, apoptotiske og nekrotiske celler (UM-SCC-17B, HSC-3 og normal muntlig keratinocytter) behandlet med kontroll media eller media som inneholder nisin ZP (400 eller 800 mikrogram /mL) i 24 timer. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05 vitale celler; # P. 0,05 apoptotiske celler
Videre, effekten av nisin ZP på HNSCC celle apoptose var betydelig gjennom et bredt spekter av doser fra 100, 200, 400 og 800 mikrogram /ml (Fig 1C- 1E) og i flere HNSCC cellelinjer (UM-SCC-17B og HSC-3). Koordinert,-celler ble behandlet med økende doser av nisin ZP oppviste betydelig redusere antallet vitale celler og betydelig økende antall apoptotiske celler, mens antall nekrotiske celler oppholdt seg relativt lav og konstant. I kontrast, gjorde primære keratinocytter ikke viser forbedrede nivåer av apoptose sånn sett i HNSCC cellelinjer (figur 1F).
Nisin ZP induserer apoptose via kalpain, caspase 8 og PARP cleavage
For ytterligere undersøke mekanismen for nisin-mediert apoptose, ansatt vi ytterligere apoptotiske analyser og kartlagt kjent apoptotiske signalproteiner. Fire forskjellige HNSCC cellelinjer ble undersøkt for sin nisin respons. Nisin betydelig økt apoptose i alle fire HNSCC cellelinjer som vurderes av annexin V farging og flowcytometri (Fig 2A).
En
, grafer som viser endringer i prosentandel av apoptotiske celler (UM-SCC -17B, HSC-3, UM-SCC-14A og OSCC-3) som var behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende nisin ZP (400 ug /ml) i 24 timer. Cellene ble deretter farget med Annexin V, og apoptose ble bestemt ved flow-cytometri. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05.
B
, immunoblotter viser kalpain 1, caspase-8, caspase-3, og PARP proteinnivåer i HNSCC (UM-SCC-17B) og
C
, normale menneskelige orale keratinocytter cellelysater etter behandling med nisin ZP i 18 timer.
D
, immunoblot som viser PARP og kalpain en aktivering i HNSCC cellelysater etter behandling i 18 timer med kontrollmedia, media inneholdende nisin ZP (400 ug /ml), media inneholdende en calpain-inhibitor (ALLN, 500 nM) eller media som inneholder både en calpain-inhibitor (ALLN, 500 nM) og nisin (400 ug /ml).
D
, An immunoblot for ß-aktin viser lastkontroller.
Gitt våre tidligere funn om at nisin formidler kalsiumavhengig apoptose, vi utforsket potensialet involvering av kalpain, en kjent kalsiumavhengig formidler av apoptose [9]. Faktisk Nisin behandlet HNSCC celler utstilt redusert uttrykk nivåer av kalpain en liten subenhet, indikerer kalpain en aktivering (figur 2B). Den avtagende uttrykk for kalpain en liten subenhet speilet økende doser av nisin ZP 100-400 mikrogram /ml, og dermed var doseavhengig.
For ytterligere å undersøke mekanismen for apoptose indusert av nisin ZP, caspase -8 og caspase-3 cleavage ble undersøkt i denne sammenheng. Nisin indusert caspase-8-aktivering på en doseavhengig måte (figur 2B). Men behandling av HNSCC celler med nisin ZP indusert caspase-3 uavhengige apoptose (figur 2B). Western blotting for caspase-3 i Nisin ZP behandlede celler viste stabile nivåer av caspase-3 ekspresjon og fravær av caspase-3 spalting uavhengig av nisin dose som ble testet (figur 2B).
Nisin ZP behandlede celler også oppviste poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage, et kjennetegn på apoptose (figur 2B). PARP cleavage økt doseavhengig som Nisin ZP doser økt. For å avgjøre om nisin-mediert PARP cleavage var en kalpain avhengig mekanisme, ble en kalpain inhibitor (ALLN) undersøkt i denne sammenheng (figur 2C). Behandling av HNSCC-celler med både nisin ZP og en calpain-inhibitor, effektivt redusert PARP spaltning, sammenlignet med celler behandlet med nisin alene. Normale humane keratinocytter orale ikke oppviser aktivering av kalpain, caspase-8, caspase-3 eller PARP i respons til behandling med nisin ZP (figur 2D). Dermed nisin ZP indusert apoptose av HNSCC celler via aktivering /spalting av kalpain, caspase-8 og PARP, men uavhengig av caspase-3 cleavage.
Nisin ZP og nisin AP redusere HNSCC celleproliferasjon tids- og dose -dependently
effektene av nisin ZP og AP på HNSCC celleproliferasjon ble undersøkt ved, og vi fant at behandling med både nisin ZP og nisin AP betydelig redusert HNSCC celle (UM-SCC-17B) spredning (fig 3A ). Virkningene av nisin ZP og AP på HNSCC celleproliferasjon var doseavhengig, ettersom spredningsnivået reduseres ettersom konsentrasjonen av nisin ZP og AP øket 400-800 ug /ml. I tillegg til forskjellene i HNSCC celleformering som induseres av nisin ZP versus nisin AP behandling var signifikante, slik at virkningene indusert av nisin ZP var mer uttalt. Dermed gitt større effekt av nisin ZP redusere spredning og gitt den forbedrede løseligheten av nisin ZP løpet nisin AP, ble nisin ZP valgt for videre studier. Effekten av nisin ZP på HNSCC celleproliferasjon var signifikante gjennom et bredt område av doser fra 100 til 800 ug /ml og i flere HNSCC cellelinjer (figur 3B). Også, nisin ZP-formidlet reduksjon i celleformering ble HNSCC tidsavhengig, og viser signifikante effekter på 6, 12, 24, og 48 timer (figur 3C). Den reduserte celleformering skyldes sannsynligvis delvis cellesyklus-stans mediert av nisin [9]; ytterligere dokumentert av redusert fosforylering av cellesyklus sjekkpunkt markør, cdc2 (S1 figur).
A
. Grafer som viser forandringer i cellevekst i UM-SCC-17B-celler behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende nisin AP eller ZP (400 eller 800 ug /ml) i 48 timer. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05. # Sammenligning mellom nisin AP og nisin ZP * p≤0.05.
B
. Grafer som viser forandringer i cellevekst i HNSCC-celler (UM-SCC-17B, HSC-3 og UM-SCC-14A) som ble behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende økende doser av nisin ZP (100 til 800 ug /ml) i 48 timer. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05. ¶Comparison mellom 100 pg /ml gruppe i forhold til kontrollgruppen for UM-SCC-17B-celler * pμ0.05.
C
. Grafer som viser endringer i celle-proliferasjon i UM-SCC-17B-celler behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende nisin ZP (400 ug /ml) i 6, 12, 24 og 48 timer. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05.
D
, Bildene er av UM-SCC-17B celler behandlet for 48t med kontroll media eller media som inneholder nisin ZP (400 eller 800 mikrogram /ml) deretter dyrket i 10 dager, farget med krystallfiolett og avbildes til evaluere klonogene kapasitet.
E
viser Grafen prosentandelen av koloniene til stede i forhold til kontroller for analyser som måler klonogene kapasitet. Sammenligninger mellom grupper i forhold til kontroller ble analysert ved hjelp av ANOVA med signifikansnivå satt til * p 0,05.
F
. Grafer som viser forandringer i cellevekst i normale humane orale keratinocytter som ble behandlet med kontrollmedier eller medier inneholdende nisin ZP (100, 200, 400 eller 800 ug /ml) i 48 timer. Sammenligninger mellom gruppene i forhold til kontrollene ble analysert ved ANOVA med signifikansnivå satt til * p. 0,05
Nisin ZP reduserer HNSCC celle kolonidannelse
Vi har utforsket effekten av videre nisin ZP på celleproliferasjon ved å måle de langsiktige effekter ved hjelp av kolonidannelse analyser. Etter avtale med de kortsiktige spredning analyser, behandling med nisin ZP hemmet kolonidannelse i HNSCC celler (fig 3D og 3E). De hemmende effekter på kolonidannelse var doseavhengig, ettersom kolonidannelse redusert betydelig som nisin ZP dosen økes 400-800 ug /ml. HNSCC-celler behandlet med disse to doser oppviste en 2 og 50 gangers nedgang i klonogene kapasitet. Nisin hemmet ikke spredning i normale menneskelige orale keratinocytter sånn i HNSCC celler (Fig 3F).
Nisin ZP blokker orasphere formasjon
Vi fant videre at behandling med nisin ZP betydelig blokkert orasphere dannelse eller forankringsuavhengig vekst (figur 4A og 4B). Orasphere formasjon eller forankringsuavhengig vekst er en egenskap som bidrar til karsinogent potensial. Nisin ZP effekter på orasphere formasjon var doseavhengig, slik at total orasphere området sank jevnt og trutt etter behandling med Nisin doser fra 100, 200, 400 og 800 mikrogram /ml.
En
, Phase kontrast og
B
, grafen viser prosentandelen av orasphere hemming (totalt areal) i HNSCC celler (UM-SCC-17B) dyrket under suspensjon forhold og behandlet med kontroll media eller media som inneholder nisin ZP (100 til 800 mikrogram /ml) i 36 timer. Sammenligninger mellom gruppene i forhold til kontrollene ble analysert ved ANOVA med signifikansnivå satt til * p. 0,05
Nisin ZP induserer endotelceller apoptose og hemmer angiogen spirende
Vi viste tidligere at behandling med lavt innhold nisin inhiberte tumorvekst og resulterte i små blek svulster, noe som tyder på at nisin påvirket tumorblodtilførsel. Vi har også tidligere rapportert at Nisin er antitumor effekter ble formidlet av CHAC1, en proapoptotiske indus i endotelceller [9].
